用于核酸等温扩增的改进方法

专利名称：：用于核酸等温扩增的改进方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及等温核酸扩增领域。
背景技术：
：近年来，用于核酸扩增和检测扩增产物的方法的发展已经推进了核酸序列的检测、鉴定、定量和序列分析。核酸分析可用于检测和鉴定病原体、检测导致确定的表型的基因改变、诊断遗传性疾病或对疾病的易感性、评估在发育和疾病中的基因表达和对确定的刺激作出响应的基因表达、以及各种基因组项目。核酸扩增方法的其它应用为检测稀少的细胞、检测病原体和检测恶性肿瘤中改变的基因表达等。核酸扩增有可能可用于定性分析例如检测确定的核酸序列的存在，以及确定的基因序列的定量。后者可用于评估致病序列和确定致病序列的量以及确定基因重复或缺失，这些在正常细胞类型转化成恶性细胞类型的细胞转化中是常见的。检测核酸序列中的序列改变对于检测突变基因型来说是重要的，所述突变基因型与遗传分析、对导致耐药性的突变的检测、药物基因组学等是有关的。用于检测特异性突变的各种方法包括等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性探针连接和差异探针杂交。尽管通过探针杂交可以检测确定的核酸序列的存在以及进行序列分析，但是当在测试样品中存在少量核酸序列例如几个分子时，该方法通常缺乏灵敏度。这个问题的一种解决方案是开发用于产生确定的核酸序列的多拷贝的方法，该多拷贝适合于进一步分析。用于产生特定核酸序列的多拷贝的方法通常被定义为祀扩增方法(targetamplificationmethod)。存在核酸扩增的多种变体，例如指数扩增、连锁的线性扩增、基于连接的扩增和基于转录的扩增。指数核酸扩增方法的实例是聚合酶链反应(PCR)，其已被公开于众多出版物中(参见，例如，Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51:263-273(1986);MullisK.EP-B2201184;Mullis等，US4,582，788)。基于连接的扩增的实例是Wu等在Genomics4:560(1989)中公开的连接扩增反应(LAR)和公开在EP-B10320308中的连接酶链反应。公开了多种基于转录的扩增方法。最常用的靶扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其基于变性、两个各自针对靶链的相反链的寡核苷酸引物的杂交、和由核苷酸聚合酶进行的引物延伸的多个循环，以产生靶序列的多重双链拷贝。已经描述了PCR的许多变体，并且所述方法正用于扩增DNA或RNA核酸序列、测序、突变分析等。还已经描述了采用单个引物的基于热循环的方法。其它依赖于热循环的方法为连接酶链反应(LCR)和有关的修复链反应(RCR)。在基于热循环的方法中，通过在多个温度下孵育的多个循环来进行靶核酸扩增。尽管这些方法被广泛使用，但是使用热循环过程的扩增方法具有延隔时间长的缺点，延隔时间是热循环模块达到每个循环的“靶”温度所需要的时间。因此，使用热循环过程进行的扩增反应需要大量时间来完成。等温靶扩增方法不需要热循环仪，并且因此更容易适应常见的仪器平台。然而，等温靶扩增方法具有几个缺点。等温靶扩增方法易于出错。除了扩增靶区域外，由于引物错配而出现非特异性扩增产物。为了避免产生这些副产物，将反应组分分开加热并在在更高温度下进行混合，例如将包含引物、探针和靶DNA的混合物与包含缓冲液、聚合酶、dNTP和解旋酶的另一混合物分开加热至反应温度。这样的方法费时费力并且复杂。因此，需要克服这些缺点的改进的核酸扩增方法。在此提供的本发明满足这种需求并提供了另外的益处。
发明内容本发明提供用于核酸扩增的方法，所述方法包括以下步骤i)至少提供以下反应组分a)用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶；b)一个或多个用于扩增靶核酸的引物；c)dNTP和/或NTP;d)至少一种用于在等温条件下扩增核酸的酶的必要辅助因子和/或试剂；e)靶核酸；其中将反应组分a)至e)中的至少一种包埋在基质中，其中所述基质在预定条件下崩解；ii)在导致所述基质崩解的条件下孵育反应组分，以便获得反应混合物；iii)在适用于等温扩增反应的条件下孵育反应混合物。本发明还涉及用于核酸等温扩增的试剂盒，所述试剂盒包含-用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶，-在预定条件下崩解的基质；其中至少一种对于核酸等温扩增必要的组分被包埋在所述基质中。本发明还涉及组合物，其包含-在预定条件下崩解的基质；和-用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶。本发明还包括包埋用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶的方法，其包括以下步骤i)提供溶解的基质；ii)将所述基质与包含至少一种用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶的溶液混合以获得基质-酶混合物；iii)在允许基质固化的条件下孵育基质-酶混合物以获得包埋的嗜中温酶。具体实施例方式在此处，“嗜中温”是指酶的最适温度为70°C以下。在优选的实施方式中，所述至少一种用于扩增核酸的嗜中温酶的最适温度为20°C至70°C，优选30°C至65°C，更优选37°C至60°C。在大部分情况下，嗜中温酶不是热稳定的，即它们在高温下孵育后不可逆地失活。在实施方式中，本发明的嗜中温酶不是热稳定的。在上下文中，嗜中温酶在高温下不可逆失活是指在高于酶的最适温度的温度下孵育该酶。在一个实施方式中，在高温下孵育是指在至少50°C的温度下、优选在至少60°C的温度下、更优选在至少70°C的温度下孵育。“不可逆失活”是指一定程度的酶活性丧失。此外，所述失活并不必然是完全失活，即在高温下孵育嗜中温酶后可观察到70%以下、优选40%以下、更优选10%以下的剩余酶活性。本领域技术人员将认识到，嗜中温酶在高温下的失活可取决于孵育进行的时间。因此，在优选的实施方式中，在高温下孵育至少30秒、优选至少I分钟、更优选至少5分钟、甚至更优选至少15分钟之后，嗜中温酶不可逆地失活。本领域技术人员将理解，本发明的方法允许确定等温扩增反应的起点。因为该反应的必要组分例如酶被包埋在所述基质中，因此，它与反应缓冲液中的其它反应化合物例如模板核酸分开。这允许确定随着基质崩解而开始反应的时间点和/或条件。本发明的基质在预定条件下崩解，即当转变成所述条件时，它释放出包埋的化合物。所述基质可以被例如酶崩解、化学崩解或物理崩解。在本发明的一个实施方式中，所述基质通过pH的转变而崩解。在本发明的优选的实施方式中，通过PH的变化来改变所述基质的静电荷，导致释放出包埋的等温扩增反应的必要组分。在优选的实施方式中，通过扩散释放出至少一种包埋在所述基质中的反应组分。这允许恒定释放所述至少一种包埋的反应组分。此外，通过所述基质的酶崩解，可实现所述至少一种包埋的反应组分的恒定释放。因此，在本发明的优选的实施方式中，通过添加选自胶原酶、透明质酸酶、琼脂酶、褐藻酸酶和淀粉酶的酶使所述基质崩解。在本发明的一个实施方式中，所述基质在预定温度下崩解。在优选的实施方式中，所述基质在50°C以上、优选60°C以上、更优选65°C以上的温度下崩解。特别优选地，所述基质崩解的预定温度高于至少一个引物、优选所有引物的退火温度即大约Tm。这允许热启动等温扩增反应，因为在引物与非靶序列非特异性结合的温度下，反应没有开始。由此减少了非特异性扩增产物。退火温度是寡核苷酸引物和DNA模板在超过该温度时熔融或解离的温度。退火温度可以随模板和引物之间的序列同源性以及引物与模板的长度和GC含量而变化。可计算50%引物退火至其模板上时的退火温度，以及特定反应的最适退火温度，例如如Rychlik等，NucleicAcidsResearch,18:6401-6412,1990中所述的。优选的引物的退火温度在约50°C至75°C的范围内，优选在55°C和65°C之间，更优选在55°C和60°C之间。本领域技术人员知道适合于本发明的基质。在优选的实施方式中，所述基质选自多糖、蛋白质、蜡和合成聚合物。在更进一步优选的实施方式中，所述基质选自琼脂糖、低熔点琼脂糖、果胶、直链淀粉、琼脂、黄原胶、卡拉胶、瓜尔胶、卡如宾糖(carubin)、菊粉、葡聚糖、明胶、纤维状蛋白质(例如胶原蛋白)、聚乙烯醇、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素)。在优选的实施方式中，所述基质是琼脂糖(包括低熔点琼脂糖)。具有不同熔点的不同琼脂糖是可商购的。低熔点琼脂糖在约高于60°C的温度下熔融或崩解。高熔点琼脂糖在约高于90°C的温度下崩解。表现出的熔点在50°C和95°C之间的其它形式的琼脂糖是可商购的(例如，德国SigmaAldrichGmbH)。通过改变琼脂糖的类型和/或特定类型的琼脂糖的浓度，可实现多种特定的崩解温度，例如崩解温度为50°C以上、优选60°C以上、更优选65°C以上的组合物。为了实现琼脂糖组合物的希望的崩解温度，选择熔点在希望的崩解温度范围内的琼脂糖类型。例如，如果希望的崩解温度为约63°C，则选择熔点为65°C的低熔点琼脂糖。在水性溶液例如水或缓冲液中制备多种浓度(例如0.1%至2.5%)的琼脂糖溶液，在反应管中将其加热至熔融并冷却至胶凝点。然后重新加热琼脂糖反应管，并且可确定崩解温度。以这种方式，可选择合适的琼脂糖和它的浓度。这种选择方法可用于选择特定的基质类型和浓度，以实现所希望的本发明的组合物。在本发明的优选的实施方式中，所述基质是包含0.1%至4%(w/v)、优选0.5%至3%(w/v)、更优选1.0%至2%(w/v)琼脂糖的水凝胶。在所述基质崩解后，它优选溶解于反应介质内，即溶解于反应缓冲液中。在优选的实施方式中，所述基质形成水凝胶。水凝胶(也称为水性凝胶)是通过共价键和/或离子相互作用互连的水不溶性聚合物链的网状物。所述聚合物包含亲水性化合物。因此，在水存在下，该聚合物吸收水，在不失去所述聚合物网状物的完整性的情况下导致体积膨胀。水凝胶是高吸收性的天然聚合物或合成聚合物，其水含量为50%以上，优选70%以上，更优选80%以上，甚至更优选90%以上。在一个实施方式中，在使用水或缓冲液作为分散介质的情况下，所述基质在预定条件下崩解并形成胶态凝胶。在另外的实施方式中，通过熔融使所述基质崩解。本领域技术人员可对上述方案进行变化。例如，所述基质可由多种材料、聚合物等形成，条件是所述基质在预定条件下崩解并且所述基质不干扰等温扩增反应。为了测试基质的相容性，使用可能的基质材料和/或在不同的基质浓度范围内实施本发明的方法。监测该方法的与不含基质的对照相比的干扰性。本发明的方法、试剂盒或组合物中所使用的至少一种酶是嗜中温酶。然而，其中包埋有至少一种必要化合物的基质在相对高的温度下崩解。嗜中温酶在高于其最适温度的温度下通常不可逆地失活。本发明人出乎意料地发现，用本发明的方法有可能实现热启动过程。因此，在本发明的优选的实施方式中，在步骤ii)下的孵育温度比步骤iii)的孵育温度高1°C至50°C，优选高5°C至25°C，更优选高10°C至20°C。然而，在本发明的另外的实施方式中，本发明扩增方法的步骤ii)和步骤iii)的温度是相同的。在本发明上下文中，“等温扩增反应”是指在反应期间温度没有显著变化。在优选的实施方式中，等温扩增反应的温度偏离不超过10°c，优选不超过5°C，甚至更优选不超过2。。。取决于核酸等温扩增方法，对于扩增反应需要不同的酶。用于核酸扩增的已知的等温方法例如为解旋酶依赖性扩增(HDA)(Vincent等；“解旋酶依赖性等温DNA扩增(Helicase-dependentisothermalDNAamplification)，，，EMBOreports5(8)795-800(2004))，热稳定的HDA(tHDA)(An等，“热稳定UvrD解旋酶的表征及其在解旋酶依赖性扩增中的参与(CharacterizationofaThermostableUvrDHelicaseandItsParticipationinHelicase-dependentAmplification)，，，Jour.Biol.Chem.280(32)28952-28958(2005))，链置换扩增(SDA)(Walker等，“链置换扩增——等温的体外DNA扩增技术(Stranddisplacementamplification—anisothermal,invitroDNAamplificationtechnique)”，NucleicAcidsRes.20(7):1691-6(1992)),多重置换扩增(MDA)[Dean等，“使用多重置换扩增进行全面的人基因组扩增(Comprehensivehumangenomeamplificationusingmultipledisplacementamplification)，，，PNAS99(8)5261-5266(2002))，滚环扩增(Liu等，“滚环DNA合成小的环形寡核苷酸作为DNA聚合酶的有效模板(RollingcircleDNAsynthesisSmalIcircularoligonucleotidesasefficienttemplatesforDNApolymerases)，，，J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594(1996)),单引物等温扩增(SPIA)[Dafforn等,“从低至5ng的总RNA进行线性mRNA扩增以供总体基因表达分析(LinearmRNAamplificationfromaslittleas5ngtotalRNAforglobalgeneexpressionanalysis)，，，Biotechniques37(5):854-7(2004)),限制性辅助RCA(restrictionaidedRCA)[Wang等,“耐受样品降解的DNA扩增方法(DNAamplificationmethodtoleranttosampledegradation)，，，GenomeRes.14:2357-2366(2004)],转录介导的扩增(TMA)[Vuorinen等，“通过Gen-Probe的扩增结核分枝杆菌直接试验和罗氏AmplicorPCR结核分枝杆菌试验来直接检测呼吸道标本中的结核分枝杆菌复合群(DirectdetectionofMycobacteriumtuberculosiscomplexinrespiratoryspecimensbyGen-ProbeAmplifiedMycobacteriumTuberculosisDirectTestandRocheAmplicorPCRMycobacteriumTuberculosisTest)，，J.Clin.Microbiol.33:1856-1859(1995)]，基于核酸序列的扩增(NASBA)[Kievits等，“NASBA，为诊断HIV-1感染而优化的等温酶体外核酸扩增(NASBA,isothermalenzymaticinvitronucleicacidamplificationoptimizedforthediagnosisofHIV-linfection)，，J.Virol.Methods35:273-286(1991)]和使用切口酶的扩增反应切口酶扩增反应(NEAR)[Maples等，“用于核酸指数扩增的切口和延伸扩增反应(Nickingandextensionamplificationreactionfortheexponentialamplificationofnucleicacids)，，，US2009017453],使用重组蛋白的扩增反应重组酶聚合酶扩增(RPA)[Piepenburg等,“使用重组蛋白的DNA检测(DNADetectionUsingRecombinationProteins)”，PLoSBiol.4(7)e204(2004)],和环介导的等温扩增(LAMP)[Notomi等，“环介导的DNA等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplificationofDNA)”，NAR28(12):e63(2000)],其中至少一种用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶选自解旋酶、嗜中温聚合酶、具有链置换活性的嗜中温聚合酶、切口酶、重组蛋白、连接酶、糖基化酶和核酸酶。“解旋酶”对于本领域技术人员而言是已知的。它们是沿着核酸的磷酸二酯骨架方向移动的蛋白质，使用源自于NTP或dNTP水解、优选ATP或dATP水解的能量将两条退火的核酸链(例如DNA、RNA或RNA-DNA杂交物)分开。基于存在确定的解旋酶基序，可将解旋酶活性归因于给定的蛋白质。本领域技术人员能够选择合适的具有解旋酶活性的酶以用于本发明的方法。在优选的实施方式中，所述解旋酶选自来自不同家族的解旋酶(超家族I解旋酶(例如dda、pcrA、F质粒tral蛋白质解旋酶、uvrD),超家族II解旋酶(例如recQ、NS3解旋酶)，超家族III解旋酶(例如AAVrep解旋酶))、来自类dnaB超家族的解旋酶(例如17噬菌体解旋酶)或来自类rhci超家族的解旋酶。在优选的实施方式中，所述嗜中温聚合酶选自phi29聚合酶、Bst聚合酶、Gst聚合酶、PyroPhage聚合酶、Klenow聚合酶、DisplaceAce聚合酶。例如可以通过去除核酸酶活性或化学修饰对所有酶进行改性。在本发明上下文中，“重组蛋白”是对于DNA重组和修复过程重要的蛋白质，并且是本领域技术人员已知的。例如，它们可以选自SSB、T4gp32、recA、单链DNA转位酶、双链DNA转位酶、核酸酶、解旋酶、聚合酶、连接酶和它们的来自不同生物体的同源物。在本发明上下文中，“糖基化酶”是从DNA链中去除碱基的酶。在优选的实施方式中，糖基化酶是尿嘧啶-N-糖基化酶并且从DNA链中去除尿嘧啶。在本发明上下文中，“切口酶”是在被称为限制性位点的特定的识别核苷酸序列处水解(剪切)双链核酸中的一条链的酶。切口酶仅剪切双链核酸中的一条链，并不切割双链。切口酶是本领域技术人员已知的，并且可以例如选自Nb.BbvC1、Nb.Bsm1、Nb.BsrD1、Nb.Bts1、Nt.Alw1、Nt.BbvC1、Nt.BsmA1、Nt.BspQ1、Nt.BstNB1、Nt.CviPII。“链置换活性”是指酶能够分开双链核酸的链。在优选的实施方式中，所述嗜中温酶是具有链置换活性的聚合酶，即该聚合酶能够置换模板链的互补链，并且由此允许新链的连续聚合。数种具有链置换活性的聚合酶是本领域技术人员已知的。在本发明的优选的实施方式中，具有链置换活性的聚合酶选自噬菌体的聚合酶或选自聚合酶Bst聚合酶、Gst聚合酶、PyroPhage聚合酶、Vent聚合酶、Deep-Vent聚合酶、Klenow聚合酶、DisplaceAce聚合酶，所述噬菌体选自phi29、Cp-1、PRD-1、Phi15、Phi21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、SF5、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722和17。通过改性(例如通过去除5'-3'核酸外切酶活性)可以提高聚合酶的置换活性。在本发明上下文中，“连接酶”是能够将两个分开的核酸分子在其糖骨架处共价连接的酶，即它们将第一核酸分子的3’端OH与第二核酸分子的5’端磷酸酯基团共价连接以形成磷酸二酯，并且由此形成连续的核酸链。连接酶可连接单链核酸以及双链核酸。此外，连接酶可闭合例如由切口酶产生的双链核酸的单链断裂。连接酶可以选自DNA连接酶和RNA连接酶。合适的连接酶是本领域技术人员已知的，并且可例如选自T4连接酶、RNA连接酶和热稳定聚合酶。本领域技术人员将理解，在本发明的上下文中，所使用的上述酶中的至少一种是嗜中温的，即所述方法中使用的其它酶可以是嗜热的，只要至少一种在所述扩增反应中涉及的酶不是嗜热的即可。例如，嗜热聚合酶可以与解旋酶一起使用。在这种情况下，该解旋酶是所述至少一种嗜中温酶。本发明的方法令人惊讶地非常适合于不同的等温扩增方法。通过将等温扩增反应的必要组分包埋在基质中，本发明提供了用于扩增核酸的改进方法，其克服了现有技术方法的上述缺点。本发明的方法可以适用于所希望的等温扩增方法。在本发明的优选的实施方式中，用于核酸等温扩增的方法选自解旋酶依赖性扩增(HDA)、热稳定的HDA(tHDA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增、单引物等温扩增(SPIA)、限制性辅助RCA、转录介导的扩增(TMA)、和使用切口酶的扩增反应切口酶扩增反应(NEAR)、使用重组蛋白的扩增反应重组酶聚合酶扩增(RPA)、反转录。在本发明的上下文中，特定类型的核酸可以是RNA、DNA、cDNA(互补DNA)、LNA(锁核酸)、mRNA(信使RNA)、mtRNA(线粒体RNA)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)、nRNA(核RNA)、siRNA(小干扰RNA)、snRNA(核小RNA)、snoRNA(核仁小RNA)、scaRNA(小卡哈尔体特异性RNA(SmallCajalBodyspecificRNA))、microRNA、dsRNA(双链RNA)、核酶、核糖开关、病毒RNA、dsDNA(双链DNA)、ssDNA(单链DNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、病毒DNA、mtDNA(线粒体DNA)、nDNA(核DNA)、或snDNA(核小DNA)等，或者任何其它类型或子类的核酸，其可与样品中的主体核酸相区分。可以使用任何合适的方法来制备寡核苷酸引物，所述方法例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动实施方式。在一个这样的自动实施方式中，二乙基亚磷酰胺被用作起始材料，并且可以如Beaucage等，TetrahedronLetters,22:1859-1862(1981)所述的进行合成。在美国专利No.4,458,006中描述了一种用于在改性固体载体上合成寡核苷酸的方法。还可以使用从生物来源分离的引物(例如限制性核酸内切酶消化)。优选的引物的长度为约6至100个碱基，更优选约20至50个碱基，最优选约20至40个碱基。在本文中使用时，术语“dNTP”是指脱氧核苷三磷酸。此类dNTP的非限制性实例为dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，其还可以以例如包含荧光标记、放射性标记、生物素标记的标记衍生物的形式存在。还包括具有改性核苷酸碱基的dNTP，其中所述核苷酸碱基例如为次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤核苷(xanthin0Sine)、7-甲基鸟苷、5，6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氢尿苷、5-甲基胞苷。此外，在本发明中包括上述分子的ddNTP。在本文中使用时，术语“NTP”是指核苷三磷酸。此类NTP的非限制性实例为ATP、GTP、CTP、TTP、UTP，其还可以以例如包含荧光标记、放射性标记、生物素标记的标记衍生物的形式存在。等温扩增反应的必要辅助因子是本领域技术人员已知的，并且取决于使用的酶。它们可以是有机或无机化合物。无机化合物例如可以选自金属离子Mg、Mn、Ca、Fe、Cu、Ni。有机辅助因子可以选自维生素、蛋白质、生物素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、和核苷酸例如ATP。在本发明的试剂盒内，包含所述至少一种必要组分的基质可以被提供为不同的形式。例如，它可以被提供为珠粒，或者所述基质可以被包含在其中将发生反应的反应容器内，例如反应容器的底部。在本发明的一个实施方式中，将包含所述至少一种用于等温扩增的必要组分的基质冻干。可以对包含包埋的嗜中温酶的基质进行进一步改性，以例如调节所述嗜中温酶的释放速率。例如，所述基质可涂覆有一种或多种另外的基质，例如崩解温度更低的基质，从而得到多层基质。因此，在一个实施方式中，包含至少一种用于等温扩增反应的必要组分的基质涂覆有第二基质。在另外的实施方式中，将等温扩增反应的其他必要组分包埋于第二基质中。这允许发生多步骤的等温扩增反应。例如，首先在使第二基质崩解的条件下处理包含所述多层基质的反应混合物，导致释放出包埋在其中的等温扩增反应的必要组分，例如第一对引物。之后，在允许通过使用第一对引物来扩增靶核酸的条件下处理该反应混合物。在适当时间之后，可以将所述混合物转移至使第一基质崩解并释放出包埋在其中的必要组分例如第二对引物(巢式引物)的条件下，然后在用于等温扩增反应的条件下进行孵育。由此，本发明提供了用于顺序等温扩增的方法，而不需要重新打开反应容器以添加不同扩增步骤的组分例如巢式引物。然而，可以根据需要选择所述包埋在基质中的至少一种组分。本领域技术人员能够在包埋的等温扩增反应的必要组分方面调整本发明。例如，他可以选择将对室温不敏感的必要组分包埋于基质中。这将允许在室温下储存所述基质。然而，在优选的实施方式中，在基质中的必要组分选自所述用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶、dNTP和/或NTP、必要辅助因子和至少一个用于扩增靶核酸的引物。在用于包埋嗜中温酶的方法的优选实施方式中，通过在至少40°C、优选至少50°C、更优选至少65°C的温度下孵育使所述基质溶解。本领域技术人员承认，可在相对高的温度例如65°C下使所述基质溶解，但是可以在较低的温度下与所述包含至少一种嗜中温酶的溶液进行混合，条件是所述基质材料不固化。在优选的实施方式中，在40°C至70°C之间的温度下进行所述混合。在适当的混合之后，所述基质和所述包含至少一种嗜中温酶的溶液将形成均匀的混合物。此后，在所述混合物内的基质将固化。因此，在允许所述基质固化的条件下孵育所述基质-酶混合物以获得包埋的嗜中温酶。在优选的实施方式中，在50°C以下、优选40°C以下、更优选30°C以下、甚至更优选20°C以下的温度下孵育所述基质-酶混合物。在包埋嗜中温酶之后，可以进一步处理所述基质。在本发明的一个实施方式中，所述包埋方法还包括将包埋的嗜中温酶冻干的步骤。本发明还涉及本发明的组合物和/或试剂盒在选自以下的方法中的应用等温核酸扩增、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热稳定的HDA(tHDA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增、单引物等温扩增(SPIA)、限制性辅助RCA、转录介导的扩增(TMA)、和切口酶扩增反应(NEAR)、以及本发明的方法。实施例实施例1:通过将引物包埋在基质中来减少非特异性产物将包含2.0%低熔点琼脂糖(德国SigmaAldrichGmbH)的溶液与沙眼衣原体(Clamydiatrachomatis)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoea)的特异性引物和探针(淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoea)特异性引物NGopaDvFl,NGopaDvR;沙眼衣原体(C.trachomatis)特异性引物CT_plF9,CT-plR17;FAM标记的沙眼衣原体(C.trachomatis)特异性探针CT_plp6FAM；TEX标记的淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoea)特异性探针NGopaDblTEX)混合。随后将该混合物加热至65°C以获得熔融的琼脂糖/引物/探针混合物。将15Ul熔融的琼脂糖/引物/探针混合物施加到反应容器中并将其冷却。由此在该容器的底部上形成了包含引物和探针的水凝胶。基质的最终琼脂糖浓度为1.0%。含有上述引物和探针而不含有琼脂糖的反应容器用作参照。表1:引物和探针序列权利要求1.用于核酸等温扩增的方法，所述方法包括以下步骤i)至少提供以下反应组分a)用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶；b)一个或多个用于扩增靶核酸的引物；c)dNTP和/或NTP；d)用于在等温条件下扩增核酸的酶的必要辅助因子和/或试剂；e)至少一种祀核酸；其中将反应组分a)至e)中的至少一种包埋在基质中，其中所述基质在60°C以上、优选65°C以上的温度下崩解；ii)在导致所述基质崩解的条件下孵育反应组分，以便获得反应混合物；iii)在适用于等温扩增反应的条件下孵育反应混合物；其中在步骤ii)下的孵育温度比步骤iii)的孵育温度高1°C至50°C，优选高5°C至25°C，更优选高10°C至20°C。2.权利要求1的方法，其中用于扩增核酸的嗜中温酶的最适温度为20°C至70°C，优选30°C至65°C，更优选37°C至60°C。3.权利要求1至2的方法，其中基质形成水凝胶。4.权利要求1至3任一项的方法，其中基质选自多糖(琼脂糖、低熔点琼脂糖、果胶、直链淀粉、琼脂、黄原胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、瓜尔胶、卡如宾糖、菊粉、葡聚糖)、蛋白质(明胶、纤维状蛋白质)、蜡和合成聚合物(聚乙烯醇、纤维素衍生物)。5.权利要求1至4任一项的方法，其中至少一种用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶选自解旋酶、嗜中温聚合酶、具有链置换活性的嗜中温聚合酶、切□酶、重组蛋白、连接酶、糖基化酶和核酸酶。6.权利要求1至5任一项的方法，其中用于核酸等温扩增的方法选自解旋酶依赖性扩增(HDA)、热稳定的HDA(tHDA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增、单引物等温扩增(SPIA)、限制性辅助RCA、转录介导的扩增(TMA)、和使用切口酶的扩增反应切口酶扩增反应(NEAR)、使用重组蛋白的扩增反应重组酶聚合酶扩增(RPA)。7.用于核酸等温扩增的试剂盒，所述试剂盒包含-用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶，-在预定条件下崩解的基质；其中至少一种对于核酸等温扩增必要的组分被包埋在所述基质中。8.权利要求7的试剂盒，其中被包埋在所述基质中的组分选自所述用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶、dNTP和/或NTP、必要辅助因子、和一个或多个用于扩增靶核酸的引物。9.权利要求7或8的试剂盒，其中用于扩增核酸的嗜中温酶选自解旋酶、嗜中温聚合酶、具有链置换活性的嗜中温聚合酶、切口酶、重组蛋白、连接酶、核酸酶和糖基化酶。10.组合物，其包含-在预定条件下崩解的基质；和-至少一种用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶。11.权利要求10的组合物，其中基质在至少40°C、优选至少50°C、更优选至少65°C的温度下崩解。12.权利要求10或11的组合物，其中基质选自多糖(琼脂糖、低熔点琼脂糖、果胶、直链淀粉、琼脂、黄原胶、卡拉胶、羧甲基纤维素、瓜尔胶、卡如宾糖、菊粉、葡聚糖)、蛋白质(明胶、纤维状蛋白质)和合成聚合物(聚乙烯醇、纤维素衍生物)。13.权利要求10至12任一项的组合物，其中用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶选自解旋酶、嗜中温聚合酶、具有链置换活性的嗜中温聚合酶、切口酶、重组蛋白、连接酶、核酸酶和糖基化酶。14.包埋用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶的方法，其包括以下步骤i)提供溶解的基质；ii)将所述基质与包含用于在等温条件下扩增核酸的嗜中温酶的溶液混合以获得基质-酶混合物；iii)在允许基质固化的条件下孵育基质-酶混合物以获得包埋的嗜中温酶。15.权利要求14的方法，其还包括将包埋的嗜中温酶冻干的步骤。16.权利要求10至13任一项的组合物和/或权利要求7至9任一项的试剂盒在选自以下的方法中的应用等温核酸扩增、解旋酶依赖性扩增(HDA)、热稳定的HDA(tHDA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增、单引物等温扩增(SPIA)、限制性辅助RCA、转录介导的扩增(TMA)、和切口酶扩增反应(NEAR)、以及权利要求1至6中任一项的方法。全文摘要本发明公开了用于改进的核酸等温扩增的方法，所述方法包括在预定条件下从基质释放出必要组分的步骤。此外，本发明涉及试剂盒，所述试剂盒包含嗜中温酶和包埋有用于等温扩增的必要组分的基质。本发明还公开了包含基质和嗜中温酶的组合物，和用于包埋嗜中温酶的方法。文档编号C12Q1/68GK103025892SQ201180035890公开日2013年4月3日申请日期2011年8月9日优先权日2010年8月10日发明者克里斯蒂安·科哈格申请人:凯杰有限公司