专利名称：α-淀粉酶变体和编码该变体的多核苷酸的制作方法
α-淀粉酶变体和编码该变体的多核苷酸
涉及序列表
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发明背景发明领域
本发明涉及具有改善的性质例如改善的稳定性的α -淀粉酶变体，编码该变体的多核苷酸，生产该变体的方法以及使用该变体的方法。
相关技术描述
α -淀粉酶(α -1, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，E. C. 3. 2.1.1)构成一组催化淀粉和其它直链及支链1，4-糖苷寡糖和多糖水解的酶。
α -淀粉酶在商业上用于多种目的，例如在淀粉处理(例如液化)的起始阶段；在湿磨过程中；以及在从碳水化合物来源进行的乙醇生产中。它们还被用作去污剂基质中的清洁剂或佐剂；在纺织工业中用于淀粉脱浆；在烘烤应用中；在饮料工业中；在油田的钻孔过程中；在再循环过程中,例如纸张的脱墨；以及在动物饲料中。发明内容
本发明提供与亲本酶相比具有改善性质的α-淀粉酶变体，例如改善的热稳定性。
本发明涉及分离的亲本α -淀粉酶变体，其包含在对应于位置59，89，91，96，108， 112，129，157，165，166，168，171，177，179，180，181，184，208，220，224，242，254，269，270，2 74，276，281，284，416和427的三个或更多个(数个)位置的取代。
本发明还涉及分离的编码α-淀粉酶变体的多核苷酸，包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及生产亲本α -淀粉酶变体的方法。
本发明还涉及该变体在淀粉处理(例如液化)；湿磨过程；从碳水化合物来源进行的乙醇生产；去污剂；用于餐具洗涤的组合物；纺织工业的淀粉脱浆；烘烤应用；饮料工业； 油田的钻孔过程；再循环过程，例如纸张的脱墨；和动物饲料中的用途。
图1显示了 α-淀粉酶的催化结构域与SEQ ID NOs: 1，2，3，4，5和7的氨基酸序列的比对。SEQ ID NO:1是嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus) α -淀粉酶； SEQ ID Ν0:2 是黄热芽孢杆菌(Bacillus flavothermus)淀粉酶，由 WO 2005/001064 描述的 AMY1048;SEQ ID N0:3 是芽孢杆菌属(Bacillus) α -淀粉酶 TS-22 ;SEQ ID N0:4 是在 J. Appl. Microbiology, 1997, 82:325-334 (SWALL: q59222)中描述的芽孢杆菌属 α -淀粉酶 TS-23 ；SEQ ID NO: 5 是在 WO 20 04/091544 中描述的 α-淀粉酶；以及 SEQ ID NO: 7 是另一种嗜热脂肪芽胞杆菌α-淀粉酶。
发明详述
本发明涉及分离的亲本α -淀粉酶变体，其包含在对应于位置59，89，91，96，108， 112，129，157，165，166，168，171，177，179，180，181，184，208，220，224，242，254，269，270，2 74，276，281，284，416和427的三个或更多个(数个)位置的取代，其中所述变体与SEQ ID NO:1的至少一个成熟多肽具有至少65%且小于100%的序列同一性；并且该变体具有α -淀粉酶活性。
定义
等位变体(Allelic variant):术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
α-淀粉酶(α -1, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，E. C. 3. 2.1.1)是一组催化淀粉和其它直链及支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。
编码序列术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放读码框决定，该开放读码框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并以终止密码子如ΤΑΑ，TAG和TGA结束。编码序列可以是 DNA, cDNA,合成或重组的多核苷酸。
调控序列(Control sequences):术语“调控序列”意指编码本发明变体的多核苷酸表达所必需的所有组分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸序列编码区的连接。
表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体术语“表达载体”意指直链的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
宿主细胞术语"宿主细胞"意指任何对用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等等易感的(susceptible)细胞类型。术语 “宿主细胞”涵盖由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的亲本细胞的任何后代。
改善的性质术语“改善的性质”意指与亲本α -淀粉酶相比改善了的变体有关性质。这些改善的性质包括但不限于变更的依赖于温度的活性谱、热稳定性、PH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。
分离的变体术语“分离的”和“纯化的”意指从至少一种与其天然结合的组分移出的多肽或多核苷酸。例如通过SDS-PAGE测定的，变体可以是至少1%纯，如至少5%纯，至少 10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯和至少90%纯以及通过琼脂糖电泳测定的，多核苷酸可以是至少1%纯，如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯， 至少60%纯，至少80%纯和至少90%纯。
成熟多肽术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N末端加工、C 末端截短、糖基化、磷酸化等等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽是SEQID NO:1的氨基酸1-483、1-486或1-493。本领域中已知宿主细胞可产生由同一多核苷酸表达的两种或更多个种不同的成熟多肽(即具有不同的C末端和/或N末端的氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α -淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。
核酸构建体术语"核酸构建体"意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或以天然本不存在的方式修饰以含有核酸的区段或其为合成的。当所述核酸构建体含有编码序列表达所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
可操作地连接术语“可操作地连接”意指一种将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置的构型，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
亲本术语“亲本” α -淀粉酶意指进行了变更以产生本发明变体的α _淀粉酶。 所述亲本可以是天然产生(野生型)的多肽或由合适的方法制备的其变体。所述亲本也可以是等位变体。
多肽片段术语“多肽片段”意指具有从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个(数个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段含有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少483个氨基酸残基，例如至少486和至少493个氨基酸残基。
序列同一性两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一'I"生”来描述。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是使用如EMBOSS程序包 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，Trends in Genetics 16:276-277)(优选版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)来测定的。 使用的可选参数是缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EBL0SUM62 (BL0SUM62的 EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的
(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite, Rice 等，2000,见上)(优选版本3. 0. O或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法 (Needleman和Wunsch, 1970，见上)测定。使用的可选参数是缺口产生罚分为10，缺口延伸罚分为0. 5，和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle输出(使用_ nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的
(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
亚序列术语“亚 序列(subsequence) ”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’ 端缺失了一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。
变体术语“变体”意指具有α -淀粉酶活性的包含在一个或多个(数个)位置的一个或多个(数个)氨基酸残基的变更，即取代、插入和/或缺失的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指除去占据某位置的氨基酸；而插入意指在占据某位置的氨基酸邻接处且在之后添加1-5个氨基酸。
野生型术语“野生型”意指天然产生的微生物表达的α-淀粉酶，例如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌。
变体的命名规则
就本发明而言，SEQ ID NO:1公开的成熟多肽用于确定另一种α -淀粉酶的相应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中公开的成熟多肽比对，且基于此比对，使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，Trends in Genetics 16:276-277)(优选版本 3. 0. 0 或更新的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)，可以确定对应于SEQ ID NO:1公开的成熟多肽中任意氨基酸残基的氨基酸位置编号。
通过使用“ClustalW”(Larkin 等，2007，Bioinformatics 23:2947-2948)的多个多肽序列的比对，可以确认对另一种α -淀粉酶中相应的氨基酸残基的鉴定。
当其它酶已经从SEQ ID NO:1中的成熟多肽分支出来以致传统的基于序列的比对不能检测它们之间的关系(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J. Mol. Biol. 295:613-615)时， 可以使用其它的配对序列比较算法。使用利用了多肽家族(谱(proble)·)的概率表现 (probabilistic representations)的搜索程序来搜索数据库，可以在基于序列的搜索中获得更高的敏感性。例如，PS1-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程来生成谱，并且能够检测远程同源物(Atschul 等，1997，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个(数个)代表，可以实现甚至更高的敏感性。例如 GenTHREADER(Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287:797-815;McGuffin 和 Jones, 2003, Bioinformatics 19:874-881)的程序利用多种来源的信息(PS1-BLAST、二级结构预测、结构比对谱和溶解电势(solvation potential))作为预测查询序列的结构性折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等，2000，J. Mol. Biol. 313:903-919的方法可以用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型比对。这些比对可以继而用于生成多肽的同源性模型，且可以使用多种为此开发的工具来估定这类模型的精确性。
对于已知结构的蛋白质，已经有数种用于检索(retrieve)和生成其结构性比对的工具和资源。例如，已经结构性比对了蛋白质的SCOP超家族，并且可以进入和下载那些比对。可以使用多种算法来比对两种或更多个的蛋白质结构，例如距离比对矩阵 (distance alignment matrix) (Holm 和 Sander, 1998，Proteins 33:88-96)或组合延伸 (combinatorial extension) (Shindyalov 和 Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747),且还可以利用这些算法的执行在结构数据库中查询目标结构，以发现可能的结构性同源物 (如Holm和Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567)。这些结构性比对可以用于预测同一结构性超家族的蛋白质中结构和功能上对应的氨基酸残基。该信息，连同从同源性建模及谱搜索得来的信息一起，可用于预测在将目标突变从某蛋白质移动到其近程或远程同源物时，应突变哪些残基。
在描述本发明的α-淀粉酶变体时，改编了下述命名法以便于参考。在所有情况下，使用了公认的IUPAC单字符或三字符氨基酸缩写。
取仕。对于氨基酸取代，使用了下列命名法原始氨基酸、位置、取代氨基酸。相应地，在位置226用丙氨酸(alanine)取代苏氨酸(threonine)被命名为“Thr226Ala” 或“T226A”。通过加号(“ +，，)来分开多个突变，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或 “G205R+S411F”，代表分别在位置205和411用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，用苯丙氨酸(F) 取代丝氨酸(S)的突变。
迹失。对于氨基酸缺失，使用了下列命名法原始氨基酸、位置、*。相应地，在位置 195上甘氨酸的缺失被命名为“Glyl95*”或“G195*”。通过加号(“ + ”)来分开多个缺失， 例如 “Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。
通入。对于氨基酸插入，使用了下列命名法原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入的氨基酸。相应地，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被命名为“Glyl95GlyLys”或 “G195GK”。多个氨基酸的插入被命名为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入的氨基酸 #1、新插入的氨基酸#2等等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被指示为 “Glyl95GlyLysAla” 或 “G195GKA”。
在这类情况下，通过在插入氨基酸残基之前的氨基酸残基位置号上添加小写字母，来对插入氨基酸残基编号。如此，在上述实例中序列为
权利要求
1.一种分离的变体α-淀粉酶，其包含在对应于位置59，89，91，96，108，112，129，I 57，165，166，168，171，177，179，180，181，184，208，220，224，242，254，269，270，274，276，2 81，284，416和427中任何的三个或更多个(数个)位置的取代，其中所述变体与SEQ ID NO: 1，2，3，4，5，6和/或7的成熟多肽具有至少65%且小于100%的序列同一性，并且该变体具有α-淀粉酶活性。
2.权利要求1的变体,其包含用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 或Tyr，特别是用Ala, Gin, Glu, Gly, He, Leu, Pro或Thr在对应于位置59的位置的取代； 用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Arg，His或Lys在对应于位置89的位置的取代；用 Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用lie, Leu或Val在对应于位置91的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用lie, Leu或Val在对应于位置96的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala在对应于位置108的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala, Asp或Glu在对应于位置112的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala, Thr或Val在对应于位置129的位置的取代；用 Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用His, Lys, Phe或Tyr在对应于位置157的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Asn在对应于位置165的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr 或Val，特别是用Phe在对应于位置166的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala在对应于位置168的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Glu在对应于位置171的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Arg, Leu或Met在对应于位置177的位置的取代；用 Ala, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Gin, Glu, He, Leu, Lys或Val在对应于位置179的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Ty 或Val，特别是用Glu或Val在对应于位置180的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Glu，Gly或Val在对应于位置181的位置的取代；用 Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr或Val，特别是用Ser在对应于位置184的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Phe或Tyr在对应于位置208的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Pro在对应于位置220的位置的取代；用 Ala, Arg, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Leu在对应于位置224的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala, Asp, Glu, Gln或Met在对应于位置242的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala, Ser或Thr在对应于位置254的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Gln或Glu在对应于位置269的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Leu, Thr或Val在对应于位置270的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Arg, Gin, Glu, Lys或Phe在对应于位置274的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp 或Val，特别是用Phe在对应于位置276的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Asn或Ser在对应于位置281的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用His, Thr或Val在对应于位置284的位置的取代；用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, His, He, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用Ala, Asn, Asp, Ser, Thr或Val在对应于位置416的位置的取代；和/或用 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, His, He, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 或Val，特别是用lie, Met或Val在对应于位置427的位置的取代。
3.权利要求1或2的变体，其包含在对应于位置59，89，91，96，108，112，129，157，165 ，166，168，171，177，179，180，181，184，208，220，224，242，254，269，270，274，276，281，284， 416和427中任何的三个位置，特别是在对应于位置129，177和179或位置220，242和254 的位置的取代。
4.权利要求1-3中任一项的变体，其具有3-20，例如3-10和6_10项变更，诸如3,4,5,6, 7，8，9 或 10 项变更。
5.分离的α-淀粉酶变体，其包含选自下组的取代集或由选自下组的取代集组成 V59A+G108A;S242Q+M284V ；V59A+M284V ；G108A+M284V ；V59A+G108A+M284V ；V59A+G108A+S242Q+M284V;E129V+K177L+R179E;K220P+N224L+Q254S;E129V+K177L+R179E+M284V ；V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+M284V ；V59A+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V ；E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S; V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S; V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V ； V59A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V ； V59A+Q89R+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S+M284V ;和 V59A+G108A+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+S242Q+Q254S+M284V ；其中所述变体与SEQ ID勵:1，2，3，4，5，6和/或7的成熟多肽具有至少65%且小于 100%的序列同一性，并且该变体具有α -淀粉酶活性。
6.权利要求1-5中任一项的变体，其具有3-20，例如3-10和6_10项变更，诸如3,4,5,6, 7，8，9 或 10 项变更。
7.权利要求6的变体，其中所述变更为取代。
8.权利要求1-7中任一项的变体，其进一步包含在对应于位置179，180，181和182的一个或多个，例如两个，三个或四个，位置的缺失。
9.权利要求1-8中任一项的变体，其进一步包含在对应于位置193的位置的取代。
10.权利要求1-9中任一项的变体，其进一步包含在对应于位置376和/或377的位置的缺失。
11.权利要求1-10中任一项的变体,其为选自下组的亲本α-淀粉酶的变体a.与SEQID NO:1, 2，3，4，5，6或7的成熟多肽具有至少60%的序列同一性的多肽；或b.SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6或7的成熟多肽的片段，其具有α -淀粉酶活性。
12.权利要求11的变体，其中所述亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6或7的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%以及100%的序列同一性。
13.权利要求11的变体，其中所述亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6或7 的成熟多肽的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6或7的成熟多肽的氨基酸序列组成。
14.权利要求11的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1, 2，3，4，5，6或7的成熟多肽的氨基酸序列的片段，其中所述片段具有α -淀粉酶活性。
15.权利要求1-14中任一项的变体，其与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65%， 例如至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%,至少99%但小于100%的序列同一性。
16.权利要求1-15中任一项的变体，其中所述变体由483-515、483-493或483-486个氨基酸组成。
17.包含权利要求1-16中任一项的变体和表面活性剂的去污剂组合物。
18.—种组合物，其包含权利要求1-166中任一项的变体和一种或多种选自下组的酶 β -淀粉酶、纤维素酶(β -葡糖苷酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)和内切葡聚糖酶)葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如木聚糖酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、肌醇六磷酸酶、 蛋白酶和支链淀粉酶。
19.权利要求1-16中任一项的变体用于洗漆和/或餐具洗漆(dishwashing)的用途。
20.权利要求1-16中任一项的变体用于使纺织品脱浆的用途。
21.权利要求1-16中任一项的变体用于生产烘焙产品的用途。
22.权利要求1-16中任一项的变体用于液化含淀粉材料的用途。
23.一种生产液化淀粉的方法，其包括用权利要求1-16中任一项的变体液化含淀粉材料。
24.一种生产发酵产物的方法，其包括a.用权利要求1-16中任一项的变体液化含淀粉材料以生产液化醪；b.糖化该液化醪以生产可发酵糖；并c.在发酵生物的存在下发酵该可发酵糖。
25.—种生产发酵产物的方法,其包括将淀粉底物与权利要求1-16中任一项的变体、 葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
26.分离的多核苷酸,其编码权利要求1-16中任一项的变体。
27.包含权利要求26的多核苷酸的核酸构建体。
28.包含权利要求27的核酸构建体的表达载体。
29.包含权利要求27的核酸构建体的宿主细胞。
30.一种生产变体α-淀粉酶的方法，其包括a.在适合该变体表达的条件下培养权利要求29的宿主细胞；并b.从培养基中回收该变体。
全文摘要
本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体。本发明还涉及编码该变体的多核苷酸和包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及使用该变体酶的方法。
文档编号C12N9/28GK103068975SQ201180012225
公开日2013年4月24日 申请日期2011年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者C.安德森, R.戴恩哈默, T.A.波尔森, M.D.托斯卡诺, P.K.汉森, H.弗里斯-马德森, A.维克索尼尔森, S.E.拉森, L.L.H.克里斯滕森 申请人:诺维信公司, 诺维信北美公司