转化用质粒的制作方法

专利名称：转化用质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制作转化厌氧菌的、具有包含在厌氧菌中发挥功能的分泌信号肽的表达盒且为非穿梭质粒的转化用质粒，所述转化厌氧菌作为实体瘤等缺氧疾病治疗用基因转运载体是有用的。此外，本发明涉及包含由用该转化用质粒转化了的厌氧菌构成的基因转运载体、含有该基因转运载体的药物组合物和含有该基因转运载体的缺氧疾病治疗剂。进而，本发明还涉及对制作该缺氧疾病治疗用转化厌氧菌有用的、包含编码新的分泌信号肽的碱基序列的DNA片段。
背景技术：
近些年来，治疗恶性肿瘤的方法中，将转化厌氧菌用作基因转运载体的方法已经引起了注意，例如，已经提出了使用转化的梭菌(Clostridium)将能把抗肿瘤物质前药转变为抗肿瘤物质的酶的硝基还原酶的表达基因转运至肿瘤位置的方法等(参见专利文献I至3)。进而，还在讨论用侵袭性厌氧菌例如沙门氏菌、肠侵袭性大肠杆菌、李斯特菌(Listeria)、志贺氏菌(ShigelIa)等，通过对肿瘤细胞的RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)，转运能消灭与缺氧疾病因子有关的基因或阻碍其表达的核酸(siRNAs ;小型干扰RNAS (small interfering RNAs)、短链干扰 RNAS (short interfering RNAs)或小发夹RNAS (short hairpin RNAs))的表达基因的方法(参见专利文献4至6)。但是，这些微生物都是将致病菌变异为低毒性的微生物，不能否认其有可能进行反向变异而恢复为原来的致病菌，发挥有害性，进而，由于局域运动性、侵袭性，因此不仅在疾病组织而且在正常组织也发挥作用，可能产生全身性的副作用症状等，存在安全性方面的问题。本发明人等着眼于存在于人肠道内而形成菌群的非致病性的肠内细菌、已知是极其安全的兼性厌氧性细菌的双歧杆菌，开发了使用该双歧杆菌的转化体菌的恶性肿瘤的治疗方法。于是，开发了转化了的长双歧杆菌105A，使得其表达能将5-氟尿嘧啶(以下称为5-FU)的前药5-氟胞嘧啶(以下称为5-FC)转变为5-FU的酶一胞嘧啶脱氨酶(以下称为⑶)(参见专利文献7、8)。该转化体双歧杆菌具有在将其通过静脉内的方式给予实体瘤动物模型时，在低氧状体的缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖，而在没有缺氧环境下的正常组织中迅速消失的特点。(参照非专利文献1、2)进而，该转化体双歧杆菌还具有即时静脉给药时也不显示抗原性的特点，可以期待其作为极其优异的恶性肿瘤治疗剂。这些转化体双歧杆菌由于是使用大肠杆菌一双歧杆菌的穿梭质粒pBLES100-S-eCD、pAVOO I-HU-eCD_M968等被转化，因此横向转移到大肠杆菌时，可能在该大肠杆菌中复制。为了解决该课题，本发明人等进行了质粒的改良，开发了不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒pBifiCD (参照专利文献9)。另一方面，这些非穿梭质粒由于不具有分泌信号，这些转化体双歧杆菌没能将表达了的CD分泌到菌体外。因此，需要开发在双歧杆菌中发挥功能，可以将表达蛋白等分泌到菌体外的分泌信号肽。作为双歧杆菌的分泌蛋白，报道了例如青春双歧杆菌的淀粉酶、短双歧杆菌的SeCl、SeC2、SeC3等，还报道了导入有这些分泌信号的质粒。例如，报道了导入有青春双歧杆菌的淀粉酶的分泌信号肽基因的、用大肠杆菌一双歧杆菌的穿梭质粒pYBamy59转化了的长双歧杆菌MGl。(参照非专利文献3)另外，还报道了导入有短双歧杆菌SeC2的分泌信号肽和成纤维细胞生长因子2 (FGF2)的融合基因的、用大肠杆菌一双歧杆菌的穿梭质粒pESH86、pESH87等转化了的短双歧杆菌UCC2003等。(参照非专利文献4)另外，还报道了包含来自双歧杆菌属细菌的启动子以及信号序列、特别是BL1181基因产物的信号或aMyB基因产物的信号序列的表达盒，实际上确认了在短双歧杆菌以及长双歧杆菌中表达蛋白的显著的分泌(专利文献10)。
但是，上述的质粒均为大肠杆菌-双歧杆菌的穿梭质粒，而对于如本发明这样的、是不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒且具有在双歧杆菌中发挥功能的分泌信号的质粒，还是未知的。另外，这些分泌信号都还不明确是否在确认了的菌株以外的菌株中发挥功能，推测转化了的菌的目的蛋白的分泌量也少。因此，期待开发出可以发挥优异的分泌功能的、实用性高的分泌信号肽。现有技术文献专利文献专利文献I:美国专利第6416754号专利文献2:美国专利第6652849号专利文献3:美国专利公开2003/0103952号公报专利文献4:日本特表2008 — 519002号公报专利文献5:日本特开2008 — 92956号公报；国际公开W02006 — 066048号公报专利文献6:国际公开W02008 — 091375号公报专利文献7:日本特开2002-97144号公报专利文献8:国际公开W02007-136107号公报专利文献9:国际公开W02009 — 128272号公报专利文献10:国际公开W02010 — 126073号公报非专利文献非专利文献I: Yazawa et al,, Cancer Gene Ther.，7，269-274 (2000)非专利文献2:Yazawa et al. , Breast Cancer Res. Treat. , 66, 165-170 (2001)非专利文献3:Seong et al. , Biotechnology Letters, 2006, Vol. 28:pp 163-168非专利文献4:Shkoporov et al. , Biotechnology Letters, 2008Vol.30:ppl983-1988
发明概述技术 问题本发明的课题是提供用于制作转化厌氧菌的转化用质粒、用该转化用质粒转化了的转化厌氧菌、包含该转化厌氧菌的基因转运载体、含有该基因转运载体的药物组合物以及含有该转化厌氧菌的缺氧疾病治疗剂，所述转化用质粒是具有在厌氧菌中发挥功能的分泌信号且不具有在该厌氧菌以外的菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒。另外，本发明的另一个课题是，提供包含由该转化用质粒转化了的转化厌氧菌的基因转运载体、含有该基因转运载体的药物组合物以及含有该耐性菌的缺氧疾病治疗剂。再另外，本发明的另一个课题是，提供在例如长双歧杆菌105A等中发挥功能的新的分泌信号。问题解决方法本发明人等，之前，制作了插入有表达具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白中的⑶的基因的质粒pBLES100-S-e⑶、pAV001-HU-era_M968等。发现并报道了 使用其重组的专性厌氧菌，例如长双歧杆菌105A / pBLES 100-S_e⑶、长双歧杆菌105A / pAV001-HU-e⑶-M968等可以期待作为有用的恶性肿瘤的治疗剂。(专利文献7、8)上述专利文献7、8的转化菌的制作中所用的质粒pBLESlOO-S-e⑶和pAVOOl-HU-eCD-M968均是大肠杆菌一双歧杆菌的穿梭质粒，因此其横向转移到大肠杆菌时，可能在该大肠杆菌中被复制。但是，使用转化基因转运载体的实体瘤的治疗方法中，非常重要的是，所用的基因转运载体的转化基因不向该基因转运载体以外的、致病菌或好氧性或者兼性厌氧菌横向转移，进而即使发生了横向转移也不在该菌中复制。因此，需要不具有转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点的、即在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒。本发明者人等为了解决该课题，进行了质粒的改良，开发出了不具有在大肠杆菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒pBifiCD。(专利文献9)另一方面，这些质粒由于都是不具有分泌信号的转化用质粒，因此使用其重组的转化菌不将表达的CD分泌到菌体外，CD表达量不直接反映CD酶活性、即药效的问题依然存在。进而，在不是CD这样的将前药转变为抗肿瘤物质的酶而是产生抗肿瘤性蛋白、核酸等的菌的情况下，需要使所产生的抗肿瘤物质放出到菌体外，因此，需要在缺氧疾病组织中增殖后，杀死破坏菌。因此得出结论具有在专性厌氧菌、特别是双歧杆菌中发挥功能的分泌信号的转化用质粒是更好的。于是进行潜心研究，从而完成了本发明。SP，本发明涉及〈1>转化用质粒，是用于制作转化厌氧菌的质粒，其具有包含在厌氧菌中发挥功能的分泌信号的表达盒，并且是非穿梭质粒。<2>如〈1>所述的质粒，其中厌氧菌是双歧杆菌。〈3>如〈1>或〈2>所述的转化用质粒，其中分泌信号肽来自双歧杆菌。<4>如〈3>所述的转化用质粒，其中分泌信号肽来自长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。<5>如<1>至〈4>中任一项所述的转化用质粒，其中分泌信号是由序列号6 28的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。〈6>如〈5>所述的转化用质粒，其中分泌信号是由序列号6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列。<7>如〈6>所述的转化用质粒，其中分泌信号是由序列号8或25的碱基序列的任一种所示的DNA或其单核苷酸多态性。〈8>如〈1>至〈7>中任一项所述的转化用质粒，其中编码表达盒所含的启动子的基因是由序列号29 44的启动子区域的碱基序列或者序列号45的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。<9>如〈8>所述的转化用质粒，其中表达盒所含的启动子基因是由序列号35的启动子区域的碱基序列或者序列号45的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增
添后的序列的任一种所示的DNA。<10>如〈1>至〈9>中任一项所述的转化用质粒，其中表达盒所含的终止子基因是由序列号46的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA。〈11>如〈1>至〈10>中任一项所述的转化用质粒，其中表达盒所含的靶基因是编码突光蛋白的基因。<12>如<1>至〈10>中任一项所述的转化用质粒，其中表达盒所含的靶基因是编码具有抗肿瘤活性的蛋白的基因。<13>如〈12>所述的转化用质粒，其中具有抗肿瘤活性的蛋白是选自干扰素(IFN)-a、IFN-β、IFN-Y、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-Ia、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7 (⑶80)和B7-2 (⑶86)、KIT配体、制瘤素M等细胞因子，以及内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三环(kringle) I、三环2、三环3、三环4、三环5等血管发生抑制物质中的一种。<14>如〈13>所述的转化用质粒，其中具有抗肿瘤活性的蛋白是肿瘤坏死因子(TNF)-Q或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)中的任一者。<15>如〈1>至〈10>中任一项所述的转化用质粒，其中靶基因是是编码具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的基因。<16>如〈15>所述的转化用质粒，其中具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β_葡糖醛酸糖苷酶中的一种。<17〉如<1>至〈10>中任一项所述的转化用质粒，其中靶基因是是编码具有缺血性疾病治疗活性的蛋白的基因。<18>如<17〉所述的转化用质粒，其中具有缺血性疾病治疗活性的蛋白是选自成纤维细胞生长因子2 (FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等具有血管生成促进活性的蛋白中的一种。<19>如〈1>至〈10>中任一项所述的转化用质粒，其中靶基因是是具有缺氧疾病治疗活性的核酸。
<20>如〈19>所述的转化用质粒，其中具有缺氧疾病治疗活性的核酸是与选自成纤维细胞生长因子2 (FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等中的至少一种肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。<21>如<1>至〈20>中任一项所述的转化用质粒(pBifi-SP3B_TNF alpha),其包含由序列号5的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA序列。<22>基因转运载体，包含用〈1>至〈21>中任一项所述的转化用质粒转化厌氧菌。<23>如〈22>所述的基因转运载体，其中所述厌氧菌是非致病性的肠内细菌。〈24>如〈22>或〈23>所述的基因转运载体，其中所述厌氧菌是双歧杆菌。
<25>如〈24>所述的基因转运载体，其中所述双歧杆菌是选自青春双歧杆菌、埃氏双岐杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、双歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡肠双歧杆菌、球双歧杆菌、印度双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、奇异双歧杆菌、乳双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、利拜洛拉姆双歧杆菌(匕7 4 F K ^ f U々Λ · U口 9 Λ)、长双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(e ^ ^ K 〃，r V 9 Λ · > 3'丨J工> 7 )、帕鲁布罗拉姆双歧杆菌(匕' 7 4 K d T >)々厶·八7" 口
7A)、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌、萨伊库拉埃罗胡拉姆双歧杆菌(e ^ K K々r V々么*寸〃^^二口7〃5 ^)、小鸡双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、波伦亚双歧杆菌、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(匕7 ^ F K ^ f U々Λ · 7力> K <7 4 )、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、Thermacidophilum双歧杆菌和嗜热双歧杆菌中的I种。<26>如〈25>所述的基因转运载体，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌。<27>如〈22>至〈26>中任一项所述的基因转运载体，它能够在缺氧环境中的肿瘤组织中生长，并且能够表达、分泌至少一种对缺氧疾病的诊断或治疗有用的蛋白或核酸。<28>如〈27>所述的基因转运载体，其中对缺氧疾病的诊断有用的蛋白是荧光蛋白。<29>如〈27>所述的基因转运载体，其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有抗肿瘤活性的蛋白。〈30>如〈28>所述的基因转运载体，其中具有抗肿瘤活性的蛋白是选自干扰素(IFN)-a、IFN-β、IFN-Y、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7 (⑶80)和B7-2 (⑶86)、KIT配体、制瘤素M等细胞因子，以及内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三环(kringle) I、三环2、三环3、三环4、三环5等血管发生抑制物质中的一种。<31>如〈27>所述的基因转运载体，其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。<32>如〈31>所述的基因转运载体，其中具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白是选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和葡糖醛酸糖苷酶中的I种。
〈33>如〈27>所述的基因转运载体，其中对缺氧疾病的治疗有用的核酸是与缺氧疾病因子有关的siRNAs。<34>如〈33>所述的基因转运载体，其中与缺氧疾病因子有关的siRNAs是与选自成纤维细胞生长因子2 (FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等中的至少一种肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。〈35>药物组合物，包含〈22>至〈34>中任一项所述的基因转运载体。〈36>编码来自长双歧杆菌的分泌信号肽的DNA。<37>如〈36>所述的编码分泌信号肽的DNA，其包含由序列号6 28的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA序列。〈38>由〈36>或〈37>所述的DNA编码的分泌信号肽。<39>包含〈36>或〈37>所述的DNA的转化用质粒。<40>如〈39>所述的转化用质粒，它进一步包含编码对缺氧疾病的诊断或治疗有用的蛋白或核酸的DNA。<41>如〈40>所述的转化用质粒，其中对缺氧疾病的诊断有用的蛋白是荧光蛋白。〈42>如〈40>所述的转化用质粒，其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有抗肿瘤活性的蛋白。<43>如〈42>所述的转化用质粒，其中具有抗肿瘤活性的蛋白是选自干扰素(IFN)-a、IFN-β、IFN-Y、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-Ia、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-a、淋巴毒素(LT)-i3、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7 (CD80)和B7-2 (⑶86)、KIT配体、制瘤素M等细胞因子，以及内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)、三环(kringle) I、三环2、三环3、三环4、三环5等血管发生抑制物质中的一种。<44>如〈40>所述的转化用质粒，其中对缺氧疾病的治疗有用的蛋白是具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白。<45>如〈44>所述的转化用质粒，其中具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质 的活性的蛋白是选自胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶和β_葡糖醛酸糖苷酶中的I种。<46>如〈40>所述的转化用质粒，其中对缺氧疾病的治疗有用的核酸是与缺氧疾病因子有关的siRNAs。<47>如〈46>所述的转化用质粒，其中与缺氧疾病因子有关的siRNAs是与选自成纤维细胞生长因子2 (FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等中的至少一种肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAs。<48>基因转运载体，其为用〈39>至〈47>中任一项所述的转化用质粒转化了的厌氧菌。<49>如〈48>所述的基因转运载体，其中所述厌氧菌是双歧杆菌。<50>如〈49>所述的基因转运载体，其中所述双歧杆菌是选自青春双歧杆菌、埃氏双岐杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、双歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡肠双歧杆菌、球双歧杆菌、印度双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、奇异双歧杆菌、乳双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、利拜洛拉姆双歧杆菌( ' 7 ^ F K ^ f ^々Λ · ^口 9 Λ)、长双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(e ^ ^ K ，r V 9 λ · > 3'丨J工> 7 )、帕鲁布罗拉姆双歧杆菌(匕' 7 4 K d T >)々厶·八Jl· 7" 口
7 A )、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌、萨伊库拉埃罗胡拉姆双歧杆菌(e ^ K K々r V々么*寸〃^^二口7〃5 ^ )、小鸡双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、波伦亚双歧杆菌、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(匕7 ^ F K ^ f U々Λ · 7力> K <7 4 )、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、Thermacidophilum双歧杆菌和嗜热双歧杆菌中的I种。<51>如〈50>所述的基因转运载体，其中所述双歧杆菌是长双歧杆菌。<52>药物组合物，包含〈48>至〈51>中任一项所述的基因转运载体。发明的效果本发明的质粒具有具有分泌信号的表达盒且是非穿梭质粒，是对于制作实体瘤等缺氧疾病治疗用转化厌氧菌来说有用的新型质粒。本发明的质粒不具有在转化菌以外菌中发挥功能的复制起点，是在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒，因此是非常安全的载体。用本发明的转化用质粒转化了的厌氧菌进行缺氧疾病组织特异性地建群、增殖，在该疾病组织，可以产生、分泌具有缺氧疾病治疗活性的蛋白或核酸，作为缺氧疾病治疗剂是非常有用的，可以期待其成为高品质的基因转运载体。进而，本发明的新型分泌信号，如上所述，除了插入到质粒中以外，通过将其直接组入厌氧菌的基因组，也可以制作对缺氧疾病治疗有用的、转化厌氧菌。


[图I]图I是表示分泌型GFP表达质粒(pSPxA-GFP)的构建概要的工序图。[图2]图2是表示分泌型GFP表达质粒(pSPxB_GFP)的构建概要的工序图。[图3]图3是表示分泌型GFP表达质粒(pSec2_GFP)的构建概要的工序图。[图 4]图 4 是表示 B. longum 105A/pSP3B_GFP、B. longuml05A/pSP7B_GFP、B· longum105A/pSP23B-GFP、B. longum 105A/pSP7A_GFP 以及 B. longum 105A/pSec2_GFP 的免疫印迹的结果的图。图中，C表示细胞内蛋白质提取物的条带，T表示培养上清浓缩物的条带，纵轴的数值表示分子量(kDa)。[图5]图5是表示分泌型TNFα表达质粒(pSPxA_TNF alpha)的构建概要的工序图。[图6]图6是表示分泌型TNFα表达质粒(pSPxB_TNF alpha)的构建概要的工序图。[图7]图7是表示分泌型 TNFα表达质粒(pSec2_TNF alpha)的构建概要的工序图。[图 8]图 8 是表示 B. longum 105A/pSPlB_TNF alpha、B. longuml05A/pSP3B_TNFalpha、B. longum 105A/pSP4B_TNF alpha、B. longuml05A/pSP7B_TNF alpha、B. longum105A/pSP12B-TNF alpha、B.longuml05A/pSP 16B-TNF alpha、B.longum 105A/pSP23B_TNFalpha、B. longuml05A/pSP7A_TNF alpha 以及 B. longum 105A/pSec2_TNF alpha 的免疫印迹的图。图中、C表示细胞内蛋白提取物的条带，T表示培养上清浓缩物的条带，S表示培养上清的条带，纵轴的数值表示分子量(kDa)。[图9]图9是表不B.longum 105A以及B. longum 105A/pTNF3的免疫印迹结果的图。纵轴的数值表示分子量(kDa)。[图10]图10是表示质粒pBifi-SP3B_TNFalpha构建的概要的工序图。[图 11]图 11 是表不 Bifidobacterium longum IO 5A/pB i f i SP3B-TNF alpha 乃免疫印迹的图。条带I的分子量标准从下往上分别是20、30、40、50、60以及80kDa。[图12]图12是表示TNFa表达质粒(pTNF3)的构建概要的工序图。[图13]图13是表示具有不含插入物的蛋白表达单元的mock质粒(pBEshuttle)的构建概要的工序图。[图14]图14是表示TNFα的细胞毒性试验的结果的曲线图。
[图15]图 15 是表示分泌型 TNFa 表达质粒 B. longum 105A/pSP3B_TNFalpha 以及B. breve/pSP3B-TNF alpha的、小鼠的in vivo抗肿瘤效果测定实验中的肿瘤体积的经日变化的结果的曲线图。[图16]图 16 是表示分泌型 TNF α 表达质粒 B. longum 105A/pSP3B_TNFalpha 的、阿霉素并用下的小鼠的in vivo抗肿瘤效果测定实验中的肿瘤体积的经日变化的结果的曲线图。[图17]图17是表示非分泌型人类IL一 18表达质粒phIL18mut_His的构建概要的工序图。[图18]图18是表示分泌型人类IL一 18表达质粒pSP3B_hIL18mut的构建概要的工序图。本申请说明书中所说的非穿梭质粒的意思是，具有仅在转化对象的厌氧菌中发挥功能的复制起点、不具有在其以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化厌氧菌和转化厌氧菌以外的菌中不相互复制的质粒。本申请说明书中所说的分泌信号的意思是，包含编码分泌信号肽的碱基序列的DNA片段(有时也简称为分泌信号肽基因)。本申请说明书中，编码具有抗肿瘤活性的蛋白的DNA、编码具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的DNA、以及编码具有缺血性疾病治疗活性的蛋白的DNA等，有时也称为“编码目的蛋白的DNA”。本申请说明书中所说的“siRNAs”包括被称作小型干扰RNA (small interferingRNA)或短链干扰RNA (short interfering RNA)的siRNA以及、在祀细胞内被切割酶(Dicer)等酶切断而成为siRNA的短链发夹RNA (short hairpin RNA、SHRNA)。另外，有时也包括siRNA修饰体和siRNA复合体而进行总称。本申请说明书中所说的“表达盒”是指包含启动子、编码表达蛋白的基因(靶基因)、终止子等表达单元、进而还可以包含任意其他的有用单元的、用于使特定蛋白或肽片段表达的一套基因。作为其他的有用单元，可以举出例如编码分泌信号等信号肽的基因、编码标识蛋白的基因等。本发明涉及用于制作转化厌氧菌的质粒，该转化用质粒具有包含在厌氧菌中发挥功能的分泌信号的表达盒，且是非穿梭质粒。作为在实体瘤、缺血性疾病等疾病部位处于厌氧环境下的疾病(以下、称为缺氧疾病)的治疗中所用的转化基因转运载体，从安全性的观点考虑，需要使非致病性的。进而，仅在处于厌氧状态的疾病组织等中建群、增殖，而在非厌氧状态的正常的组织中不建群、增殖的专性厌氧菌是更优选的。本发明者人等对使用作为专性厌氧菌的双歧杆菌的恶性肿瘤的治疗方法就行了反复研究，开发了组入了将前药5-FC转变为抗肿瘤物质5-FU的酶的CD的基因的质粒转化了的长双歧杆菌105A。(专利文献7、8)对于这些转化体双歧杆菌，确认了 在以静脉内方式给予缺氧疾病的实体瘤模型动物时，在处于低酸素状态的缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖，而在非低酸素状态的正常组织中迅速消失。(参照非专利文献1、2)但是，上述专利文献7、8的转化体双歧杆菌由于是使用菌一双歧杆菌的穿梭质粒pBLES100-S-e⑶、pAV001-HU-e⑶-M968等转化的，因此在横向转移到大肠杆菌时，有可能在该大肠杆菌中复制。因此，本发明人等，为了解决该课题，进行了质粒的改良，开发了不具有在大肠杆 菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒pBifiCD。(专利文献9)使用这些转化菌的恶性肿瘤的治疗方法，即酶一前药疗法(⑶一 5 - FC疗法)中，为了尽量降低抗肿瘤物质5 - FU的副作用，希望抗肿瘤物质5 - FU肿瘤组织特异性地发挥作用，因此本发明人等，为了使产生的CD不分泌到菌体外，将被摄入菌体内的5 — FC转变为5 - FU而排出到菌体外，仅在肿瘤组织发挥5 - FU的抗肿瘤作用，从而对这些转化体双歧杆菌均用不具有分泌信号的质粒进行了转化。这些用不具有分泌信号的质粒转化了的双歧杆菌，从在处于低酸素状态的缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖的特征和酶CD停留于在缺氧疾病组织中特异性地建群、增殖了菌的内部的特征这两方面，具有可以消除抗肿瘤物质5 - FU的全身的副作用的优点，但另一方面，同时发现了以下问题5 — FU的生成量并不是转化体双歧杆菌所产生的CD量，而与摄入菌体内的5 - FC的量相关，所产生的CD的酶功能不能充分发挥。另外，在不是CD这样的将前药转变为抗肿瘤物质的酶而是产生抗肿瘤性蛋白、核酸等的菌的情况下，为了使所产生的抗肿瘤物质放出到菌体外，需要在缺氧疾病组织中增殖后，杀死破坏菌。为了解决这些问题，着手开发在厌氧菌、优选非致病性的专性厌氧菌中发挥功能、具有使产生的活性物质分泌的分泌信号的质粒，开发了对该质粒制作有用的、至少在厌氧菌中发挥功能、表现出优异的表达蛋白的分泌作用的分泌信号肽。另外，使用转化基因转运载体的实体瘤等的治疗方法中，如上所述，非常重要的是，所用的基因转运载体的转化基因不向该基因转运载体以外的、致病菌或好氧性或者兼性厌氧菌中横向转移，进而，即使横向转移了也不在该菌中复制。因此，对于上述具有分泌信号的质粒，优选是不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点的非穿梭质粒。本发明的质粒是转化厌氧菌制作用的质粒，是具有包含至少在厌氧菌中发挥功能的分泌信号的表达盒的质粒。而且是不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒。更具体地，是至少在双歧杆菌中发挥功能、具有含有优异的分泌作用的分泌信号的表达盒、而且、不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化菌以外的菌中不相互复制的转化厌氧菌制作用的质粒。
本发明的转化用质粒是的特征是通过使用该质粒，能够表达任意的目的蛋白或核酸，进而可以制作通过表达盒所含的分泌信号肽的作用发挥优异的实用性高的分泌功能的转化厌氧菌。进而，本发明的转化用质粒的特征是是不具有在转化菌以外的菌中发挥功能的复制起点、在转化菌以外的菌中不相互复制的非穿梭质粒载体。至今，作为在厌氧菌、特别是双歧杆菌中发挥功能的信号肽，报道有例如青春双歧杆菌的淀粉酶、短双歧杆菌的SeCl、SeC2、SeC3等，还报道了导入有它们的分泌信号的质粒。但是，推测这些质粒转化了的双歧杆菌的目的蛋白质的分泌量少。而且，克隆该青春双歧杆菌的淀粉酶的分泌信号以及启动子区域，将它们与编码 UV优化绿色荧光蛋白变异体(GFPUv ；CL0NTECH Laboratories, Inc.)的基因组合而制作质粒，对于用该质粒转化的长双歧杆菌，确认其表达蛋白(GFP)的分泌功能，结果没有显示GFP的分泌功能，推定该分泌信号肽不可以分泌任意的目的蛋白。进而，至今报道的将表达蛋白分泌到菌体外的转化厌氧菌制作用的质粒载体是将来自大肠杆菌的质粒和来自转化菌的质粒融合后的、在大肠杆菌和转化菌双方中发挥功能的穿梭载体，没有报道过仅在大肠杆菌以外的转化菌中发挥功能的转化用质粒。本发明的转化用质粒所具有的在厌氧菌中发挥功能的分泌信号肽，只要是至少在厌氧菌中发挥功能的分泌信号肽则可以使用任意的分泌信号肽，优选在双歧杆菌中发挥功能的分泌信号肽。从对转化菌的毒性、功能性的观点考虑，更优选来自双歧杆菌的分泌信号肽，进一步优选来自长双歧杆菌菌的分泌信号肽。作为来自长双歧杆菌菌的分泌信号肽，例如，可以例示出由序列号6 28的任一碱基序列或其I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列表示的DNA编码的分泌信号肽等。这些之中，从高分泌功能的角度考虑，优选由序列号6、7、8、9、12、14、15、17、21、25或28的任一碱基序列或其I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列表示的DNA编码的分泌信号肽，更优选由序列号8或25的任一碱基序列或其I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列表示的DNA编码的分泌信号肽。另外，作为本发明的转化用质粒所具有的、表达盒中的启动子，只要是在厌氧菌中发挥功能、作为分泌信号肽的启动子来发挥功能，则可以使任意的启动子，例如可以举出与来自双歧杆菌的分泌信号肽的上游相邻的启动子(promoter X)或编码在双歧杆菌中发挥功能的组织蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子(HU promoter)等。具体地,可以举出由序列号29 44的任一个所表不的碱基序列的启动子区域的DNA以及序列号45所表不的碱基序列或其I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的DNA编码的启动子。在这些之中，优选由序列号35所表示的碱基序列的启动子区域的DNA或者其单核苷酸多态性编码的启动子或HU启动子,更优选HU启动子,尤其优选由序列号45的碱基序列或其I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列所表示的DNA编码的启动子。进而，作为本发明的转化用质粒所具有的终止子，只要是在双歧杆菌中发挥功能、作为分泌信号肽的终止子发挥功能，则可以是任意的终止子，优选编码在双歧杆菌中发挥功能的组织蛋白样DNA结合蛋白的基因的终止子(HUterminator),特别是序列号46的碱基序列或其I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列所表示的DNA是尤其优选的。这里，本发明中所说的“一碱基变异体”的意思是至少I处的碱基发生了变异的单核苷酸多态性(以下称为SNP)，不仅包括I处的SNP，还包括多处的SNP。因此，能够与“I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列”相互替换。作为编码本发明的转化用质粒所具有的分泌的目的蛋白或核酸的基因(即靶基因)，例如，只要是编码荧光蛋白的基因、编码具有抗肿瘤活性的蛋白的基因、编码具有缺血性疾病治疗活性的蛋白的基因、编码具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白的基因等基因，则可以任意使用。作为荧光蛋白，可以举出各种绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等。另外，作为具有抗肿瘤活性的蛋白，可以举出例如细胞因子，作为具体的细胞因子可以举出，例如干扰素(IFN)-Ci、β和Y，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)-Ia、1β、2、3、4、6、7、10、12、13、15、18、肿瘤坏死因子(TNF)- α、淋巴毒素(LT)-β、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T-细胞活化共刺激 因子Β7 (CD80)和Β7-2 (CD86)、KIT配体和制瘤素M等。另外，还可以举出内皮抑制素、血管抑制素(angiostatin)和三环(kringle) 1、2、
3、4和5等血管发生抑制物质。作为具有将抗肿瘤物质前体转变为抗肿瘤物质的活性的蛋白，可以举出胞嘧啶脱氨酶(以下称为CD)，其是将5-氟胞嘧啶(以下称为5-FC)转变为抗肿瘤活性物质5-氟尿嘧啶(以下称为5-FU)的酶；硝基还原酶，其是将5-氮杂环丙基-2，4-二硝基苯甲酰胺(以下称为CB1945)转变为抗肿瘤活性烷化剂的酶；1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(以下称为HSVI-TK)，其是将更昔洛韦转变为抗肿瘤活性代谢产物的酶；以及β -葡糖醛酸糖苷酶，其是将葡糖醛酸化的抗肿瘤活性物质转变为抗肿瘤活性物质的酶；等。进而，作为具有缺血性疾病治疗活性的蛋白，可以举出具有对缺血性疾病治疗有用的血管新生促进活性的蛋白，具体地，可以举出成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等。这些蛋白的序列在各种各样的生物中是已知的，基于其序列信息利用PCR法、人工基因合成等公知的方法，从而可以获得编码目的蛋白的DNA。另外，作为具有处于厌氧环境下的疾病的治疗活性的核酸，可以举出与缺氧疾病因子有关的siRNAs，更具体地，可以举出与成纤维细胞生长因子2(FGF2)、内皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)等肿瘤细胞增殖因子有关的siRNAsο同样地，这些核酸的序列也是已知的，基于其序列信息利用PCR法等公知的方法就可以获得。本发明的质粒例如可以如下来制作。例如，按照通常的方法，在具有在转化菌和转化菌以外的菌例如大肠杆菌中分别发挥功能的复制起点的穿梭质粒中，插入至少在双歧杆菌中发挥功能的分泌信号及其启动子基因，在其下游插入至少I种编码对所期望的缺氧疾病的诊断或治疗有用的蛋白的基因或核酸(靶基因)，进而，在其下游插入在厌氧菌中发挥功能的终止子基因，从而可以制作穿梭质粒。进而，按照希望，从该穿梭质粒中除去转化菌以外的菌的复制起点，从而可以制作非穿梭质粒。
需要说明的是，各工程中的操作可以根据文献记载等的公知的方法来进行。本发明的缺氧疾病治疗用基因转运载体可以通过用上述本发明的转化用质粒按照基因工程学领域公知的方法将要转化的任意厌氧菌进行转化来制作。用本发明的转化用质粒转化了的厌氧菌由于是用于实体瘤等缺氧疾病的治疗剂的物质，因此必须是专性厌氧性其是非致病性的，如果是梭菌或沙门氏菌(Salmonella)等致病性菌，则非致病性化后的菌即可，另外，如果是乳酸杆菌等兼性厌氧菌，则突变为专性厌氧性后的菌即可。优选可以举出非致病性的厌氧性细菌，更优选可以举出非致病性的肠内细菌，其中特别优选双歧杆菌属细菌。
作为双歧杆菌属细菌，可以举出例如青春双歧杆菌、埃氏双岐杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、双歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、链状双歧杆菌、小猪双歧杆菌、棒状双歧杆菌、兔双歧杆菌、寓齿双歧杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡肠双歧杆菌、球双歧杆菌、印度双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、奇异双歧杆菌、乳双歧杆菌、乳酸双歧杆菌、利拜洛拉姆双歧杆菌(匕7 4 F K ^ f ^々Λ · ^口 ^ A )、长双歧杆菌、大双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、最小双歧杆菌、摩恩格里艾恩斯双歧杆菌(匕7 ^ K ^ r ^ Λ . > 3V工 > >)、帕鲁布罗拉姆双歧杆菌(匕门F' K々f丨J々Λ ·广)V -7- 口 ’ A)、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌、萨伊库拉埃罗胡拉姆双歧杆菌(e 4 K ^ r ^ Λ . ^ ^
9- 口 7 4 5 Α)、小鸡双歧杆菌、瘤胃双歧杆菌、反刍双歧杆菌、波伦亚双歧杆菌、苏卡鲁道维伊双歧杆菌(匕' 7 4 F K ^ f丨J々Λ · 7力> K <7 4 )、细长双歧杆菌、猪双歧杆菌、Thermacidophilum双歧杆菌和嗜热双歧杆菌等,尤其优选长双歧杆菌。这些菌均为市售或可以容易从保藏机构获得的。例如，长双歧杆菌ATCC-15707、双 歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697等可以容易地从ATCC (美国模式培养物保藏中心(The American Type Culture Collection))获得。另外，对各菌的菌株没有特别限定，例如，对于长双歧杆菌的菌株，可以举出长双歧杆菌105 — A株、长双歧杆菌aE — 194B株、长双歧杆菌BS — 601株、长双歧杆菌MlOl —2株，其中长双歧杆菌105 — A株是优选的。对于短双歧杆菌的菌株，例如可以举出短双歧杆菌标准株(JCMl 192),短双歧杆菌aS — I株、短双歧杆菌I 一 53 — 8W株，其中，短双歧杆菌标准株、短双歧杆菌aS — I株是优选的。对于婴儿双歧杆菌的菌株d P r ii，例如可以举出婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌I 一 10 — 5株，其中，婴儿双歧杆菌标准株、婴儿双歧杆菌I 一
10— 5株是优选的。另外，对于乳双歧杆菌的菌株，例如可以举出乳双歧杆菌标准株(JCM1210)。本发明的基因转运载体是包含通过本发明的转化用质粒转化了的上述厌氧菌的基因转运载体，是可以在处于厌氧环境下的组织内生长、且可以表达具有目标活性的蛋白、进而不会向转化菌以外的特别是致病性或好氧性菌或者兼性厌氧菌横向转移的基因转运载体。本发明的基因转运载体的制作可以按照市售的实验教科书中记载的方法来进行，例如，基因手册(讲谈社)、高木康敬编著的基因操作实验法(讲谈社)、分子·克隆(Molecular Cloning)科尔德斯普林实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)、分子·克隆第 2 版(Molecular Cloning, 2nd ed.)科尔德斯普林实验室(Cold Spring HarborLaboratory) (1989)、酶学方法(Methods in Enzymol. ), 194 (1991)。本发明的药物组合物只要含有本发明的基因转运载体则没有特别限制。另外，本发明的缺氧疾病治疗剂只要含有本发明的基因转运载体则没有特别限制。另外，本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂也可以含有2种以上的本发明的基因转运载体。进而，本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂可以与含有本发明的基因转运载体以外的缺氧疾病治疗效果的化合物的药物组合物、厌氧性疾病治疗剂组合使用。另外，本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂在不妨碍本发明效果的范围内，还可以含有本发明的基因转运载体以外的任意成分。作为这样的任意成分，例如可以举出药理学上允许的载体、赋形剂、稀释剂等。本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂的剂型没有特别限制，例如可以举出含有本发明的基因转运载体的液体制剂或者固体制剂。液体制剂可以通过对本发明的基因转运载体的厌氧菌的培养液进行精制，根据需要向其中加入适当的生理盐水或者液体替换品或药物添加剂，并填装到安瓿、小瓶等来制造。另外，固体制剂可以通过向液体试剂添加合适的保护剂，用其填装安瓿、小瓶等，并且然后冻干或L-干燥而产生，或通过向液体试剂添加合适的保护剂，将其冻干或L-干燥，并且然后用其填装安瓿、小瓶等而产生。作为本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂的给药方法，口服给药和肠胃外给药两者都是可以的，但肠胃外给药是优选的，例如可以进行静脉内注射、皮下注射、局部输注或脑室内给药，并且静脉内注射是最优选的。本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂的基因转运载体的给药量没有特殊限定，只要其对于在疾病位置生长和表达有效治疗剂量的活性蛋白是足够的量，但是，从经济观点和尽量避免副作用的观点出发，剂量优选地在能获得所需的治疗效果的范围内尽可能地小。本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂中的基因转运载体的给药量根据疾病的严重程度和患者的体重、年龄或性别适当选择，并且可以根据改善程度适当增加或减少。例如，当将本发明的缺氧疾病治疗剂用作实体瘤治疗剂时，根据厌氧菌自身表现出的抗肿瘤活性、具有所使用的厌氧菌产生的抗肿瘤活性的蛋白等的种类、转变自抗肿瘤物质前体的抗肿瘤物质的有效治疗剂量、所使用的厌氧菌产生的活性蛋白的量等来适当地确定剂量具体地，例如在静脉内给药的情况下，因为需要降低由于大量细菌引起的栓塞风险，所以优选将以尽可能低浓度的注射用制剂分为多次注射或用适当的液体代替品稀释注射并且通过连续输注给药。例如，在成人的情况下，将每天IO6IO12Cfu每千克体重的本发明的厌氧菌的菌体分为I至多次、连续或适当间隔地进行给药，并且持续I天至多天。更具体地，每成人直接给予ImL至IOOOmL含有104 101(lCfu/mL的本发明的厌氧菌的菌体，或用适当的液体代替品稀释，分为每天一次至多次进行给药，并且持续I天至连续几天另外，在涉及直接对疾病组织直接给药的局部给药的情况下，因为需要细菌细胞在整个疾病组织中尽可能多地建群和增殖，所以在疾病组织的多个位置给予高浓度注射是可取得。例如，在成人的情况下，每天一次或多次给予IO6Cfu至IO12Cfu每千克体重的本发明的双歧杆菌的菌体，视情况连续或间隔地进行给药，并且按照需要持续I天至多天。更具体地,每成人直接地给予ImL至IOOOmL含有104cfu/mL至10lclcfu/mL的本发明的双歧杆菌的菌体直接地，优选每天一次至多次，并且按照需要连续地持续I天至几天。当在治疗期间观察到疾病组织中的细菌已消失，则首先暂停治疗，然后以如以上相似的方式给予细菌。 需要说明的是，本发明中的“ X和Y组合而成”X和Y在不同配置(configuration)的情况以及X和Y在相同配置的情况(例如含有X和Y的配置)。当X和Y在不同配置时，X和Y可以各自另外含有其他成分。本发明的药物组合物、缺氧疾病治疗剂可以应用于厌氧环境下的疾病、优选各种实体瘤。作为实体瘤，可以举出大肠癌、脑瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、睾丸肿瘤、卵巢癌、子宫癌、甲状腺癌、恶性类癌瘤、皮肤癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、维尔姆斯肿瘤(Wilm’s tumor)、成视网膜细胞瘤、黑色素瘤和鳞癌等。另外，在缺氧环境中的其他疾病的实例包括缺血性疾病，例如心肌梗死或闭塞性动脉硬化，以及下肢缺血性疾病，例如伯格病(Buerger’ s disease)。另外，本发明也还包含对于在特别是上述的质粒、基因转运载体或药物组合物中的使用有用的新型分泌信号肽。本发明人等首先，为了发现在双歧杆菌中发挥功能、表现出优异的表达蛋白的分泌作用的分泌信号肽，进行了上述转化体双歧杆菌的亲代菌株长双歧杆菌105A的基因组解析，选出了 25种具有分泌信号且推测是不具有膜贯通区域的分泌蛋白的蛋白。25种蛋白中，分泌信号与启动子相邻的是16种，分泌信号不与启动子相邻的是9种。精确检查25种蛋白编码区域的碱基序列，对于25种分泌蛋白质中推测为不完全的蛋白编码序列(CDS)的3个(No. 17、18、20)后的22个(No. I 16、19、21 25)，如下进行分泌信号以及推定为启动子的区域的克隆。对于分泌信号与启动子相邻的16种蛋白，克隆该启动子(promoter X)以及推定为分泌信号(以下、SPxA)的区域，将它们与编码UV优化绿色荧光蛋白变异体(GFPUv ；CL0NTECH Laboratories, Inc.)的基因和在上述专利文献7 9记载的质粒制作中使用的双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的终止子(HU terminator)组合,制作质粒,对于用该质粒(PSPxA)转化了的双歧杆菌，确认表达蛋白(GFP)的分泌功能。另外，对于包括分泌信号不与启动子相邻的剩余9种蛋白的全部22种蛋白，克隆不含启动子区域的分泌信号(以下、SPxB)区域，与上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的启动子(HU promoter)、编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因以及上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的终止子(HU terminator)组合,制作质粒,与上述同样地,对于用该质粒(pSPxB)转化了的双歧杆菌，确认表达蛋白(GFP)的分泌功能。结果是，在12 种质粒(pSP7A-GFP，pSP12A-GFP，pSPlB-GFP，pSP2B-GFP，PSP3B-GFP, pSP4B-GFP, pSP7B_GFP， pSP9B_GFP， pSPIOB-GFP, pSP12B_GFP， pSP16B_GFP，PSP23B-GFP)中确认到分泌倾向，在 4 种质粒(pSP7A_GFP，pSP3B_GFP，pSP7B_GFP，PSP23B-GFP)中确认到优异的表达蛋白的分泌功能。另外，除此之外，在该长双歧杆菌105A的基因组解析中，进行了与报道在短双歧杆菌中分泌的 SeC2 的基因(Laura E. MacConaill et al. , Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2003 Vol. 69:pp6994_7001)在氨基酸水平上同源性高的碱基序列的蛋白的检索，对于其分泌信号肽，进行了研究。即，将该分泌编码信号肽的基因和上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的启动子(HU promoter)基因组合而进行克隆，将它们与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因以及上述双歧杆菌的组织蛋白样肽(HU)的终止子(HU terminator)组合而制作质粒，与上述同样地，对于用该质粒(pSeC2 — GFP)转化了的双歧杆菌，确认表达蛋白(GFP)的分泌功能，结果确认了优异的表达蛋白的分泌功能。接下来，对于上述确认了分泌倾向的13种质粒，制作插入了编码别的目的蛋白的人类TNF — α的基因来代替编码GFP的基因的质粒，用这些质粒转化双歧杆菌，确认其表 达蛋白分泌功能。结果是，在9 种质粒(pSP7A-TNF α，pSPlB-TNF α，pSP3B_TNF α，pSP4B_TNF α，PSP7B-TNF α，pSP12B_TNFa，pSP16B_TNFa，pSP23B_TNF a，pSeC2B_TNF a )中显示分泌功能，在2种质粒(pSP3B_TNFa，pSP23B-TNF a )中确认了特别优异的表达蛋白的分泌功能。进而，制作从这些质粒中除去了在双歧杆菌以外的菌中发挥功能的复制起点、例如pUC ORI的质粒。于是,对于用该质粒转化了的双歧杆菌看,确认表达蛋白的分泌功能，结果确认到除去了在双歧杆菌以外的菌中发挥功能的复制起点pUC ORI的质粒也同样地能够发挥优异的表达蛋白的分泌功能。这样，发现了至少在双歧杆菌中发挥功能、优异的表达蛋白的分泌作用的新型分泌信号肽。如上所述，本发明的分泌信号肽由于具有优异的分泌活性，且能在非致病性专性厌氧菌双歧杆菌中发挥功能，因此特别适用于上述质粒、基因转运载体或药物组合物。因此，包含本发明的新型分泌信号肽作为分泌信号肽的、所有形式的上述质粒、基因转运载体或药物组合物也包括在本发明中。
实施例以下，借助制造例及实施例更具体地说明本发明，但是本发明的技术范围不局限于这些实施例。参考例I:分泌信号的in Silico筛选针对由Bifidobacterium longum 105A的全基因组序列推定的全翻译区域的1941个氨基酸序列，进行使用PrediSi的信号肽预测，推定188个信号肽。预测时，使用了Gram Positive Bacteria 的参数组。推测的188个信号肽之中，选定不具有膜贯通区域的25个作为候选分泌蛋白质。该推定分泌蛋白质编码区域示于表I。[表 I]表I候选分泌蛋白的基因组上的位置和方向
权利要求
1.编码来自长双歧杆菌的分泌信号肽的DNA。
2.如权利要求I所述的编码分泌信号肽的DNA，其包含由序列号6 28的碱基序列或其序列的I个或多个碱基缺失、置换或增添后的序列的任一种所示的DNA序列。
3.由权利要求I或2所述的DNA编码的分泌信号肽。
全文摘要
本发明涉及新的分泌信号、含分泌信号的新的转化用质粒、被该质粒转化的转化厌氧菌、由该厌氧菌形成的基因转运载体、含有该载体的药物组合物。
文档编号C12N15/09GK102741407SQ20118000746
公开日2012年10月17日 申请日期2011年1月28日 优先权日2010年1月29日
发明者佐佐木贵之, 岛谷裕子, 清水瞳 申请人:阿内罗药物科学株式会社