专利名称：涉及鉴定参与疼痛的化合物的方法和用途以及诊断痛觉的方法
涉及鉴定参与疼痛的化合物的方法和用途以及诊断痛觉的方法本发明涉及一种鉴定参与疼痛的化合物的方法、Car3核酸或Car3蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途以及涉及Car3核酸或Car3蛋白的诊断痛觉的方法。身体疼痛是一种典型的感觉经历，其可被描述为有害刺激或身体伤害的不愉快的意识。个体通过多种日常伤害和疼痛以及有时通过更严重的损伤或疾病来经历疼痛。为了科学和临床目的，疼痛由国际疼痛研究协会(IASP)定义为“与实际或潜在的组织损伤有关或者就这样的损伤描述的不愉快的感觉和情感经历”。任何类型的疼痛在美国都是医生会诊的最常见原因，每年促使半数美国人寻找医疗护理。其在许多医学病况中是主要的症状，显著干扰人的生活质量和一般机能。诊断是基于以不同的方式表征疼痛，根据持续时间、强度、类型(钝痛、灼痛、跳痛或刺痛)、来源或身体中的位置。通常不需要处理或者响应于简单措施(例如休息或吃镇痛药)疼痛就停止，因此这称为“急性”疼痛。但其亦可变成难治的并发展为称为慢性疼痛的病况，其中疼 痛不再被认为是症状而是疾病本身。近年来，疼痛的研究已吸引了许多不同的领域，例如药理学、神经生物学、护理学、牙科学、物理治疗和心理学。疼痛是身体防御系统的一部分，引起反射反应以从疼痛刺激中收缩，并帮助调节行为以在未来加大避免该特定有害情况。疼痛的医学管理在急性疼痛和慢性疼痛之间已引起区别。急性疼痛是“正常的”疼痛，当弄伤脚趾、骨折、患有牙痛或在大量外科手术后步行时会感受到。慢性疼痛是一种“疼痛病”，日复一日，月复一月，都会感受到，并似乎不可能痊愈。通常，医生更舒适地治疗急性疼痛，除其他原因外，其通常由软组织损伤、感染和/或炎症引起。通常用药物(一般是镇痛药)或用于移除原因和用于控制疼痛感觉的适当技术同时治疗。在一些情况下，急性疼痛治疗失败相当地可引起慢性疼痛。用于治疗疼痛的一系列药物是已知的。然而，副作用和抗性是与已知镇痛药相关的常见问题。因此，美国成人的调查发现疼痛是人们使用辅助和备选药物的最常见原因也就不足为奇了。这证明，仍需要用于疼痛治疗的新方法和靶标。出乎意料地，现已发现Car3参与疼痛。在用于鉴定参与疼痛的基因的筛查测定中，研究了疼痛敏感性不同的三种不同的近交小鼠品系。多种基因的表达与小鼠品系的疼痛敏感性相关。在这些基因中，在疼痛敏感性和表达之间显示最相关的是Car3 (参见实施例)。因此，Car3是用于鉴定参与疼痛的化合物和用于诊断痛觉的引人关注的靶标。因此，本发明在第一和第二方面提供一种鉴定参与疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供包含Car3核酸或者Car3蛋白或其功能活性变体的测试系统，
b)将测试系统与测试化合物接触，和
c)测定测试化合物对测试系统的作用，
其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。本发明的第一方面涉及一种包含Car3核酸的测试系统，第二方面涉及一种包含Car3蛋白或其功能活性变体的测试系统。可使用本发明的测试系统以便阐明参与疼痛的机制。特别地，测试系统可用于开发、鉴定和/或表征参与疼痛的物质，其与Car3核酸或蛋白相互作用，特别地激活或灭活Car3核酸或蛋白。鉴定的物质可为引人关注的治疗药物，其可用于治疗疼痛，尤其是神经性疼痛。备选地，Car3可用于诊断痛觉。多种测试设计是本领域已知的，其可适合于本发明的测试系统。关于例示性测试的进一步详述在本发明的方法中提供。可使用测试系统以便测定测试化合物对测试系统的作用。技术人员将能够设计适用于特定目的测试方法的测试系统，例如通过加入与通行方法有关的所需要的另外物质。除了 Car3核酸或者蛋白或其功能活性变体外，本发明的测试系统还可包含一种或多种另外的组分。取决于测试设计和检测方法，测试系统可包含，例如已知的Car3配体、 Car3信号转导的组分、用于检测的工具等。技术人员将能够使测试系统适应于研究设计，SP能够选择合适的缓冲剂、辅因子、底物、一种或多种不同的抗体、标记物、酶或任何其他必需物质。测试系统可呈细胞系统或无细胞系统内，视主要条件而定。在本发明方法的第一步中，提供包含Car3核酸(例如Car3基因或Car3 cDNA或Car3 mRNA或Car3启动子)或蛋白的测试系统。Car3基因编码金属酶Car3。Car3亦被称为碳酸酐酶III、碳酸脱水酶III或碳酸酐酶III，肌肉特异性或者缩写为CA-III或CAIII。Car3蛋白(EC 4. 2. I. I)是α -碳酸酐酶家族(存在于哺乳动物中并编码碳酸酐酶同工酶的多基因家族)的成员。哺乳动物中发现的碳酸酐酶根据其在细胞内的位置分为四个主要亚类，其进而由至少15种同工型组成。这些碳酸酐酶是一类催化二氧化碳可逆水合的金属酶(催化活性H2CO3 = CO2 + H2O)。α-碳酸酐酶家族的酶的辅因子是锌离子。锌离子被三个组氨酸残基(His94、His96和Hisll9)的咪唑环配位。动物中的酶的主要功能是将二氧化碳和碳酸氢盐互变以维持血液和其他组织中的酸碱平衡并帮助运输二氧化碳出组织。碳酸酐酶的反应速率是所有酶中最快之一，且该速率通常受其底物的扩散速率限制。该酶的不同形式的典型催化速率范围为IO4-IO6反应/秒。在人中，Car3基因的表达是组织特异性的，蛋白在脂肪细胞和骨骼肌中以高水平存在，而在心肌和平滑肌中以低得多的水平存在。蛋白位于细胞质中。该基因跨越10. 3 kb并包含7个外显子和6个内含子。妊娠6周时，转录物在体节中以低水平积累但以高水平贯穿脊索积累。随着妊娠继续，Car3在所有发育的肌肉块中变得丰富并继续以高至中等的水平存在于脊索中。碳酸酐酶同工酶3具有使其区分于其他同工酶的数个特征，尤其是它的低特异性二氧化碳水合酶活性，其仅为Car2活性的3%。该酶在男性肝、骨骼肌和脂肪细胞中非常丰富，构成多达5%、8%和25%的这些组织的可溶性部分。Car3表达在前脂肪细胞中是可忽略的，而在分化时变得大量，但依赖分化的Car3表达的机制未被理解。迄今为止，该酶的生理功能是不清楚的，然而，据推测它可能不仅仅起碳酸酐酶的作用。已表明Car3在脂肪酸代谢中的功能。因此，Car3可促进糖酵解中间体向草酰乙酸盐和柠檬酸盐的迅速转化并促进其结合到脂肪酸中。缺失Car3的敲除小鼠不具有异常的表型特征；脂肪的量及其分布是正常的。使得Car3区分于其他同工酶的另一特征是其磷酸酶活性。Car3在谷胱甘肽和它的5个半胱氨酸残基的2个之间形成二硫键(称为S-谷胱甘肽化(glutathiolation)的过程)。Car3的谷胱甘肽化在体内发生并在衰老的过程中和急性氧化应激下增加。因此，谷胱甘肽化起可逆地调节Car3的磷酸酶活性的作用。上文提及的2个半胱氨酸残基中的I个(大鼠中的Cys-186)的谷胱甘肽化是磷酸酶活性所需的，而另一半胱氨酸残基(大鼠中的Cys-181)的谷胱甘肽化阻断磷酸酶活性。因此，谷胱甘肽化是可调节Car3的可逆共价修饰，其可在细胞反应于氧化应激时起作用。已发现Car3促进肝癌细胞的转化和侵袭力。此外，杜兴肌营养不良的载体的一部分具有高于正常的Car3水平。人Car3蛋白由260个氨基酸组成，具有29557 Da的分子量(参见UniProtKB/ Swiss-Prot P07451 ；CAH3_HUMAN ；SEQ ID NO: I)。显示的序列被进一步加工为成熟形式。其在氨基酸94、96和119包含金属结合位点。
权利要求
1.一种鉴定参与疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供包含Car3核酸的测试系统， b)将测试系统与测试化合物接触，和 c)测定测试化合物对测试系统的作用， 其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
2.一种鉴定参与疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤 a)提供包含Car3蛋白或其功能活性变体的测试系统， a)将测试系统与测试化合物接触，和 b)测定测试化合物对测试系统的作用， 其中，当相对于对照检测到测试化合物对测试系统的显著作用时，所述测试化合物被鉴定为参与疼痛的化合物。
3.权利要求I或2中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物是天然参与Car3基因和/或Car3蛋白的信号转导途径的细胞化合物。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物改变Car3蛋白上游或下游的信号转导。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物改变Car3基因上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物改变Car3基因的表达。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物与天然参与Car3基因和/或Car3蛋白的信号转导途径的细胞化合物结合，特别地，其中参与疼痛的化合物与Car3核酸或Car3蛋白结合,尤其是与Car3蛋白结合。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物抑制Car3基因上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物抑制Car3基因的表达。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中参与疼痛的化合物抑制Car3蛋白上游或下游的信号转导，特别地，其中所述化合物与Car3蛋白结合。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中测试系统在细胞内。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述方法是高通量法。
11.权利要求ι- ο中任一项的方法，其中疼痛是神经性疼痛。
12.Car3核酸用于鉴定参与疼痛的化合物的用途。
13.Car3蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途。
14.权利要求12或13的用途，其中所述用途进一步定义为权利要求3-8和11中任一项的定义。
15.一种诊断痛觉的方法，其包括以下步骤 a)测定受试者的样品中的Car3基因的表达水平，和 b)如果受试者的样品中的Car3基因的表达水平相对于对照是增加的，那么鉴定受试者为疼痛的。
全文摘要
本发明涉及一种鉴定参与疼痛的化合物的方法、Car3核酸或Car3蛋白用于鉴定参与疼痛的化合物的用途以及涉及Car3核酸或Car3蛋白的诊断痛觉的方法。
文档编号C12Q1/68GK102803513SQ201180015263
公开日2012年11月28日 申请日期2011年1月20日 优先权日2010年1月21日
发明者M.格鲍尔, M.米夏利斯, D.丁格-普费宁多夫, A.M.舒尔特, D.齐梅克, C.梅茨-魏德曼 申请人:赛诺菲