专利名称：质粒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用基因工程方法的有助于提高微生物的功能的技术。详细而言，本发明涉及来源于考克氏菌属(Kocuria)细菌的质粒载体。
背景技术：
微球菌科(Micrococcaceae)细菌中的很多细菌在食品工业、药品制造业、化学 工业、环境净化等领域确认到有用性。例如，在奶酪等乳制品的制作等中使用丙酸杆菌(propionibacteria)。另外,作为L-谷氨酰胺的生产菌，已知有短杆菌属(Brevibacteria)细菌。但是，这些细菌的野生株存在产物的生成能力低、培养困难等各种问题。因此，为了解决上述问题，正在尝试通过对这些细菌实施基因操作来得到产物的生成能力、环境适应性等得到提高的突变株。此时利用的是能够在上述细菌中自主复制的质粒等载体。例如，能够用于丙酸杆菌的载体有作为专利文献I的日本特开2002-112790号公报中记载的载体(特别将专利文献I的记载作为公开的内容援引到本说明书中)。作为属于微球菌科的细菌，已知考克氏菌属(Kocuria)细菌。考克氏菌属细菌显示出高度的耐有机溶剂性、耐重金属性和增殖能力，因而期待其在燃料或医药化学产品的制造、环境净化等领域中的应用。
发明内容
发明所要解决的问题但是，尚未获知在考克氏菌属细菌中稳定保持外源性基因的技术。也没有成功地使用该细菌并利用基因工程方法进行微生物修饰的例子。结果，也不能赋予新的生物学功能或使原来的功能达到最佳化，因此，考克氏菌属细菌在产业界中几乎未得到应用。因此，本发明中，发明所要解决的问题在于，提供为了在产业上有效地利用考克氏菌属细菌而利用基因工程方法对考克氏菌属细菌进行修饰的技术。用于解决问题的手段本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，结果，成功地从相模湾内的深度约2000m的底泥中分离出具有大小较小且容易处理的环状质粒的新的考克氏菌属细菌即考克氏菌 MBE131 (Kocuria sp. MBE131)株(FERM P-21885 ;以下有时也称为 MBE131 株)。本发明人将由MBE131株获取的质粒命名为pKRIOO，将外源性基因和能够在大肠杆菌内自主复制的质粒连接,构建了 MBE131株和大肠杆菌的穿梭载体。将该穿梭载体导入MBE131株和大肠杆菌中，结果在任意一种细菌内均表达外源性基因。
此外,本发明人进一步对质粒pKRIOO进行了研究,结果弄清了推测在质粒pKRIOO中负责DNA复制的区域(复制区)。接着，准备在质粒pKRIOO中不同于复制区的区域中插入外源性基因而得到的重组质粒，将其导入作为与MBE131株不同的考克氏菌属细菌的嗜根考克氏菌 DC2201 (Kocuria rhizophila DC2201)株(NBRC103217)中。结果，该重组质粒在嗜根考克氏菌DC2201株中也能够表达外源性基因并且能够自主复制。本发明基于上述发现而完成。因此，根据本发明，提供一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含=DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的喊基序列；以及序列号45所的喊基序列或在严格条件下与该喊基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。根据本发明的另一方面，提供一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含DNA结合蛋白样蛋白基因的喊基序列；复制酶样蛋白基因的喊基序列；以及选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列。根据本发明的另一方面，提供一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复 制区，所述复制区包含DNA结合蛋白样蛋白基因的喊基序列；复制酶样蛋白基因的喊基序列；以及包含选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列、氧化剂敏感性序列及反向重复序列的碱基序列。优选本发明的质粒在复制区中包含选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列中的I个以上的DNA结合蛋白结合序列以及2个以上的重复基序。优选DNA 结合蛋白结合序列选自由 CACCGGTG、ACCGGTG、CCGGTG、ACCGGT、CACAGGT、CACCGGT、CACCGG、GTGCGCAC、GGCCGGCC、TCGGAGCTCCGA (序列号 46)、TCCCGGGA、TGCCGGCA、TGATCGATCA (序列号47)和GCACGTGC组成的组。优选重复基序的重复单元选自由TGGCGTGGTCGTTG (序列号48)、GCGCTGGGGTG (序列号 49)、TGGGGCTGTGGTGG (序列号 5O)、GCGGTGGTG、GCGGTGGTGTG (序列号 5D、GGGCCGGGGTTG (序列号 52)、GCCGGGGTTGT (序列号 53)、TGGTCGTGTTG (序列号 54)、TGTTGCTGGGGTG (序列号 55)、TGGCGGTGTTGTGG (序列号 56)和 GGGGTGCCGGTGG (序列号 57)组成的组。优选本发明的质粒在复制区中包含I个以上的氧化剂敏感性序列。优选氧化剂敏感性序列选自由TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA (序列号 58)、GGCCTCTCAGC (序列号 59)、CTGCGGGCACCTCCTAC (序列号 60)、TTCGATGAG、GGTGAGGGGTAACCC (序列号 61)、GTGGGGTGGC (序列号 62)、GGGGGGTGGCTTCCTATCG (序列号 63)、GTGGGGTGGCCC (序列号 64)、TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA (序列号 65)、GCGGGGGCACCCGA(序列号 66)和 CTGAGGGTCCTC (序列号 67)组成的组。优选本发明的质粒在复制区中包含I个以上的反向重复序列。优选反向重复序列选自由GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC (序列号68)和CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTITTCCGTG(序列号 69)组成的组。优选复制酶样蛋白基因的喊基序列为RepA蛋白基因的喊基序列。优选复制酶样蛋白基因的碱基序列为序列号2所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码具有复制酶活性的蛋白的碱基序列。
优选DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列为螺旋-转角-螺旋蛋白基因的碱基序列。优选DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列为序列号I所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码螺旋-转角-螺旋蛋白的碱基序列。优选复制区为序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。优选细菌为考克氏菌属(Kocuria)细菌。根据本发明的另一方面，提供一种能够在考克氏菌属细菌内自主复制的环状质粒，其中，作为限制性酶识别位点及其数量，以限制性酶识别位点数量的形式表示，包含SmaI :2、SphI U Sail K XhoI :1 和 BamHI :1。优选本发明的质粒依次包含限制性酶识别位点Smal、Smal、SphI, Sail、XhoI,BamHI 和 SacI。优选本发明的质粒的碱基对数为3. OX 103 3· 4 X IO3。优选本发明的质粒由以下的限制性酶图谱(I)表示
权利要求
1.一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含 DNA结合蛋白样蛋白基因的喊基序列； 复制酶样蛋白基因的喊基序列；以及 序列号45所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。
2.一种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含 DNA结合蛋白样蛋白基因的喊基序列； 复制酶样蛋白基因的喊基序列；以及 选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列。
3.—种能够在细菌内自主复制的环状质粒，其具有复制区，所述复制区包含 DNA结合蛋白样蛋白基因的喊基序列； 复制酶样蛋白基因的喊基序列；以及 包含选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列、氧化剂敏感性序列以及反向重复序列的碱基序列。
4.如权利要求2或3所述的质粒，其中，在复制区中包含选自由DNA结合蛋白结合序列和重复基序组成的组中的至少一种序列中的I个以上的DNA结合蛋白结合序列以及2个以上的重复基序。
5.如权利要求2 4中任一项所述的质粒，其中，DNA结合蛋白结合序列选自由CACCGGTG、ACCGGTG、CCGGTG、ACCGGT、CACAGGT、CACCGGT、CACCGG、GTGCGCAC、GGCCGGCC、TCGGAGCTCCGA(序列号 46)、TCCCGGGA、TGCCGGCA、TGATCGATCA (序列号 47)和 GCACGTGC 组成的组。
6.如权利要求2 5中任一项所述的质粒，其中，重复基序的重复单元选自由TGGCGTGGTCGTTG(序列号 48)、GCGCTGGGGTG(序列号 49)、TGGGGCTGTGGTGG(序列号 50)、GCGGTGGTG、GCGGTGGTGTG(序列号 51)、GGGCCGGGGTTG (序列号 52)、GCCGGGGTTGT (序列号53)、TGGTCGTGTTG (序列号 54)、TGTTGCTGGGGTG (序列号 55)、TGGCGGTGTTGTGG (序列号 56)和GGGGTGCCGGTGG(序列号57)组成的组。
7.如权利要求2飞中任一项所述的质粒，其中，在复制区中包含I个以上的氧化剂敏感性序列。
8.如权利要求7所述的质粒，其中，氧化剂敏感性序列选自由TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA (序列号 58)、GGCCTCTCAGC (序列号 59)、CTGCGGGCACCTCCTAC (序列号 60)、TTCGATGAG、GGTGAGGGGTAACCC (序列号 61)、GTGGGGTGGC(序列号 62)、GGGGGGTGGCTTCCTATCG (序列号 63)、GTGGGGTGGCCC (序列号 64)、TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA (序列号 65)、GCGGGGGCACCCGA (序列号 66)和 CTGAGGGTCCTC (序列号67)组成的组。
9.如权利要求2 8中任一项所述的质粒，其中，在复制区中包含I个以上的反向重复序列。
10.如权利要求9所述的质粒，其中，反向重复序列选自由GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC (序列号 68)和 CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG (序列号69)组成的组。
11.如权利要求f10中任一项所述的质粒，其中，复制酶样蛋白基因的碱基序列为RepA蛋白基因的喊基序列。
12.如权利要求f10中任一项所述的质粒，其中，复制酶样蛋白基因的碱基序列为序列号2所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码具有复制酶活性的蛋白的碱基序列。
13.如权利要求f12中任一项所述的质粒，其中，DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列为螺旋-转角-螺旋蛋白基因的碱基序列。
14.如权利要求f12中任一项所述的质粒，其中，DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列为序列号I所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交且编码螺旋-转角-螺旋蛋白的碱基序列。
15.如权利要求f14中任一项所述的质粒，其中，复制区为序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。
16.如权利要求f15中任一项所述的质粒，其中，细菌为考克氏菌属(Kocuria)细菌。
17.—种能够在考克氏菌属细菌内自主复制的环状质粒，其中，作为限制性酶识别位点及其数量，以限制性酶识别位点数量的形式表示，包含SmaI :2、SphI :1、SalI :1、XhoI 1和 BamHI I。
18.如权利要求17所述的质粒，其中，依次包含限制性酶识别位点Smal、SmaI,SphI,Sail、XhoI 和 BamHI。
19.如权利要求17或18所述的质粒，其中，碱基对数为3.0X10，3. 4X103。
20.如权利要求17 19中任一项所述的质粒，其由以下的限制性酶图谱(I)表示，
21.如权利要求17 20中任一项所述的质粒，其包含序列号3或4所示的碱基序列。
22.如权利要求17 21中任一项所述的质粒，其来源于考克氏菌ΜΒΕ131(Kocuriasp.MBE131)株，所述考克氏菌ΜΒΕ131株的保藏编号为FERM Ρ-21885。
23.—种DNA片段，其包含序列号3所示的碱基序列或在严格条件下与该碱基序列的互补碱基序列杂交的碱基序列。
24.一种载体，其包含权利要求23所述的DNA片段的碱基序列。
25.—种转化体，其含有权利要求f 22中任一项所述的质粒、权利要求23所述的DNA片段或权利要求24所述的载体。
全文摘要
本发明的目的在于提供为了在产业上有效地利用考克氏菌属细菌而利用基因工程方法对考克氏菌属细菌进行修饰的技术。上述目的通过一种能够在细菌内自主复制的环状质粒来解决，所述环状质粒具有复制区，所述复制区包含DNA结合蛋白样蛋白基因的碱基序列；复制酶样蛋白基因的碱基序列；和序列号45所示的碱基序列。作为上述质粒，可以列举例如来源于考克氏菌MBE131(Kocuria sp.MBE131)株(FERM P-21885)的包含序列号3或4所示的碱基序列的质粒。
文档编号C12N1/19GK102906260SQ20118001789
公开日2013年1月30日 申请日期2011年3月18日 优先权日2010年3月31日
发明者大田优佳莉, 秦田勇二, 森梢, 中村信之 申请人:独立行政法人海洋研究开发机构