专利名称：α-淀粉酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改进性质，例如，改进的稳定性的α -淀粉酶变体，编码所述变体的多核苷酸，产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。相关领域描述α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一组酶组成,其催化淀粉和其它直链和支链1，4-糖苷寡糖和多肽的水解。α -淀粉酶商业上用于多种目的如在淀粉加工的初始阶段(例如，液化)；在湿磨过程中；和在由糖源产生醇的过程中。它们也用作洗涤剂或洗涤剂基质中的助剂；在纺织业中用于淀粉脱浆；用于烘焙应用中；用于饮料产业；在油田中用于钻探过程中；用于循环过程，例如纸张脱墨；和用于动物饲料。首先使用的一种细菌α -淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也称作Termamyl ，其已经得到广泛表征并已经确定了该酶的晶体结构。碱性淀粉酶，如源自芽孢杆菌属菌种菌株NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513和DSM9375 (披露于WO 95/26397中)的α -淀粉酶，形成了用于洗涤剂的特定的α -淀粉酶组。已经对很多这些已知的细菌淀粉酶进行了修饰，以改进它们在具体应用中的功能性。Termamyl 和很多高效α -淀粉酶的活性都需要钙。Termamyl 的晶体结构显示三个钙原子通过带负电荷的氨基酸残基配位结合于α-淀粉酶结构。对于钙的需要在存在强螯合化合物的应用，如在洗涤剂或从全谷物产生乙醇的过程中是缺点，在这些过程中植物材料包含大量天然螯合剂如肌醇六磷酸。已知钙不敏感淀粉酶，例如，EP 1022334和WO 03/083054中披露的α -淀粉酶，和具有UNIPROT :Q03657中所披露序列的环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) α-淀粉酶。因此提供钙敏感性降低的α -淀粉酶是有益的。
发明内容
本发明提供包含钙敏感α -淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α _淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，其中所述A-结构域与SEQ ID NO: 1_12、29和30的A-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。本发明提供包含钙敏感α -淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α _淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α -淀粉酶的C-结构域，其中所述C-结构域与SEQ ID NO: 1-12,29和30的C-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。本发明还涉及编码α -淀粉酶变体的分离的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，和产生亲本α -淀粉酶的变体的方法。
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本发明还涉及所述变体在淀粉加工(例如，液化)；湿磨过程；由糖源产生醇；洗涤剂；餐具洗涤组合物；纺织业中的淀粉脱浆；烘焙应用；饮料工业；油田钻探过程；循环过程，例如，用于纸张脱墨，和动物饲料中的用途。附图
简述图I 显示 SEQ ID NO: 1-16、29 和 30 的比对。发明详述本发明提供包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α -淀粉酶的C-结构域的α -淀粉酶变体，其中所述A-结构域与SEQ IDNO: 1-12,29和30的A-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。本发明还提供包含钙敏感α -淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α -淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α -淀粉酶的C-结构域的α -淀粉酶变体，其中所述C-结构域与SEQ IDNO: 1-12,29和30的C-结构域中的任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性。定义Α、Β和C-结构域α -淀粉酶的结构包含三个不同的结构域Α、Β和C，参见，例如，Machius等，1995，J. Mol. Biol. 246:545-559。术语“结构域”指多肽的区域，其自身形成整个分子的独特而独立的亚结构。α-淀粉酶由携带活性位点的β/α-8桶状结构，其记为A-结构域；β -片层3和α -螺旋3之间相当长的环状结构，其记为B-结构域；和C-结构域组成，并且在某些情况下还包含糖结合域(例如，W02005/001064 ；Machius等，见上文)。α -淀粉酶的结构域可以通过结构分析，如使用结晶技术确定。用于确定α -淀粉酶的结构域的一种可选方法是将α-淀粉酶的氨基酸序列与结构域已确定的另一种α_淀粉酶进行序列比对。与例如已经确定了 B-结构域的α -淀粉酶中的B-结构域序列对齐的序列可以视为给定α -淀粉酶的B-结构域。等位变体(allelic variant):术语“等位变体”指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。钙不敏感淀粉酶指对于最佳活性和/或保持活性构型/结构不需要钙的存在的α -淀粉酶。钙敏感淀粉酶指需要钙的存在而保持其结构和/或具有完全酶活性的α -淀粉酶。对于一些钙敏感淀粉酶而言，已经显示它们在活性构型中包含与酸性氨基酸残基配位的钙原子。已知大量钙敏感α-淀粉酶，并且由于其有益的性质已经在工业上使用。钙敏感α-淀粉酶通常对于导致在其结构中配位的钙原子丢失的条件(如洗涤剂组合物和燃料物质)敏感。钙敏感性可通过如下确定在存在强螯合剂的情况下温育α -淀粉酶，并分析这种温育对α-淀粉酶的活性或稳定性的影响。在存在螯合剂的情况下钙敏感α-淀粉酶较不稳定或者在温育过程中丢失大部分或全部活性，而钙不敏感α-淀粉酶在温育过程中不丢失其全部活性或仅丢失少部分活性。可以使用本领域已知的方法评价螯合剂强度，如 Nielsen 等,2003, Anal. Biochem. 314:227-234 ;和 Nagarajan 和 Paine, 1984, J. Am. OilChem. Soc. 61 (9) : 1475-1478中所披露的方法。可用于这种测定法的强螯合剂的实例是EGTA (乙二醇四乙酸)、EDTA (乙二胺四乙酸)、DTPA ( 二亚乙基三胺五乙酸)、DTMPA ( 二亚乙基三胺-五-亚甲基膦酸)和HEDP (I-羟基乙-1，I-二基双膦酸)。可以使用其它强螯合剂确定α-淀粉酶的钙敏感性。编码序列术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或其他起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。调控序列(control sequence):术语“调控序列”意指对编码本发明变体的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码变体的多核苷酸编码区的连接。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，所述后代由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。改进的性质术语“改进的性质”指与变体相关的特性，所述特性与其它α -淀粉酶相比得到改进。这种改进的性质包括，但不限于，改变的温度依赖性活性概貌，热稳定性，PH活性，pH稳定性，底物特异性，产物特异性，和化学稳定性。分离的变体术语“分离的”和“纯化的”意指从与其天然相关的至少一种组分移出的多肽或多核苷酸。举例而言，变体如通过SDS-PAGE测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，和至少90%纯，而多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，可为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。成熟多肽术语“成熟多肽”意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。本领域中已知宿主细胞可产生两种或更多种由相同多核苷酸表达的不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α -淀粉酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。核酸构建体术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区CN 102918150 A
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明
说
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段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。可操作地连接术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽的编码序列的表达。 亲本术语“亲本”α -淀粉酶指对其进行改变而产生本发明的变体的α -淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽，或者其变体，通过任何适当的手段制备。例如，亲本多肽可以是天然存在的多肽的变体，其具有修饰或改变的氨基酸序列。亲本还可以是等位变体。多肽片段术语“多肽片段”指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。在一个方面，片段包含至少481个氨基酸残基，例如，至少483，至少486，和至少493个氨基酸残基。序列同一性参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOS S:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice等,2000, Trends Genet. 16:276-277),优选3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970，J. Mol. Biol. 48:443-453)来确定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty) 10,缺口延伸罚分(gap extensionpenalty) 0. 5 和 EBL0SUM62 (BL0SUM62 的 EMBOSS 版)取代矩阵。使用 Needle 标记为“最高同一'性(longest identity) ”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一'性百分比,并计算如下(同样的残基X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000，见上文)，优选3. 0. 0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970，见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0. 5和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)亚序列术语“亚序列(subsequence) ”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有α-淀粉酶活性的多肽片段。变体术语“变体”意指具有α -淀粉酶活性的多肽，其包含改变，即在一个或多个(几个)位置的取代、插入和/或缺失一个或多个(几个)氨基酸残基。取代意指用不同的氨基酸取代占据某位置的氨基酸；缺失意指去除占据某位置的氨基酸；而插入意指邻接于占据某位置的氨基酸添加一个或多个(几个)氨基酸，例如1-5个氨基酸。野生型术语“野生型”意指由天然存在的微生物，如自然界中的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。变体的命名规则
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就本发明而言，除非另外指出，否则使用SEQ ID N0:27中披露的杂合多肽(其具有嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO: 4)的氨基酸1_104，之后是环状芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO: 13)的氨基酸103-208，之后是嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶(SEQ ID NO:4)的氨基酸211-515的序列)确定在另一个α -淀粉酶中对应的氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 27中披露的成熟多肽比对，并且根据比对结果，可以使用如在 EMBOSS 软件包(EMB0SS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Rice 等，2000，Trends Genet. 16:276-277)的 Needle 程序，优选 3. 0. 0版本或更新版本中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol.Biol. 48:443-453)确定与SEQ ID NO:27中披露的成熟多肽中任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。可使用“ClustalW”(Larkin 等，2007，Bioinformatics 23:2947-2948)通过多个多肽序列的比对来确认另一种α-淀粉酶中相应氨基酸残基的鉴定。当其它酶与SEQ ID NO: 27的成熟多肽差异较大从而传统的基于序列的比较不能检测它们之间的关系时(Lindahl 和 Elofsson, 2000，J. Mol. Biol. 295:613-615)，可以使用其它逐对序列比较算法。使用利用多肽家族(谱)的概率代表搜索数据库的搜索程序，可在基于序列的搜索中获得更高的灵敏度。例如，PSI-BLAST程序通过迭代的数据库搜索过程产生谱，并且能检测关系较远的同源物(Atschul等，1997，Nucleic AcidsRes. 25:3389-3402)。如果多肽家族或超家族在蛋白质结构数据库中有一个或多个(几个)代表，则可以实现甚至更高的灵敏度。程序如GenTHREADERCJones，1999，J. Mol.Biol. 287:797-815;McGuffin 和 Jones, 2003，Bioinformatics 19:874-881)利用来自多种来源的信息(PSI-BLAST，二级结构预测，结构比对谱，和溶解势)作为神经网络的输入，所述网络可预测所查询序列的结构折叠。类似地，可以使用Gough等，2000，J. Mol.Biol. 313:903-919的方法比对未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型。然后可以使用这些比对结果产生多肽的同源性模型，并且可以使用专门开发的多种工具评价这类模型的精确度。对于已知结构的蛋白质，几种工具和资源可用于获取和产生结构比对。例如，已经比对了蛋白质的SCOP超家族的结构，并且这些比对结果可以获取和下载。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(Holm 和 Sander, 1998，Proteins33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne, 1998, Protein Eng. 11:739-747)比对两个或更多个蛋白质的结构，并且执行这些算法还能用于查询具有目的结构的结构数据库以发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park, 2000, Bioinformatics 16:566-567)。可以使用这些结构比对在相同的结构超家族内的蛋白质中预测结构和功能上相应的氨基酸残基。这种信息，连同来自同源性建模和谱搜索的信息，可以用于预测在将感兴趣的突变从一个蛋白质移动至关系接近或遥远的同源物时要突变哪些残基。在描述本发明的各种α -淀粉酶变体时，为便于提述，采用下述命名法。在所有情况下，应用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。取代。对于氨基酸取代，使用下述命名法原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置226用丙氨酸取代苏氨酸表示为“Thr226Ala”或“Τ226Α”。多个突变用加号(“ + ”)分隔，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，代表在位置205和411的突变，分别用精氨酸(R)取代甘氨酸(G)，和用苯丙氨酸(F)取代丝氨酸(S)。缺失。对于氨基酸缺失，使用下述命名法原始氨基酸、位置*。因此，在位置195的甘氨酸的缺失表示为“Glyl95*”或“G195*”。多个缺失用加号(“ + ”)分隔，例如，“Glyl95*+Ser411*，，或 “G195*+S411*，，。通入。对于氨基酸插入，使用下述命名法原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸。因此在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸表示为“Glyl95GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、新插入氨基酸#1、新插入氨基酸#2等]。例如，在位置195的甘氨酸后面插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Glyl95GlyLysAla”或“G195GKA”。在这种情况下，通过在插入氨基酸残基前面的氨基酸残基位置编号后加小写字母为插入的氣基酸残基编号。因此在上述实例中序列为
权利要求
1.一种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α-淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，所述A-结构域与SEQ ID NO: 1-12.29和30的A-结构域中任一个具有至少70%并且低于100%的序列同一性，其中所述α -淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
2.—种分离的α-淀粉酶，其包含钙敏感α-淀粉酶的A-结构域，钙不敏感α -淀粉酶的B-结构域，和钙敏感α-淀粉酶的C-结构域，所述C-结构域与SEQ ID NO: 1-12.29和30的C-结构域中任一个具有至少70%和低于100%的序列同一性，其中所述α -淀粉酶具有α-淀粉酶活性。
3.权利要求1-31中任一项的α-淀粉酶，其中在对应于位置8的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Leu。在对应于位置27的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Gln0在对应于位置34的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Lys0在对应于位置52的位置的氨基酸是除下述氨基酸之外的任何氨基酸:Ala、Asn、Asp、Cysλ Glnλ Gluλ Glyλ Hisλ lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Gly。在对应于位置53的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Tyr0在对应于位置59的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 或 Tyr，例如 Ala。在对应于位置80的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr 或 Val，例如，Asp0在对应于位置86的位置的氨基酸是Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Ser0在对应于位置90的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Ser0在对应于位置91的位置的氨基酸是Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Leu0在对应于位置 100 的位置的氨基酸是 Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Gly 或 Leu0在对应于位置 204 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Leu0在对应于位置 206 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 或 Val，例如，Met。在对应于位置 220 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Pro。在对应于位置 222 的位置的氨基酸是 Ala.Ai'g.AsrKAsp.Cys.GlrKGliKGly.His.Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp 或 Val，例如，Val。在对应于位置 224 的位置的氨基酸是 Ala.Ai'g.Asp.Cys.GlruGliuGly.His.Ileaeu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Leu0在对应于位置 235 的位置的氨基酸是 Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Thr 或 Trp0在对应于位置 242 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Gln 或 Glu0在对应于位置 244 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Tyr0在对应于位置 245 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Ala 或 Lys0在对应于位置 270 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Leu0在对应于位置 282 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Trp0在对应于位置 284 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Gin、Thr 或 Val。在对应于位置 301 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Lys0在对应于位置 303 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Arg0在对应于位置 304 的位置的氨基酸是 Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Asp0在对应于位置 307 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Leu。在对应于位置 348 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Thr0在对应于位置 386 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Gin、Glu、Thr 或 Val。在对应于位置 388 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，lie 或 Val。
4.权利要求1-165中的任一项α-淀粉酶，其中在对应于位置 407 的位置的氨基酸是 Ala.Ai'g.Asp.Cys.GlruGliuGly.His.Ileaeu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Asp0在对应于位置 430 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、HiS、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Asp0在对应于位置 432 的位置的氨基酸是 Ala.Ai'g.AsrKCys.GlrKGliKGly.His.Ileaeu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr 或 Val，例如，Pro。在对应于位置 459 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Trp、Tyr 或 Val，例如，Pro。在对应于位置 475 的位置的氨基酸是 Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser> Trp> Tyr 或 Val，例如，Gln 或 Lys。
5.一种洗涤剂组合物，其包含权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶和表面活性剂。
6.一种组合物，其包含权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶和选自下组的一种或多种酶β -淀粉酶，纤维素酶(β -葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)，葡糖淀粉酶，半纤维素酶(例如，木聚糖酶)，异淀粉酶，异构酶，脂肪酶，肌醇六磷酸酶，蛋白酶和支链淀粉酶。
7.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于洗涤和/或餐具洗涤的用途。
8.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于将纺织品脱浆的用途。
9.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于产生烘焙产物的用途。
10.权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶用于将含淀粉材料液化的用途。
11.一种产生液化淀粉的方法，所述方法包括用权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶液化含淀粉材料。
12.—种产生发酵产物的方法，包括a.用权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶液化含淀粉材料以产生液化醪；b.将液化醪糖化以产生可发酵糖；和c.在存在发酵生物的情况下发酵可发酵糖。
13.—种产生发酵产物的方法，所述方法包括将淀粉底物与权利要求1-4中的任一项α -淀粉酶、葡糖淀粉酶和发酵生物接触。
14.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-4中的任一项α-淀粉酶。
15.包含权利要求14的多核苷酸的核酸构建体。
16.—种表达载体,其包含权利要求15的核酸构建体。
17.一种宿主细胞，其包含权利要求15的核酸构建体。
18.一种用于产生α-淀粉酶的方法，其包含a.在适合表达α-淀粉酶的条件下培养权利要求17的宿主细胞；和b.从培养基回收α-淀粉酶。
全文摘要
本发明涉及α-淀粉酶变体，编码所述变体的多核苷酸和包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用所述变体酶的方法。
文档编号C12N9/28GK102918150SQ201180012231
公开日2013年2月6日 申请日期2011年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者C.安德森, T.A.波尔森 申请人:诺维信公司, 诺维信北美公司