专利名称：无网格bac文库的建立方法及该无网格bac文库阳性克隆的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种简便基因文库的建立与筛选。
背景技术：
BAC(细菌人造染色体)克隆对于整个分子生物学的发展，特别是现代基因组学的发展作出了巨大的贡献。虽然，现在高通量测序技术降低了 BAC文库的利用率，但是BAC克隆对于基因克隆及基因资源的保存有着重要的作用。制取BAC克隆，一般放入96孔板或 384孔聚乙烯样品板中，但是所要的超低温(_80°C )储藏空间巨大；而且，利用BAC克隆筛选还要制作有关的三维筛选体系或转移至纤维素或尼龙杂交膜中，需一系列的筛选过程来获得阳性克隆。无网格(混合克隆品)基因文库已经展现出所需劳动力少，贮存所需的空间小，但从阳性克隆混合体中获取其所需个体较为复杂。虽然已有人进行过BAC文库的筛选，但是程序复杂，且操作规程不明确。目前的常规方法是将混合样品涂布平板后，待菌落生长后，转移到纤维素膜上，进行有关杂交，来鉴定相应的阳性克隆。由于DNA杂交技术程序复杂，花费时长，还存在假阳性等问题，特别是难以获得单个阳性克隆。
发明内容
本发明的是为了解决现有无网格BAC文库阳性克隆技术中DNA杂交技术程序复杂，花费时长，存在假阳性，而且难以获得单个阳性克隆的问题，而提供的一种无网格BAC 文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法。本发明无网格BAC文库按以下步骤建立一、BAC克隆载体的制备；二、大片段DNA的制备；三、连接及转化，然后选择含BAC克隆1000 3000个的培养皿，用LB液体培养基或SOB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均勻后都等分为2管，一组管为DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管，即实现无网格BAC文库的建立。按以下步骤筛选上述无网格BAC文库以获取阳性克隆一、用待筛选序列的特异性引物对BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性 pool所对应的无网格BAC文库管，并吸取200 μ L菌液，进行梯度稀释；二、将步骤一制备的梯度稀释液振荡培养；三、将步骤二振荡培养的菌液取出一部分进行离心，弃去上清液后用沉淀的菌体离心进行PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后，一次用牙签钝端挑取8 15个克隆放入96孔板或384孔板中振荡培养，取少量振荡培养物再次进行PCR反应，将阳性克隆pool 进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。本发明无网格BAC文库的建立方法简单易行，具有用时短，所需超低温储藏空间小的优点。本发明无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法巧妙地利用PCR体系，快速简易地获得阳性克隆，并且有效的排除了假阳性克隆的干扰。
图1是具体实施方式
六步骤四中PCR的部分凝胶电泳图，其中第1泳道和第18泳道标样为DNA对照样品，其余泳道标样为DNA提取筛选管样品。图2是具体实施方式
六步骤六中单个阳性克隆验证结果图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式无网格BAC文库按以下步骤建立一、BAC克隆载体的制备；二、大片段DNA的制备；三、连接及转化，然后选择含BAC克隆1000 3000个的培养皿，用LB液体培养基或SOB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均勻后都等分为2管，一组管为DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管，即实现无网格BAC文库的建立。本实施方式BAC克隆的悬浮液中的LB液体培养基或SOB液体培养基(含10%的甘油)可作为冷冻用媒介，将BAC克隆的悬浮液置于_80°C环境中储藏。BAC克隆载体的制备及大片段DNA的制备采用现有常规方法。本实施方式含有阳性克隆1000 3000个的培养皿数量为50 100皿。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤二中大片段 DNA片段的平均长度> 70Kb。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式按以下步骤筛选无网格BAC文库以获取阳性克隆一、用待筛选序列的特异性引物对BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性 pool所对应的无网格BAC文库管，并吸取200 μ L菌液，进行梯度稀释；二、将步骤一制备的梯度稀释液振荡培养；三、将步骤二振荡培养的菌液取出一部分进行离心，弃去上清液后用沉淀的菌体离心进行PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后，一次用牙签钝端挑取8 15个克隆放入96孔板或384孔板中振荡培养，取少量振荡培养物再次进行PCR反应，将阳性克隆pool 进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。本实施方式步骤三有效的提高了阳性克隆占总克隆的比率，从理论角度分析将阳性克隆占总克隆的比率提升至最高。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三的不同点是步骤二中振荡培养时间为10 12小时。其它步骤及参数与实施方式三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
三或四的不同点是步骤二中置于转速为200r/min、温度为37度环境中振荡培养。其它步骤及参数与实施方式三或四相同。
具体实施方式
六本实施方式用来筛选无网格大豆基因组BAC基因文库以获得阳性克隆一、BAC克隆载体的制备；二、大片段DNA的制备，片段DNA片段的长度为75Kb ；三、连接及转化，然后选择含BAC克隆2000 3000个的培养皿(其中白色的阳性克隆占总克隆的95%以上)，用5mL LB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均勻后都等分为2管，一组管为DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管；四、用待筛选序列的特异性引物 Sat_312 (GCGCCTCCCATTACTTCGGATTAGTTA/ GCGAACGCAACAAATAATCAAACATC)对大豆BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性 pool (图1中的第3、9、10、15、16和17泳道为阳性pool)所对应的无网格BAC文库管(本实施方式选取第9泳道所对应的无网格BAC文库管)，并吸取200 μ L菌液，进行梯度稀释；五、将步骤四制备的梯度稀释液振荡培养；六、将步骤五振荡培养的菌液取出一部分进行离心，弃去上清液后用沉淀的菌体进行PCR，选取滴度最大的原始菌液进行涂板，然后，一次用牙签钝端挑取约10个左右克隆放入96孔板中振荡培养，取少量振荡培养物再次进行PCR反应，将阳性克隆pool进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。本实施方式所获得的单个阳性克隆如图2中箭头所示。
权利要求
1.无网格BAC文库的建立方法，其特征在于无网格BAC文库按以下步骤建立一、BAC克隆载体的制备；二、大片段DNA的制备；三、连接及转化，然后选择含BAC克隆1000 3000个的培养皿，用LB液体培养基或 SOB液体培养基进行洗脱，均制成BAC克隆的悬浮液，混合均勻后都等分为2管，一组管为 DNA提取筛选管，另一组管为无网格BAC文库管，即实现无网格BAC文库的建立。
2.根据权利要求1所述的无网格BAC文库的建立方法，其特征在于步骤二中大片段 DNA片段的平均长度彡70Kb。
3.如权利要求1所述无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，其特征在于按以下步骤筛选无网格BAC文库以获取阳性克隆一、用待筛选序列的特异性引物对BAC文库中的DNA提取筛选管进行PCR，取阳性pool 所对应的无网格BAC文库管，并吸取200 μ L菌液，进行梯度稀释；二、将步骤一制备的梯度稀释液振荡培养；三、将步骤二振荡培养的菌液取出一部分进行离心，弃去上清液后用沉淀的菌体离心进行PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后，一次用牙签钝端挑取8 15个克隆放入96 孔板或384孔板中振荡培养，取少量振荡培养物再次进行PCR反应，将阳性克隆pool进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。
4.根据权利要求3所述的无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，其特征在于步骤二中振荡培养时间为10 12小时。
5.根据权利要求4所述的无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，其特征在于步骤二中置于转速为200r/min、温度为37度环境中振荡培养。
全文摘要
无网格BAC文库的建立方法及该无网格BAC文库阳性克隆的筛选方法，它涉及一种简便基因文库的建立与筛选。它解决现有无网格BAC文库阳性克隆技术中DNA杂交技术程序复杂，花费时长，存在假阳性，而且难以获得单个阳性克隆的问题。文库建立一、BAC克隆载体的制备；二、大片段DNA的制备；三、连接及转化。阳性克隆筛选一、PCR取阳性pool进行梯度稀释；二、振荡培养；三、用菌体离心PCR，选取滴度最大的菌液进行涂板，然后挑取8～15个克隆振荡培养，进行PCR反应，将阳性克隆pool进行再次涂板，选取单个克隆进行验证，即可获得单个阳性克隆。本发明用于BAC文库的建立和阳性克隆的筛选。
文档编号C12N15/10GK102560689SQ20111045995
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者吴红艳, 夏正俊, 翟红 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所