区分fecv和fipv的工具和方法

专利名称：区分fecv和fipv的工具和方法
技术领域：
本发明涉及兽医诊断领域，更具体地本发明涉及猫冠状病毒及其鉴定的领域。
背景技术：
猫冠状病毒(FCoV)是家养和非家养猫科动物(包括但并不限制于猫、狮子、老虎、豹、美洲虎、猞猁、狞猫、猎豹、美洲狮和薮猫(serval))中常见的病原体。在家养多只猫的环境中可达90%的FCoV血清反应阳性。FCoV与犬冠状病毒(CCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)密切相关。FCoV存在两种血清型(I型和II型)，其中I血清型是主要的、占FCoV感染的80 95%。II型FCoV可能由在被I血清型FCoV和CCoV双重感染的动物中的RNA重组造成，其中CCoV的纤突基因(spike gene)或其部分并入FCoV的基因组中(这显然是很少发生的事件)。猫肠道冠状病毒(FECV)在I血清型和II血清型的FCoV中均为最常见 的病原体。FECV主要限于肠道内，经由口-粪途径传播，且是高传染性的。FECV感染通常不明显地发生；但有时FECV引起诸如轻微肠炎的症状(Haijema等，2007)。在二十世纪七十年代，报道了一种在猫中罕见但严重的疾病猫传染性腹膜炎(FIP)，是由被称为猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的猫冠状病毒引起的。与FECV相反，FIPV是高毒性的。FIPV感染可为肉芽肿(干的)或流出型(湿的)，且FIPV感染是进行性的且通常致命的疾病。FIP的症状包括幼猫未能存活、跛行、波动发烧、食欲不振和体重减轻，最终会导致死亡(Pedersen 2009)。如高丙种球蛋白血症及淋巴和外周T细胞缺失所显示的自适应免疫系统的显著失调伴随FIP的发展(Haijema等，2007)。然而FECV限于肠道内，FIPV能够感染单核细胞和巨噬细胞，且能够在单核细胞和巨噬细胞中复制，从而引起使多器官被感染的系统性疾病。存在两种关于FIPV起源的流行理论。根据“突变假说”，FIPV通过被感染的猫科动物中的新生突变而起源于FECV，产生高毒性的FIP病毒。虽然还未鉴定出产生FIPV的突变，但已提出该突变存在于编码未知功能的非结构基因3c、7a或7b中(见图I) (Vennema等，1998，Poland 等，1996，Kennedy 等，2001，Pedersen 2009)。因此认为在 3c、7a 或 7b 基因中的突变或在这些基因中的突变重组改变了病毒的生物学特性，允许肠道冠状病毒感染单核细胞和巨噬细胞，从而将感染传播至多个器官且引起FIP (Pedersen 2009) :FECV至FIPV的转变。但突变假说还没未被正式证明。根据另一种理论，两种不同类型的FECV (毒性和无毒性类型)在自然群体中传播，且只有被毒性类型感染的猫科动物才会发生FIP (Brown等，2009)。Brown等(2009)从患有FIP和被FECV感染但无症状(健康)的猫中分离了病毒序列。使用系统发育分析，他们发现在患病猫和健康猫中存在不同的病毒序列。Dye和Siddell (2007)比对了从患有FIP的猫的空肠和肝脏中分离的猫冠状病毒的病毒序列。根据突变理论，FECV限制于肠道内，而能够感染单核细胞和巨噬细胞的FIPV存在于肝脏中。迄今为止，Dye和Siddell发现100%的核苷酸一致性，因此对突变假说提出质疑，因为根据该突变假说肝脏的冠状病毒是突变的空肠冠状病毒。他们提出在患有FIP的猫的肝脏和空肠中存在相同的毒性猫冠状病毒株。之前，本发明人已在组织培养适应性的II血清型猫冠状病毒FECV79-1683和FIPV79-1146的纤突蛋白中鉴定了很多不同(Rottier等，2005)。FIPV 79-1146在纤突蛋白的C末端结构域(S2结构域)中包含几个突变。但是FECV79-1683和FIPV79-1146不是典型的猫冠状病毒，因此不是大部分猫被感染的I血清型FECV和FIPV的代表(Pedersen2009)。首先，II血清型猫冠状病毒源自犬和猫冠状病毒的RNA重组，且II血清型猫冠状病毒包含犬冠状病毒的纤突蛋白。猫和犬冠状病毒的纤突蛋白仅具有约45%的氨基酸序列一致性(Motokawa等，1996)。其次，FECV79-1683和FIPV79-1146是对非巨噬细胞的细胞系的组织培养适应性的。因为FIPV在体内感染单核细胞和巨噬细胞，这些实验室菌株的嗜性(tropism)与典型的猫冠状病毒不同。第三，与感染单核细胞和巨噬细胞的I血清型FIPV不同，FIPV79-1146通过感染的所有常见途径而具有异常毒性(Pedersen 2009)。第四，如Pedersen在他最近的综述中所全面讨论的，FECV79-1683不能具有真正FECV的资格(Pedersen 2009)。值得注意的是，FECV79-1683缺少存在于FECV的非组织培养适应性株系中的7b基因的大部分，且FECV79-1683在它的3c基因中具有有害突变，这表明·FECV79-1683 可能源自 FIPV。通常通过血液中抗体的存在来证明受到猫冠状病毒感染。但没有对FIPV感染的有效治疗方法或疫苗。在干或肉芽肿型FIP的情况下，患FIP的猫在几天或几个星期(在流出型FIP的情况下)内死亡，或在几个月内(在干式FIP或湿式FIP的情况下)死亡。在许多免疫研究中还未令人信服地证明由FIPV株的温度敏感突变株组成的市场上可买到的疫苗具有保护疗效(McArdle等，1995 ；Fehr等，1997)。进一步地，到目前为止没有诊断试验来区分FECV和FIPV。又一复杂因素是FIP的临床图片是高度可变的，因此不能明确的确定疾病。诊断经常是基于既往症、临床和非特异性实验室参数作出的推测性诊断。因为没有针对FIPV的特异性诊断试验，因此还经常不能区分FIP和具有部分相同症状的其它疾病。由于FIP的愈来愈严重和衰竭性过程，因此极需要针对FIPV的诊断试验和抗FIPV的疫苗。

发明内容
本发明的目的是提供区分FIPV和FECV的工具和方法。本发明人发现FIPV在纤突蛋白的氨基酸第1049位处具有相对于FECV的特异性改变，如图2B所示。因此，本发明提供了一种鉴定猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括确定猫冠状病毒纤突蛋白在对应于氨基酸第1049位(如图2B所示)的位置处的氨基酸本体；且如果该确定的氨基酸本体不是甲硫氨酸，则鉴定该猫冠状病毒为FIPV。根据本发明的该方法，如果确定的该氨基酸本体是甲硫氨酸，则鉴定为FECV。鉴定FIPV或FECV是指毒性(FIPV)或无毒性(FECV)型猫冠状病毒的鉴定。通过确定所述猫冠状病毒的氨基酸本体(identity)和/或核酸序列来进行鉴定。猫冠状病毒的核酸序列包括核苷酸链，优选为(c) DNA或RNA，该核苷酸链为猫冠状病毒的一部分，或直接或通过处理例如使用逆转录PCR和/或扩增后从猫冠状病毒获得。猫冠状病毒的纤突蛋白是包括胞外结构域的猫冠状病毒膜蛋白。纤突蛋白是冠状病毒四个标准结构蛋白中的一个，且负责在感染过程中的病毒结合并进入细胞。将来自患有经病理学确定的FIP的猫的病灶(lesion)的FIPV与来自无症状的猫的FECV进行基因比对。FIP的典型病灶是在内脏器官，主要是在脾脏、肝脏、肺、肾脏或肠系膜淋巴结中存在的(脓)肉芽肿性病灶。由于RNA病毒的高突变率，会在单个FECV和FIPV序列之间观察到很多不同。但是，在所有47个FECV粪便或血浆分离物中，如图2B所示，纤突蛋白的第1049位氨基酸为甲硫氨酸，而在54个FIPV病灶分离物中的52个中存在如图2B所示的第1049位氨基酸的改变，从而在该位置出现不是甲硫氨酸的氨基酸。后来发现被归类为源自健康猫的五个序列实际上为源自已证实患有FIP的猫的血液样品(Q093501030_326B_4546. scf、Q093501032_327B_4546. scf, Q093501036_321S_4546. scf、Q093501038_321A_4546. scf 和 Q093501046_K11_019. abI)，这意味着在来自健康猫的 FECV粪便或血浆分离物的42个(而不是47个)样品中确定且证明在对应于如图2B所示的第1049位的位置处的氨基酸为甲硫氨酸。编码FECV纤突蛋白第1049位的甲硫氨酸的核酸序列对应于包括编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的第3145、3146和/或3147位核苷酸(如图2A所示)的密码子。如图2A 所示，编码位于FECV纤突蛋白第1049位的甲硫氨酸的核苷酸序列为腺嘌呤-胸腺嘧啶-鸟嘌呤(a-t-g)，其中a-t-g与病毒基因组RNA中的腺嘌呤-尿嘧啶-鸟嘌呤(a_u-g)对应。该核苷酸密码子中至少一个核苷酸的任意取代均导致在如图2B所示的FECV纤突蛋白第1049位出现不是甲硫氨酸的氨基酸。根据本发明，将编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145、3146和/或3147位，及氨基酸第1049位(分别如图2A和2B所示)的经鉴定的核苷酸和/或氨基酸序列用于区分FIPV和FECV。使用本发明，已第一次在典型的I血清型FECV和FIPV中鉴定了能够区分FECV和FIPV的猫冠状病毒的多态性。本发明人进一步发现相对于FECV在纤突蛋白氨基酸第1049位(如图2B所示)处不包含特异性改变的小部分FIPV中的显著部分包含相对于FECV在纤突蛋白氨基酸第1051位(如图2B所示)的位置处的特异性改变。在这些情况中，在该位置处的丝氨酸显示出被取代。因此在氨基酸第1051位的位置处的特异性改变也提供了鉴定FIPV的途径。因此，本发明还提供了一种用于鉴定猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括确定猫冠状病毒纤突蛋白在对应于氨基酸第1051位的位置处(如图2B所示)的氨基酸本体；且如果该确定的氨基酸本体不是丝氨酸，则鉴定该猫冠状病毒为FIPV。还提供了一种用于确定样品中是否存在猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括确定所述样品是否包括猫冠状病毒；且如果存在猫冠状病毒，则确定所述猫冠状病毒纤突蛋白在对应于氨基酸第1051位的位置处(如图2B所示)的氨基酸本体；且如果所述氨基酸不是丝氨酸，则确定存在FIPV。在一组97只病理学确定患有FIP的猫中，在97个FIPV病灶分离物中的87个中存在第1049位氨基酸(如图2B所示)的改变，从而在该位置处产生不是甲硫氨酸的氨基酸。在其中甲硫氨酸存在于第1049位(如图2B所示)的10个FIPV病灶分离物中的5个中，存在第1051位氨基酸(如图2B所示)的改变，从而在该位置处产生不是丝氨酸的氨基酸。编码FECV纤突蛋白第1051位丝氨酸的核酸序列对应于包括编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3151、3152和3153位的密码子。由核苷酸密码子t/u-c-t/u、t/u-c-c、t/u-c-a、t/u-c-g、c-g-t/u 和 c_g_c 编码丝氨酸。在产生不同于这些密码子的核酸序列的该核苷酸密码子中的一个或多个核苷酸的任意取代均导致在FECV纤突蛋白第1051位出现不是丝氨酸的氨基酸，如图2B所示。根据本发明，位于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3151、3152和/或3153位的任一位置，和/或纤突蛋白氨基酸第1051位(分别如图2A和2B所示)的经鉴定的核苷酸和/或氨基酸序列也用于区分FIPV和FECV。在优选实施方式中，在对应于氨基酸第1051位的位置处的丝氨酸的改变(如图2B所示)是在对应于核苷酸第3151位的位置处的核碱基胸腺嘧啶(如图2A所示)被核碱基鸟嘌呤替换的结果。在一个实施方式中，在猫冠状病毒纤突蛋白中对应于氨基酸第1049和1051位(如图2B所示)的位置处的氨基酸本体均被确定。如果这些氨基酸本体均被确定，则获得区分FIPV和FECV的高准确性。在一个实施方式中，在一个试验中确定第1049和1051位的氨基酸本体(如图2B所示)。然而，还可以依次确定这些氨基酸本体。例如，首先确定对应于第1049位的位置处的氨基酸本体(如图2B所示)。如果在该位置处检测到甲硫氨酸的存在，则接着优选确定对应于第1051位的位置处的氨基酸本体(如图2B所示)。如果在该位置处检测到不是甲硫氨酸的氨基酸的存在，则可省略确定对应于第1051位的位置处的氨基酸本体(如图2B所示)。然而，既然那样，也可以确定第1051位的位置处的氨基酸 本体。图2A中显示了猫冠状病毒纤突基因的核酸序列(核苷酸I 4407)，包括如在基因登录号NC_012955 (猫冠状病毒UU10，全基因组)的序列中所定义的核苷酸20395 24801和如在基因登录号NC_012952(猫冠状病毒UU8，全基因组)的序列中所定义的核苷酸20382 24788。NC_012955的核苷酸20395 24801编码猫冠状病毒纤突蛋白(YP_003038574)。NC_012952的核苷酸20382 24788编码猫冠状病毒纤突蛋白(ΥΡ_003038543)。因此如说明书全文所使用的及如图2Α中所示的，编码纤突蛋白的基因的第3145、3146和3147位核苷酸对应于如在NC_012955的序列中所定义的全基因组的第23539,23540和23541位核苷酸，和/或如在NC_012952的序列中所定义的全基因组的第23526,23527和23528位核苷酸。如说明书全文所使用的及如图2Α中所示的，编码纤突蛋白的基因的第3151、3152和3153位核苷酸对应于如在NC_012955的序列中所定义的全基因组的第23545、23546和23547位核苷酸，和/或如在NC_012952的序列中所定义的全基因组的第23532、23533和23534位核苷酸。图2Β中显示了猫冠状病毒纤突蛋白的氨基酸序列，其引用为NC_012955和NC_012952部分翻译产物的ΥΡ_003038574和ΥΡ_003038543的序列中所定义的氨基酸编号。如说明书全文所使用的，氨基酸位置的编号引用在ΥΡ_003038574和/或ΥΡ_003038543中定义的氨基酸位置。例如使用比对软件诸如“Align 2”或“Bioconductor”，技术人员能够在任意给定的猫冠状病毒序列中鉴定对应于核苷酸第3145、3146和/或3147位和氨基酸第1049位，及核苷酸第3151、3152和/或3153位和氨基酸第1051位(如图2A或2B所示)的核苷酸和氨基酸的位置。FIP的症状包括例如在腹腔内腹水的积聚(仅在流出型FIP中)、生长阻滞、食欲不振、发烧、体重减轻和腹泻。如本文上面所示的，在患有其它疾病的猫中也观察到相似的症状，从而使得至今还不可能对FIP进行明确诊断。既然已鉴定了猫冠状病毒纤突蛋白的多态性，就能确定样品中FIPV的存在，这样可确定猫科动物例如猫是否患有FIP。因为目前没有针对FIP的治疗，且该疾病病程是进行性和衰竭性的，从而必然导致死亡，因此当已证明该动物携带FIPV时，可决定使所述猫安乐死。此外，猫或猫舍的所有者可采取适当的措施以防止可能的感染传播和/或减少诱发情况诸如紧张。然而，当已证明猫体内不存在FIPV时，则作为可能的疾病原因可排除猫传染性腹膜炎。因此，在这种情况下，应不使猫安乐死，但诊断途径可继续，且为该动物提供对其症状与FIP症状相似的可选择的可能疾病的治疗。这样的治疗例如可为进一步的症状治疗或应用抗生素以抵抗疾病可能的细菌原因。因此本发明进一步提供了一种用于确定样品中是否存在猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括优选从猫科动物或从已与猫科动物接触的物质中确定所述样品是否包括猫冠状病毒；且如果存在猫冠状病毒，则确定所述猫冠状病毒纤突蛋白对应于氨基酸第1049和/或1051位的位置处(如图2B所示)的氨基酸本体；且如果在氨基酸第1049位的氨基酸不是甲硫氨酸和/或如果在氨基酸第1051位的氨基酸不是丝氨酸，则确定存在FIPV0
可直接或间接地从任意猫科动物中获得包括猫肠道冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒，猫冠状病毒(纤突)蛋白或猫冠状病毒核酸的样品。可例如从任意猫科动物的组织或体液或排泄物中获得这样的样品。从中获得这样样品的猫科动物的组织、体液或排泄物包括但并不限于FIP病灶、血液、白血球、血浆、血清、唾液、腹水、尿液、粪便、皮肤、肌肉、淋巴结和肝脏。从猫科动物直接获得的根据本发明的样品可包括包含猫科动物组织、体液或排泄物的任何材料，例如泥土(soil)或猫砂。在本发明的优选实施方式中，从FIP病灶、粪便、血液和/或腹水获得样品。在更优选的实施方式中，从白血球获得样品。相对容易从动物获得血液样品，且随后容易地从血液样品中分离出白血球。本发明人发现在由猫获得的FIP病灶样品中检测到对应于氨基酸第1049位的位置处的氨基酸(如图2B所示)改变的31个白血球样品中的29个中，在白血球样品中也存在所述氨基酸的改变。因此，在猫科动物白血球样品中可准确检测氨基酸的改变。当怀疑猫科动物患有猫冠状病毒感染时，可在来自所述猫科动物的样品中检测编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸，据此该核酸包括核苷酸第3145、3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和/或3153位(如图2A所示)。来自所述猫科动物的样品可包括猫冠状病毒核酸或分离的猫冠状病毒核酸。可选择地，在检测前扩增包括编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145、3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和/或3153位(如图2A所示)的猫冠状病毒核酸。根据本发明的样品可进一步包括猫冠状病毒，或包括但并不限于纤突蛋白的猫冠状病毒蛋白。根据本发明，在对应于猫冠状病毒氨基酸第1049位的位置处(如图2B所示)的甲硫氨酸的存在表明为FECV，而在所述位置处的不是甲硫氨酸的其它任何氨基酸的存在表明为FIPV。因此,在对应于猫冠状病毒氨基酸第1049位的位置处(如图2B所示)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸的存在表明为FIPV0在本发明的优选实施方式中，不是甲硫氨酸的所述氨基酸是亮氨酸。在对应于猫冠状病毒氨基酸第1051位的位置处(如图2B所示)的不是丝氨酸的任何氨基酸的存在表明为FIPV。因此，在对应于猫冠状病毒氨基酸第1051位的位置处(如图2B所示)的丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或缬氨酸的存在表明为FIPV。在本发明的优选实施方式中，不是丝氨酸的所述氨基酸是丙氨酸。在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145位(如图2A所示)的位置处的核碱基腺嘌呤(a)的存在、在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3146位(如图2A所示)的位置处的核碱基胸腺嘧啶(t)的存在和在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3147位(如图2A所示)的位置处的核碱基鸟嘌呤(g)的存在表明为FECV，且在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145位(如图2A所示)的位置处的不是腺嘌呤(a)的任何核碱基的存在，和/或在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3146位(如图2A所示)的位置处的不是胸腺嘧啶(t)的任何核碱基的存在，和/或在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3147位(如图2A所示)的位置处的不是鸟嘌呤(g)的任何核碱基的存在表明为FIPV。因此，在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145位(如图2A所示)的位置处的核碱基胸腺嘧啶(t)、和/或胞嘧啶(C)、和/或鸟嘌呤(g)的存在，和/或在对应于编码猫冠状病毒纤 突蛋白的基因的核苷酸第3146位(如图2A所示)的位置处的核碱基腺嘌呤(a)、和/或胞嘧啶(c)、和/或鸟嘌呤(g)的存在，和/或在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3147位(如图2A所示)的位置处的核碱基腺嘌呤(a)、和/或胸腺嘧啶(t)、和/或胞嘧啶(c)的存在表明为FIPV。猫冠状病毒是RNA病毒。因此，当本文确定的核碱基为胸腺嘧啶时，如本领域的技术人员所知的所述术语也包括尿嘧啶。因此，本发明提供了一种根据本发明的方法，其中通过确定编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸的核酸序列来确定第1049位的氨基酸本体，所述核酸包括位于或对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的第3145、3146和/或3147位(如图2A所示)的核苷酸。在优选实施方式中，在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145位(如图2A所示)的位置处为胞嘧啶或胸腺嘧啶或鸟嘌呤表明为FIPV，且在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145位(如图2A所示)的位置处为腺嘌呤表明为FECV。本发明还提供了一种根据本发明的方法，其中通过确定编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸的核酸序列来确定第1051位的氨基酸本体，所述核酸包括位于或对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的第3151、3152和/或3153位(如图2A所示)的核苷酸。冠状病毒是RNA病毒。可使用本领域已知的方法分离和处理病毒RNA。例如，可在收集的时侯从细胞或组织中新鲜制备RNA样品，或从储存在-7 (TC直至样品制备处理的样品中制备RNA样品。可选择地，可在保持RNA质量的条件下保存组织或细胞样品。这些保藏条件的实施例为使用例如福尔马林进行固定，核糖核酸酶(RNase)抑制剂诸如 RNAsin(Pharmingen)或 RNasecure(Ambion),水性溶液诸如 RNAlater(Assuragen)、Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应(HOPE)和RCL2 (Alphelys)，及非水溶液诸如通用分子固定剂(Universal Molecular Fixative) (Sakura Finetek USA Inc·)。例如可根据Chomczynski和Sacchi (1987)的方法或Boom等(1990)的方法、或可在市场上购买的系统(诸如QIAGEN的RNeasy总RNA提取试剂盒,德国；或Roche Diagnostics的High....Pure-RNA-Isolatk)n-Kit ，巴塞尔，瑞士)分离RNA。可选择或额外地,将RNA逆转录为cDNA。例如使用与感兴趣的RNA杂交的特异引物和逆转录酶进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。进一步地，可使用随机引物和逆转录酶进行RT-PCR，其中随机引物例如为沿RNA随机杂交的随机六聚体或十聚体、或与mRNA多聚腺苷酸(poly (A))尾巴杂交的寡核苷酸(oligo)d(T) ο可直接(或在RT-PCR之后)使用任何核酸扩增方法诸如聚合酶链式反应(PCR ；Mullis和Faloona，1987)，或通过使用扩增反应诸如连接酶链式反应(LCR ；Barany, 1991)、自主序列复制(3SR；Guatelli等，1990)、链替代扩增(SDA ;Walker等，1992)、转录扩增系统(TAS ;Kwoh等，1989)、Q-β复制酶(Lizardi等，1988)、滚环扩增(RCA ;美国专利号5，871，921)、核酸序列依赖性扩增(NASBA ；Compton, 1991)、裂解酶片段长度多态性(美国专利号5，719，028)、核酸的等温和嵌合引物起始的扩增(ICA N)、分支延伸扩增方法(RAM ；美国专利号5，719，028和5，942，391)或用于核酸扩增的其它适当的方法进行源自猫冠状病毒的核苷酸的扩增。如本文所使用的术语“核酸”或“核酸分子”包括核苷酸链，优选为DNA和/或RNA。如本文所使用的术语“引物”指能够退火至扩增靶的允许DNA聚合酶结合的寡核苷酸，从而当置于诱导引物延伸产物合成的条件(即在核苷酸和聚合试剂诸如DNA聚合酶存在和适当的温度)下时起到DNA合成起始点的作用。扩增引物优选为单链，用于在扩增中获得最大效率。优选地，引物为寡脱氧核糖核甘酸。引物必须足够长以在聚合试剂的存在下起动延伸产物的合成。引物的准确长度将依赖于很多因素，包括温度和引物的组成(A/T en G/C的含量)。引物对由一条正向引物和一条反向引物组成，如在DNA扩增领域诸如PCR扩增领域中常用的那样。术语“探针”指将识别在靶标核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列，并与其形成氢键连接的双螺旋分子(duplex)的单链寡核苷酸序列。为了使结合的检测容易，特异的扩增子检测探针可包括标记部分诸如荧光团、发色团、酶或放射性标记，以便有利于监控探针与扩增反应的反应产物的结合。这样的标记对本领域的技术人员是已知的，且包括例如异硫氰酸荧光素(FITC)、[β]_半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉亲和素、生物素、地高辛、<35>S、<14>C、<32>P 和〈125>1。根据本发明的引物或探针包括核酸序列，优选为DNA和/或RNA。所述核酸序列还涵盖其它类型的核酸结构，诸如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)和/或锁核酸(LNA)。因此，术语“核酸序列”还涵盖包括非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或显示与天然核苷酸相同功能的非核苷酸构件单元的链。杂交在本领域是已知的，指优选在严格条件下互补单链核酸的结合。术语“互补的”或“序列互补性”也是本领域已知的，指能够通过碱基配对而非共价接合的两条核酸链。如本文所使用的“互补的”或“基本互补的”意味着两条核酸序列彼此具有至少大约70 %、优选大约80%、更优选为90%、且最优选大约95%的序列互补性。这意味着引物和探针必须分别对它们的模板和靶标核酸显示出足够的互补性以在严格条件下杂交。因此，引物和探针序列不需要反映模板上结合区域的准确互补序列，且可使用简并引物。例如，可将非互补的核酸片段连接至引物的5’末端，同时引物序列的剩余部分与链互补。术语“严格条件”指影响杂交物稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。根据经验优化这些条件以最大化引物或探针至其靶标核酸序列的特异性结合、且最小化引物或探针至其靶标核酸序列的非特异性结合。所使用的该术语包括指代探针或引物将与其靶标序列杂交，达到强于与其它序列杂交的可检测程度(例如为背景的至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，且在不同情形中将是不同的。术语序列一致性”在本文被定义为在比对两条序列且引入缺口(如果需要)以实现最大一致度后，候选氨基酸序列或候选核酸序列中与参考序列中的残基相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域是公知的。可使用或适用于确定候选序列是否落入本定义内的目的的一种计算机程序为由Genentech, Inc.创作的于1991年12月10号将用户文档提交美国版权局(华盛顿，D.C. 20559)的“Align 2”，或提供BESTFIT程序的UWGCG程序包(Devereux等，1984)。可使用能够与猫冠状病毒核酸序列至少一部分杂交的引物扩增包括对应于编码所述猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145、3146或3147位， 和/或核苷酸第3151、3152或3153位的核苷酸的猫冠状病毒核酸。所述引物例如在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3055位的位置和对应于核苷酸第3669位的位置之间与编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列杂交。所述引物优选具有9和 50 个核苷酸之间的长度，例如为 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或31个核苷酸。使用这样的引物通过扩增方法获得的核酸产物优选包括至少35个核苷酸、更优选至少40个核苷酸、甚至更优选至少50个核苷酸。因此，本发明提供了一种根据本发明的方法，进一步包括使用至少一个引物扩增包括包含或对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145、3146和3147位，和/或核苷酸第3151、3152和3153位的区域的猫冠状病毒核酸分子的至少一部分，其中所述引物能够在对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3055位的位置和对应于核苷酸第3669位的位置之间与所述核酸序列的至少一部分杂交。用于根据本发明的方法的优选的引物对包括与核酸序列5’ -CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3’具有至少70 %的序列一致性、优选与所述核酸序列具有至少80%的序列一致性、更优选与所述核酸序列具有至少90%的序列一致性、最优选与所述核酸序列具有至少95%的序列一致性的引物，以及与核酸序列5’ -CAATATTACAATGGCATAATGG-3’具有至少70%的序列一致性、优选与所述核酸序列具有至少80%的序列一致性、更优选与所述核酸序列具有至少90%的序列一致性、最优选与所述核酸序列具有至少95%的序列一致性的引物。用于根据本发明的方法的另一优选引物对包括与核酸序列5 ’ -GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3，具有至少70 %的序列一致性、优选与所述核酸序列具有至少80%的序列一致性、更优选与所述核酸序列具有至少90%的序列一致性、最优选与所述核酸序列具有至少95%的序列一致性的引物，以及与核酸序列5’-TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3’具有至少70%的序列一致性、优选与所述核酸序列具有至少80%的序列一致性、更优选与所述核酸序列具有至少90%的序列一致性、最优选与所述核酸序列具有至少95 %的序列一致性的引物。在一个实施方式中，根据本发明的引物对包括核酸序列5’ -CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3 ’ 和核酸序列 5 ’ -CAATATTACAATGGCATAATGG-3 ’ 的组合，或核酸序列5’ -GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3’ 和核酸序列 5’ -TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3’ 的组合。在本发明的一个实施方式中，上面所示的引物对用于巢式PCR反应。在巢式聚合酶链式反应中，两个引物对用于连续的PCR反应中。第二引物对用于扩增在使用第一引物对进行的扩增反应中获得的核酸产物或其部分。因此，在一个实施方式中，使用第一引物对扩增的扩增后的核酸的至少一部分可进一步使用第二引物对进行扩增。根据本发明的第一引物对包括例如与核酸序列5，-CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3 ’具有至少70 %的序列一致性的引物，以及与核酸序列5 ’ -CAATATTACAATGGCATAATGG-3 ’具有至少70%的序列一致性的引物；且根据本发明的第二引物对包括例如与核酸序列5’ -GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3’具有至少70 %的序列一致性的引物，以及与核酸序列5’ -TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3’具有至少70%的序列一致性的引物。本发明还提供了根据本发明的引物对的应 用，优选用于鉴定猫肠道冠状病毒(FECV)或猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)，和/或用于在怀疑患有猫冠状病毒感染的动物中确定FIPV或猫传染性腹膜炎(FIP)的存在。可通过本领域已知的任何方法确定编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的第3145、3146和/或3147位的核苷酸，和/或第3151、3152和/或3153位的核苷酸本体。这些方法包括但并不限于等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、核酸序列的测序(例如标签-阵列(tag-array)微测序[Fan等,2000]或焦磷酸测序[Fakhrai-Rad等,2002])、具有封闭试剂的等位基因特异性PCR(ASB-PCR，Morlan等，2009)、寡核苷酸连接测试(OLA，Baron等，1996)、质谱分析法(MS，例如基质辅助激光解析电离飞行时间(MALDI-TOF)MS，Crain和McCloskey 1998)、定量聚合酶链式反应(qPCR)、电子杂交、荧光单链构象多态(F-SSCP)分析(Makino等，1992)、变性高效液相色谱(DHPLC)、凝胶电泳(诸如微板阵列对角线凝胶电泳[MADGE，Day等，1998]和变形梯度凝胶电泳[DGGE，Fischer和Lermanl980])、和微阵列分析。等位基因特异性寡核苷酸(ASO)是短的且对具体RNA或DNA序列特异性的荧光团_、发色团_、酶-或放射性标记的核苷酸探针。ASO例如包括核苷酸突变，且ASO仅与包括该突变的核酸序列杂交。例如使用能够与包括对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145、3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和/或3153位的核苷酸的猫冠状病毒核酸序列的至少一部分特异性杂交的探针检测包括位于或对应于第3145,3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和/或3153位(如图2A所示)的核苷酸的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列的核酸序列。所述探针优选具有14和100个核苷酸之间的长度，优选具有14、15、16、17、18、19、20、21、22或更多个核苷酸的长度。因此，在一个实施方式中，使用具有至少14个核苷酸的探针检测包括位于或对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的第3145、3146和3147位，和/或核苷酸第3151、3152和3153位的核苷酸的猫冠状病毒核酸序列，其中所述探针能够特异地与所述核酸的至少一部分杂交。在优选实施方式中，上述探针能够特异地与包括位于对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2所示)的核苷酸第3145位的位置处的胞嘧啶或胸腺B密唳的猫冠状病毒核酸杂交。在根据本发明的方法中使用的探针与包括对应于核苷酸第3145、3146和3147位，和/或核苷酸第3151、3152和3153位的核苷酸(如图2A所示)的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列互补。因为冠状病毒是RNA病毒，因此如本领域的技术人员应该知道的，该类病毒具有较高的突变率。因此，猫冠状病毒的序列可能在编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的核苷酸第3145、3146和3147位，和/或核苷酸第3151、3152和3153位附近的一些核苷酸上是不同的。本领域的技术人员知道如何例如通过核酸取代改变根据本发明的探针以使所述探针能够与特异的猫冠状病毒的核酸序列杂交，且能够检测位于或对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的第3145、3146或3147位，和/或第3151、3152或3153位的核苷酸。在根据本发明的方法中使用的、包括对应于核苷酸第3145、3146和3147位(如图2A所示)的核苷酸的优选探针包括与核酸序列5’ -CCCARRGCCATAGG-3’具有至少70%序列一致性、优选与所述核酸序列具有至少80%序列一致性、更优选与所述核酸序列具有至少90%序列一致性、最优选与所述核酸序列具有至少95%序列一致性的序列，其中R为A或G。在一个实施方式中，本发明提供了一种根据本发明的方法，其中所述探针包括序列CCCARRGCCATAGG。本发明还提供了根据本发明的探针的应用，所述探针优选用于鉴定猫肠道冠状病毒(FECV)和/或猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)，和/或用于在怀疑患有猫冠状病毒感染的动物中确定猫传染性腹膜炎(FIP)的存在。在对相关核酸进行扩增之后，优选可直接通过本领域技术人员已知的测序方法确定猫冠状病毒核酸序列。这些方法包括例如，使用荧光标记的双脱氧核苷酸终止子的直接双链核苷酸测序(Smith等，1986)，标签阵列微测序或焦磷酸测序。通常，这样的测序方法包括通过核酸分离方法的病毒基因组核酸的分离，以及分离的核酸的核苷酸序列的确定，例如通过双脱氧链终止法(Sanger等，1977)，可选择的在双脱氧链终止法之前进行RNA至DNA的逆转录和/或靶标核酸的扩增。在一个实施方式中，对包括对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145、3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和3153位的核苷酸的猫冠状病毒核酸序列的至少一部分进行测序。寡核苷酸连接测试(OLA)是用于已知单核苷酸多态性检测的方法。该方法基于当两个相邻寡核苷酸探针退火至互补的DNA靶标上时使用DNA连接酶进行的该两个相邻寡核苷酸探针的连接。其中一个探针例如是荧光标记的和等位基因特异性的。典型地，存在两个不同标记的探针，每种等位基因一个。这两个探针仅在3’端最后一个喊基(在多态性的位点)存在不同。第二探针是普通探针，其与紧接包含多态性的位点下游(3’)的靶标DNA序列互补，因而与两个等位基因均互补。该探针不需要被荧光标记。通过DNA连接酶连接完全配对的探针的能力进行等位基因的辨别；捕获探针(capture probe)中的3’错配将阻止连接。本发明的方法中，例如使用寡核苷酸连接测试，其中一个探针能够特异地与包括位于核苷酸第3145位处的腺嘌呤(这表明为FECV)的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列(如图2A所示)杂交。因此右探针的第一个核苷酸或左探针的最后一个核苷酸为胸腺嘧啶。第二个探针为普通探针，能够与紧接编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的第3145位起始的FECV和FIPV核酸序列两者都杂交，例如如果所述第二探针为右探针，则FECV和FIPV核酸序列在第3146位起始。在FECV存在下，所述两个探针的连接是可能的；但在FIPV的存在下，所述两个探针的连接是不可能的。在本发明的一个实施方式中，使用寡核苷酸连接测试(OLA)确定包括核苷酸第3145、3146和/或3147位的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列。当使用封闭试剂时，可使用实时定量PCR技术检测基因的一个特异等位基因。该、技术被称为使用封闭试剂的等位基因特异性PCR(ASB-PCR，Morlan等，2009)。在PCR反应的过程中，向反应混合物中加入封闭试剂以阻止一个等位基因的扩增。将其中一个引物(例如正向引物)设计为突变等位基因特异的引物。另一引物为普通引物，能够与两个等位基因杂交。然后设计在3’端被磷酸化以阻止扩增的封闭试剂以特异性结合至野生型等位基因。在PCR反应的过程中，封闭试剂阻止突变特异性引物与野生型等位基因的杂交。在仅有野生型等位基因的存在下，没有获得扩增产物。然而，在仅有突变等位基因的存在下，则获得扩增产物。通过ASB-PCR，例如可能区分包括编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145位的腺嘌呤且表明为FECV的猫冠状病毒核酸序列，和包括在所述位置的胞嘧啶或胸腺嘧啶且表明为FIPV的猫冠状病毒核酸序列。例如，使用由普通反向引物和两个FIPV核酸特异性引物组成的引物组，其中FIPV核酸特异性引物的3’端核苷酸与编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145位互补。这些FIPV特异性引物中的一个在其3’端具有腺嘌呤，且另一个引物在其3’端具有鸟嘌呤，这使所述引物能够与在核苷酸第3145位分别包含胸腺嘧啶或胞嘧啶的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列杂交。可使用在3’端包括胸腺嘧啶的封闭试剂，该封闭试剂能够与在核苷酸第3145位的腺嘌呤杂交。使用所述引物组，当存在FIPV核酸时将出现扩增，而当只存在FECV 核酸时将不出现扩增。在本发明的优选实施方式中，使用采用封闭试剂的等位基因特异性PCR(ASB-PCR)确定包括核苷酸第3145、3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和/或3153位的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列。使用MALDI-TOF MS可完成DNA的低(飞克分子)量检测。可通过使用MALDI-T0FMS检测2 2000个核苷酸的核酸。因为核碱基的质量的不同，可将MS用于分析不同核酸片段的混合物，而无需使用任何标记。因此在大部分情况下，在MS测量之前不需要进行核酸片段的分离。使用MALDI-TOF MS，例如能确定在核苷酸第3145位的编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸序列的核苷酸是否为腺嘌呤(这表明为FECV)，或是否为胞嘧啶或胸腺嘧啶(这表明为FIPV)。在本发明的一个实施方式中，确定猫冠状病毒核酸序列的至少一部分的质量，所述部分包括对应于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因(如图2A所示)的核苷酸第3145,3146和/或3147位，和/或核苷酸第3151、3152和/或3153位的核苷酸。在优选实施方式中，使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)确定所述核酸序列的质量。可使用本领域已知的任何方法检测在编码纤突蛋白的猫冠状病毒氨基酸序列的氨基酸第1049位和/或氨基酸第1051位(如图2B所示)的氨基酸本体。例如使用抗体或其功能等效物、质谱分析或Edman降解反应检测所述氨基酸。可选择地，可使用本领域已知的方法提纯冠状病毒蛋白。例如，使用凝胶电泳或色谱法(诸如亲和色谱法)提纯冠状病毒蛋白。抗体的功能等效物被定义为在性质(kind)上(无需在量上)具有至少一种与所述抗体相同的性能的化合物。所述功能等效物能够与所述抗体一样结合相同的抗原，虽然该结合不一定具有与所述抗体相同的程度。抗体的功能等效物优选包括单结构域抗体、单链抗体、纳米抗体、单抗体(unibody)或单链可变片段(scFv)。例如通过改变抗体产生抗体的功能等效物，使得产生的化合物的至少一种特性(优选为抗原结合特性)在类型上(无需在量上)本质上是相同的。这可以很多方式进行，例如通过保守的氨基酸取代，从而通过具有通常相似特性(大小、疏水性等)的另一个残基取代氨基酸残基，这样可能不会严重影响整体的功能。包括猫冠状病毒纤突蛋白的猫冠状病毒的免疫原性部分被定义为在性质上但不必在量上与包括猫冠状病毒纤突蛋白的猫冠状病毒具有相同的至少一种性能的部分。猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分被定义为在性质上但不必在量上与猫冠状病毒纤突蛋白具有至少一种相同的性能的部分。所述免疫原性部分优选能够在动物体内诱导针对猫冠状病毒、优选猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的免疫应答。例如，使用特异性针对包括氨基酸第1049位和/或氨基酸第1051位(如图2B所示)的猫冠状病毒纤突蛋白表位的抗体或其功能等效物检测对应于氨基酸第1049位和/或氨基酸第1051位(如图2B所示)的猫冠状病毒纤突蛋白氨基酸序列的氨基酸。所述氨基酸第1049位和/或氨基酸第1051位(如图2B所示)能够区分FECV和FIPV。在氨基酸第1049位上的甲硫氨酸表明为FECV，而在该位置上不是甲硫氨酸的任何氨基酸(优选为亮氨酸)表明为FIPV ;且在氨基酸第1051位不是丝氨酸的任何氨基酸(优选为丙氨酸)表明为FIPV。因此，本发明提供了一种根据本发明的方法，其中使用特异性针对包含氨基酸 第1049位和/或氨基酸第1051位的FIPV纤突蛋白表位的抗体或其功能等效物检测在对应于氨基酸第1049位和/或氨基酸第1051位(如图2B所示)的位置处的猫冠状病毒纤突蛋白的氨基酸。在一个实施方式中，所述表位在对应于氨基酸第1049位的位置处包括不是甲硫氨酸的氨基酸，和/或所述表位在对应于氨基酸第1051位的位置处包括不是丝氨酸的氨基酸，如图2B所示。可使用本领域已知的任何方法检测特异性针对FIPV纤突蛋白表位的抗体或其功能等效物，上述FIPV纤突蛋白的表位包括对应于氨基酸第1049位和/或氨基酸第1051位(如图2B所示)的氨基酸。例如，所述抗体或其功能等效物是荧光团_、发色团-或酶-标记的，因此可使用例如荧光显微镜或分光光度法检测所述抗体或其功能等效物。还可使用例如为荧光团_、发色团-或酶-标记的二抗检测抗体或其功能等效物。所述标记对本领域的技术人员是公知的，例如包括异硫氰酸荧光素(FITC)、[β]_半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、链霉亲和素、生物素、地高辛。本发明还提供了特异性针对FIPV纤突蛋白表位的抗体或其功能等效物，包括根据本发明的抗体的部分的试剂盒，及用于检测所述抗体的工具；所述表位包括在对应于氨基酸第1049位(如图2Β所示)的位置处不是甲硫氨酸的氨基酸。使用MALDI-TOF MS可完成氨基酸序列的低量检测。因为氨基酸序列的质量不同，可使用MS分析不同氨基酸序列的混合物，而无需使用任何标记。因此，在大部分情况下，在MS测量之前不需要进行氨基酸序列的分离。使用MALDI-TOF MS，例如能区分在氨基酸第1049位(如图2Β所示)处包括甲硫氨酸的猫冠状病毒氨基酸序列，和在氨基酸第1049位(如图2Β所示)处包括不是甲硫氨酸的氨基酸的猫冠状病毒氨基酸序列。在本发明的一个实施方式中，确定猫冠状病毒氨基酸序列至少一部分的质量，所述部分包括对应于氨基酸第1049位(如图2Β所示)的氨基酸。在优选实施方式中，使用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF MS)确定所述氨基酸序列的质量。迄今为止，针对FIPV的疫苗的研究还未成功。多种途径还未提供诱导对抗FIPV的保护的疫苗。这些途径包括使用密切相关的异源活冠状病毒、不致死量的毒性FIPVdS毒性FIPV和(重组的)猫冠状病毒的亚单元或蛋白的疫苗接种。这些途径中的一些途径提供了一些保护，但结果并不一致。且偶尔疫苗接种甚至产生增强的疾病恶化和死亡。目前可得的仅有的疫苗是基于FIPV的温度敏感株，但该疫苗的效能是有问题的(McArdle等，1995 ；Fehr 等，1997)。既然已鉴定了猫冠状病毒纤突蛋白中的多态性，这样可允许区分FECV和FIPV，因此能开发包括猫冠状病毒的免疫原性组合物，其中该猫冠状病毒包括已鉴定的表明为FECV的核酸或氨基酸。使用包括具有代表FECV的核酸或氨基酸的猫冠状病毒的免疫原性组合物，没有疾病和/或死亡的风险，因为所述免疫原性组合物不包括毒性FIPV或其部分。现在还能开发包括猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性组合物，该猫冠状病毒纤突蛋白包括表明为FIPV的氨基酸。使用包括FIPV纤突蛋白或其免疫原性部分的免疫原性组合物，可在没有增强的疾病恶化和/或死亡的情况下诱导针对FIPV的更好的免疫应答，因为仅使用了分离的病毒蛋白。
因此在一个实施方式中,本发明提供了一种免疫原性组合物,包括猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分，包括位于对应于氨基酸第1049位的位置的不是甲硫氨酸的氨基酸，和/或位于对应于氨基酸第1051位的位置处的不是丝氨酸的氨基酸，如图2B所示；或，编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸，包括位于对应于核苷酸第3145位的位置处的胞嘧啶或胸腺嘧啶，和/或位于对应于核苷酸第3151位的位置处的鸟嘌呤，如图2A所示；或，包括含位于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的对应于核苷酸第3145位的位置处的腺嘌呤、和/或位于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的对应于核苷酸第3151位的位置处的胸腺嘧啶的核酸的猫冠状病毒(如图2A所示)；或，包括猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分的猫冠状病毒，上述猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分包括位于对应于氨基酸第1049位的位置处的甲硫氨酸，和/或位于对应于氨基酸第1051位的位置处的丝氨酸，如图2B所示；或其任意组合。在优选实施方式中，将根据本发明的免疫原性组合物用作疫苗。本发明进一步提供了用于在猫科动物中诱导针对猫冠状病毒、优选猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的免疫应答的以下物质猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分，包括位于对应于氨基酸第1049位的位置处的不是甲硫氨酸的氨基酸，和/或在对应于氨基酸第1051位的位置处的不是丝氨酸的氨基酸，如图2B所示；或，编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸，包括位于对应于核苷酸第3145位的位置处的胞嘧啶或胸腺嘧啶，和/或位于对应于核苷酸第3151位的位置处的鸟嘌呤，如图2A所示；或，包括含位于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的对应于核苷酸第3145位的位置处的腺嘌呤、和/或位于对应于核苷酸第3151位的位置处的胸腺嘧啶的核酸的猫冠状病毒(如图2A所示)；或，包括猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分的猫冠状病毒，上述猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分包括位于对应于氨基酸第1049位的位置处的甲硫氨酸，和/或位于对应于氨基酸第1051位的位置处的丝氨酸,如图2B所示；或其任意组合。—个实施方式提供了以下物质在用于制备在猫科动物中诱导针对猫冠状病毒、优选猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的免疫应答的免疫原性组合物或预防药物中的应用猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分，包括位于对应于氨基酸第1049位的位置处的不是甲硫氨酸的氨基酸，和/或位于对应于氨基酸第1051位的位置处的非丝氨酸的氨基酸，如图2B所示；或，编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸，包括位于对应于核苷酸第3145位的位置处的胞嘧啶或胸腺嘧啶，和/或位于对应于核苷酸第3151位的位置处的鸟嘌呤，如图2A所示；或，猫冠状病毒，包括含位于编码猫冠状病毒纤突蛋白的基因的对应于核苷酸第3145位的位置处的腺嘌呤、和/或位于对应于核苷酸第3151位的位置处的胸腺嘧啶的核酸的猫冠状病毒(如图2A所示)；或，包括猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分的猫冠状病毒，上述猫冠状病毒纤突蛋白或其免疫原性部分包括位于对应于氨基酸第1049位的位置处的甲硫氨酸，和/或位于对应于氨基酸第1051位的位置处的丝氨酸，如图2B所示；或其任意组合。下面的实施例将对本发明进行进一步地解释。这些实施例并不限制本发明的范围，而仅用于阐明本发明。


图I :示例性示出了猫冠状病毒的RNA基因组。5’部分(左)详细注明了编码源自开放阅读框(ORF) Ia和Ib的复制和转录功能的前体。5’部分朝向3’端的下游定位有用于编码结构蛋白S(纤突蛋白)、E(包膜蛋白)、M(膜蛋白)和N(核衣壳蛋白)的基因，及 用于编码辅助蛋白3a、3b、3c、7a和7b的基因。图2 :A)猫冠状病毒纤突蛋白的核苷酸序列(核苷酸I 4407),对应于如在NC_012955(猫冠状病毒UU10，全基因组)的核苷酸序列中所定义的猫冠状病毒的核苷酸20395 24801和如在NC_012952 (猫冠状病毒UU8，全基因组)的核苷酸序列中所定义的猫冠状病毒的核苷酸20382 24788。B)如在YP_003038574和ΥΡ_003038543的氨基酸序列中所定义的猫冠状病毒纤突蛋白的氨基酸序列。图3 :从被感染的猫的粪便中获得的6个临床样品中扩增RNA的琼脂糖凝胶电泳。泳道M为分子大小标准，泳道I 6为临床样品，且泳道7为阴性对照。图4 Α)从42只健康猫分离的源自粪便或血浆的FCoV RNA的部分序列和源自证实患有FIP的猫的样品的5个部分序列(即Q093501030_326B_4546. scf (源自白血球)、Q093501032_327B_4546. scf■(源自白血球)、Q093501036_321S_4546. scf (源自血清)、Q093501038_321A_4546. scf (源自腹水)和 Q093501046_K11_019. abl (源自白血球))的比对；B)从54只证实患有FIP的猫中分离的源自病灶的FCoV RNA的部分序列的比对；C)从证实患有FIP的猫中分离的源自粪便的FCoV RNA的部分序列的比对。在图4A、4B和4C的右侧示出了所分析的猫冠状病毒的识别码。用箭头示出了靶标核苷酸和预测的氨基酸。
具体实施例方式实施例实施例I在本实施例中，分析了 6个临床样品(粪便)。从临床样品中提取RNA，对提取的RNA进行RT-PCR，且在第一 PCR (第I游程(run))和巢式PCR (第2游程)之后通过琼脂糖凝胶电泳(参见图3)分析产物。材料和方法巢式RT-PCR用于扩增包含靶点突变的FCoV纤突蛋白基因区域。按照制造商的说明书使用 QIAamp Viral RNA Mini 试剂盒和 Qiagen RNeasy Mini 试剂盒(Qiagen, Inc.)从6只健康的猫的粪便中提取基因组RNA。使用M-MLV反转录酶(RT)进行cDNA的合成，然后使用Taq DNA聚合酶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。按照制造商的说明书(PromegaCorp.，麦迪逊，威斯康星州)使用所有酶。两个反应均使用特异性引物(见引物表I)引发。使用具有登录号NC_012955和NC_012952的FCoV基因组序列设计引物。使用94°C 60s、50°C30s和72°C Imin进行30个循环来进行扩增，且在扩增结束时在72°C额外延伸达7min。电泳后，使用 Qiagen 凝胶提取试剂盒(gel Extraction kit) (Qiagen Benelux B.V.,芬洛，荷兰)从琼脂糖凝胶中分离和纯化PCR片段。经BaseClear Holding B. V.(莱顿市，荷兰)测序。结果在第一 PCR后，仅在一个临床样品中获得601-bp的片段，如在图3的泳道2中所见。在PCR的第二循环后，当将巢式引物应用于第I游程RT-PCR的产物上时扩增了 139-bp的片段。现在不仅在泳道2看到产物，而且泳道3、5和6中也示出了扩增的RNA的产物。 实施例2在本实施例中，分析了 47只健康猫的粪便或血浆样品、54只证实患有FIP猫的临床样品和14只证实患有FIP猫的粪便样品。材料和方法按照实施例I的材料和方法进行基因组RNA的提取，cDNA的合成、扩增和测序。结果在所有来自健康猫的粪便或血浆(47/47)中检测到编码在氨基酸第1049位为甲硫氨酸的核酸序列(图4A)。稍后发现图4A包含源自证实患有FIP的猫的5条序列(Q093501030_326B_4546. scf、Q093501032_327B_4546. scf、Q093501036_321S_4546.scf、Q093501038_321A_4546. scf 和 Q093501046_K11_019. abl)，这意味着在来自健康猫的42/42源自粪便或血浆的FCoV中在氨基酸第1049位存在甲硫氨酸。还可从证实患有FIP的猫中扩增的2/54源自病灶(图4B)的RNA和12/14源自粪便(图4C)的RNA中观察到该序列。重要的是，证实患有FIP的猫中52/54(96% )源自病灶的RNA在第3145位处具有A至C或T的改变，从而导致将甲硫氨酸变为亮氨酸的第1049位的氨基酸改变(图4B)。实施例3我们通过荷兰的兽医和所有者继续收集样品和猫。在本实施例中，分析了以下样品:352只健康猫的粪便样品；89只健康或非FIP可疑猫的白血球样品；89只健康或非FIP可疑猫的血浆样品；56只健康或非FIP可疑猫的血清样品；97只证实患有FIP的猫的FIP病灶样品(肠系膜淋巴结(LN)和/或肾脏和/或脾脏和/或网膜和/或肺和/或LN和/或肝脏和/或腹水)；34只证实患有FIP的猫的白血球样品；34只证实患有FIP的猫的血浆样品；以及15只证实患有FIP的猫的血清样品。材料和方法
按照实施例I的材料和方法进行基因组RNA的提取，cDNA的合成、扩增和测序。结果来自健康猫的样品137/352(39% )的粪便样品是FCoV阳性的。在所有来自健康猫的源自粪便的FCoV (137个)中检测到在氨基酸第1049位编码甲硫氨酸且在氨基酸第1051位编码丝氨酸的核酸序列。来自健康或非FIP可疑的猫的样品获得来自89只健康或非FIP可疑的猫的EDTA-血液样品，并分离为白血球(WBC)和血浆。获得来自56只健康或非FIP可疑的猫的血清样品。 20/89白血球样品、4/89血浆样品和8/56血清样品是FCoV阳性的。4个血浆阳性样品均在WBC部分中呈阳性；且在每只动物中，血浆中的序列与WBC中的序列为100% —致。在所有检验为FCoV阳性的样品中，检测到在氨基酸第1049位编码甲硫氨酸且在氨基酸第1051位编码丝氨酸的核酸序列。来自证实患有FIP的猫的样品研究总计有97只证实患有FIP的猫。具有典型FIP病灶的97/97器官(包括肠系膜LN和/或肾脏和/或脾脏和/或网膜和/或肺和/或LN和/或肝脏和/或腹水)检验为FCoV阳性。87/97 (90% )的来自证实患有FIP的猫的源自病灶的RNA具有在第1049位的氨基酸改变，即由甲硫氨酸变为亮氨酸。5/97(5%)的来自证实患有FIP的猫的源自病灶的RNA具有在第1051位的氨基酸改变，即由丝氨酸变为丙氨酸。在第1051位为丙氨酸的所有5个样品中，第1049位为甲硫氨酸。因此，在来自证实患有FIP的猫的97个源自病灶的RNA中的92个样品(95% )具有表明为FIP的氨基酸改变，而97个样品中的5个(5% )不具有表明为FIP的氨基酸改变。在对动物实施安乐死之前，从97只证实患有FIP的猫中的34只中获得血液。将血液样品分离为白血球(血沉棕黄色层)和血浆。从15只已从中获得EDTA-血液的证实患有FIP的猫中获得血清样品。WRC WBC样品的34/34(100% )为FCoV阳性。在来自证实患有FIP的猫的源自WBC的RNA的29/34(85% )中，在第1049位为亮氨酸，且在第1051位为丝氨酸；对于所有29个样品，在器官样品中在第1049位也为亮氨酸。在WBC样品中的5只在第1049位为甲硫氨酸的猫中有2只在含FIP病灶的器官中在第1049位为亮氨酸，而其它3只没有表明为FIPV的氨基酸改变。因此，来自31/34(90% )FIP猫(其中器官材料中在第1049位检测为亮氨酸)中，在29/31 (94% )病例中的WBC中的第1049位也检测为亮氨酸。血浆:血浆样品的14/34(41% )为FCoV阳性。在来自证实患有FIP的猫的源自血浆的RNA的11/34(32% )中，在第1049位为亮氨酸，且在第1051位为丝氨酸。在血浆中第1049位为甲硫氨酸的3只FCoV阳性的猫中，有I只在包含FIP病灶的器官的FCoV RNA中的第1049位为亮氨酸，其它2只没有表明为FIPV的氨基酸改变。因此，来自31/34(90% )FIP猫(其中在器官材料中在第1049位检测为亮氨酸)中，在11/31(35%)病例中的血浆中也检测为亮氨酸。
血清:4/15(27%)的血清样品为FCoV阳性。在来自证实患有FIP的猫的源自血清的RNA的2/15 (13%)中，在第1049位为亮氨酸，且在第1051位为丝氨酸。这些猫的15/15(100%)在源自FCoV RNA的器官中的第1049位具有亮氨酸。表I、用于FCoV纤突基因靶标区域扩增的引物。
权利要求
1.一种用于确定样品中是否存在猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括确定所述样品是否包括猫冠状病毒；以及，如果存在猫冠状病毒，则确定所述猫冠状病毒的纤突蛋白中位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的氨基酸本体；以及，如果所述氨基酸不是甲硫氨酸，则确定存在FIPV。
2.根据权利要求I所述的方法，其中通过确定编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸的核酸序列来确定在第1049位的所述氨基酸本体，所述核酸包括位于或对应于如图2A所示的第3145、3146和/或3147位的核苷酸。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其中不是甲硫氨酸的所述氨基酸为亮氨酸。
4.根据权利要求2所述的方法，进一步包括使用能够与在对应于如图2A所示的核苷酸第3055位的位置和对应于如图2A所示的核苷酸第3669位的位置之间的所述核酸序列的至少一部分杂交的至少一个引物，扩增包括包含或对应于如图2A所示的核苷酸第3145、3146和3147位的区域的猫冠状病毒核酸分子的至少一部分。
5.一种用于确定样品中是否存在猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的方法，包括确定所述样品是否包括猫冠状病毒；以及，如果存在猫冠状病毒，则确定所述猫冠状病毒的纤突蛋白中位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的氨基酸本体；以及，如果所述氨基酸不是丝氨酸，则确定存在FIPV。
6.根据权利要求I 4中任一项所述的方法，进一步包括确定所述猫冠状病毒的纤突蛋白中位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的氨基酸本体；以及，如果所述氨基酸不是丝氨酸，则确定存在FIPV。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中通过确定编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸的核酸序列来确定位于第1051位的所述氨基酸本体，所述核酸包括位于或对应于如图2A所示的第3151、3152和/或3153位的核苷酸。
8.根据权利要求5 7中任一项所述的方法，其中不是丝氨酸的所述氨基酸为丙氨酸。
9.根据权利要求7所述的方法，进一步包括使用能够与在对应于如图2A所示的核苷酸第3055位的位置和对应于如图2A所示的核苷酸第3669位的位置之间的所述核酸序列的至少一部分杂交的至少一个引物，扩增包括包含或对应于如图2A所示的核苷酸第3151、3152和3153位的区域的猫冠状病毒核酸分子的至少一部分。
10.根据权利要求4或9所述的方法，其中至少一个所述引物选自表I中所列的引物。
11.一组引物对，包括包括与序列 5’ -CCCTCGAGTCCCGCAGAAACCATACCTA-3’具有至少70%序列一致性的序列的分离或重组的核酸序列，以及包括与序列5’ -CAATATTACAATGGCATAATGG-3’具有至少70%序列一致性的序列的分离或重组的核酸序列。
12.一组引物对，包括包括与序列5’ -GGCATAATGGTTTTACCTGGTG-3’具有至少70 %序列一致性的序列的分离或重组的核酸序列，以及包括与序列5’ -TAATTAAGCCTCGCCTGCACTT-3’具有至少70%序列一致性的序列的分离或重组的核酸序列。
13.根据权利要求2 10中任一项所述的方法，其中使用具有至少14个核苷酸长度的探针检测所述核酸序列，所述探针能够与包括位于或对应于如图2A所示的第3145、3146和3147位的核苷酸的猫冠状病毒核酸的至少一部分特异性杂交，或所述探针能够与包括位于或对应于如图2A所示的第3151、3152和3153位的核苷酸的猫冠状病毒核酸的至少一部分特异性杂交；所述部分具有至少14个核苷酸的长度。
14.一种长度在14和100个核苷酸之间的探针，包括与序列5’ -CCCARRGCCATAGG-3’具有至少70%序列一致性的核酸序列。
15.根据权利要求2 10或13中任一项所述的方法，进一步包括对猫冠状病毒核酸序列的至少一部分进行测序，所述部分包括对应于如图2A所示的核苷酸第3145、3146和/或3147位的核苷酸，或对应于如图2A所示的核苷酸第3151、3152和/或3153位的核苷酸。
16.根据权利要求1、3、5、6或8所述的方法，其中使用特异性针对FIPV纤突蛋白的表位的抗体或所述抗体的功能等效物检测位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049或1051位的位置处的猫冠状病毒纤突蛋白的氨基酸，所述表位包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的不是甲硫氨酸的氨基酸、或位于对应于如图2B所示的氨基酸第 1051位的位置处的不是丝氨酸的氨基酸。
17.一种特异性针对FIPV纤突蛋白的表位的抗体或功能等效物，所述表位包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的不是甲硫氨酸的氨基酸，或所述表位包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的不是丝氨酸的氨基酸。
18.一种免疫原性组合物，包括 猫冠状病毒纤突蛋白或所述猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分，包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的不是甲硫氨酸的氨基酸，和/或位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的不是丝氨酸的氨基酸；或 编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸，包括位于对应于如图2A所示的核苷酸第3145位的位置处的胞嘧啶或胸腺嘧啶，和/或位于对应于如图2A所示的核苷酸第3151位的位置处的鸟嘌呤；或 包括含位于对应于如图2A所示的核苷酸第3145位的位置处的腺嘌呤、和/或位于对应于如图2A所示的核苷酸第3151位的位置处的胸腺嘧啶的核酸的猫冠状病毒；或 包括猫冠状病毒纤突蛋白或所述猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分的猫冠状病毒，所述猫冠状病毒纤突蛋白或所述猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的甲硫氨酸，和/或位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的丝氨酸；或 它们的任意组合。
19.以下物质在用于制备在猫科动物中激发针对猫冠状病毒、优选猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的免疫应答的免疫原性组合物或预防药物中的应用 猫冠状病毒纤突蛋白或所述猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分，包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的不是甲硫氨酸的氨基酸，和/或位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的不是丝氨酸的氨基酸；或 编码纤突蛋白的猫冠状病毒核酸，包括位于对应于如图2A所示的核苷酸第3145位的位置处的胞嘧啶或胸腺嘧啶，和/或位于对应于如图2A所示的核苷酸第3151位的位置处的鸟嘌呤；或 包括含位于对应于如图2A所示的核苷酸第3145位的位置处的腺嘌呤、和/或位于对应于如图2A所示的核苷酸第3151位的位置处的胸腺嘧啶的核酸的猫冠状病毒；或 包括猫冠状病毒纤突蛋白或所述猫冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分的猫冠状病毒，所述猫冠状病毒纤突蛋白或所述猫 冠状病毒纤突蛋白的免疫原性部分包括位于对应于如图2B所示的氨基酸第1049位的位置处的甲硫氨酸，和/或位于对应于如图2B所示的氨基酸第1051位的位置处的丝氨酸；或它们的任意组合。
全文摘要
本发明提供了用于区分FECV和FIPV的方法和工具，及用于确定样品中是否存在FIPV的方法和工具。本发明进一步提供了用于检测编码纤突蛋白的FIPV特异核酸序列的引物和探针，用于检测FIPV的抗体，及用于激发针对猫冠状病毒，优选FIPV的免疫应答的免疫原性组合物及其应用。
文档编号C12Q1/70GK102791886SQ201180012740
公开日2012年11月21日 申请日期2011年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者张惠雯, 彼得鲁斯·约瑟夫斯·玛丽·罗提尔, 赫尔曼·F·艾格伯林克 申请人:乌得勒支大学控股有限公司