Fdp测定用试剂及试剂盒、以及测定方法

专利名称：Fdp测定用试剂及试剂盒、以及测定方法
FDP测定用试剂及试剂盒、以及测定方法
技术领域：
本发明涉及用于测定作为纤维蛋白及纤维蛋白原的分解产物的FDP的试剂及试剂盒、以及测定FDP的方法。
背景技木由止血或某种病的因素，如果血管内或组织中发生血栓(稳定化纤维蛋白)，为了将其除去，在活体内发生纤溶反应。溶解此血栓的纤溶反应被称为二次纤溶，血栓中的纤维蛋白由纤溶酶等的酶的作用而分解而在血中生成纤维蛋白分解产物(FbnDP ;二次纤溶物)。另ー方面，在活体内，也发生不伴随血栓的形成而发生的被称为一次纤溶的纤溶反应。在一次纤溶中，纤维蛋白原由纤溶酶等的酶的作用而分解而在血中生成纤维蛋白原分解产物(FbgDP ;一次纤溶物)。这些纤维蛋白及纤维蛋白原的分解产物被总称为FDP (fibrinogenand fibrin degradation products)。 在血中的FDP的存在成为推测活体的纤溶亢进的指标。所以，现在，血中的FDP的測定在涉及血栓、循环器障碍、纤溶亢进、异常出血等的疾病或弥散性血管内凝血综合征(DIC)等的诊断中利用。特别是，为了分类DIC的病态，要求无关于FDP的种类而测定总FDP量。在血中的FDP的测定用试剂中，一直以来适用免疫学方法，例如有利用免疫比浊法的试剂在市售。作为那样的FDP測定用试剂，有使用抗人纤维蛋白原抗体等的多克隆抗体的试剂。但是，在使用此试剂的FDP測定中，如果作为待测样品，不使用血清等，除去纤维蛋白原的活体样品，则FDP測定值拟似性地变成高值。但是，制备血清的作业是烦琐的。另夕卜,在如PT (凝血酶原时间)、APTT (活化部分促凝血酶原激酶时间)、Fbg (纤维蛋白原浓度)一祥的血液凝固检查中，由于作为待测样品而使用血浆，所以在临床现场中，优选使用可使用血浆的单克隆抗体的血浆FDP测定用试剂(參照专利文献I 5)。现有技术文献专利文献专利文献1:特公平5-38906号公报专利文献2:特公平7-46104号公报专利文献3:专利第3472138号公报专利文献4:特开2001-354700号公报专利文献5:特开2002-372536号公报

发明内容发明要解决的技术课题使用血清的FDP測定用试剂对一次纤溶物及二次纤溶物均等地反应。但是，在以往的血浆FDP測定用试剂中，在使用的单克隆抗体的，对一次纤溶物的反应性和对二次纤溶物的反应性之间确认差异。即，在以往的血浆FDP測定用试剂中，相比对一次纤溶物的反应性，对二次纤溶物的反应性有更高的倾向。一般而言，在生理性的条件下不发生纤维蛋白原的分解。从而，由于在FDP中二次纤溶物占大部分，所以上述的反应性的差在通常的測定中不成问题。但是，在DIC、急性全骨髓性白血病等的患者中，血中的纤溶酶的活性变得过量，一次纤溶成为亢进的状态。即，在从那样的状态的受试者得到的活体样品中含一次纤溶物。从而，在对一次纤溶物的反应性低的以往的血浆FDP測定用试剂中有无法正确地測定在纤溶亢进状态的受试者的总FDP量的担忧。本发明g在提供通过与一次纤溶物及二次纤溶物的两方均一地反应，可正确地测定在纤溶亢进状态的受试者的FDP的试剂及试剂盒。再者，本发明g在提供使用该试剂及试剂盒的FDP的测定方法。解决课题的技术方案
本发明人在进行锐意研究的结果发现，通过使用含致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液的试剂，该载体粒子与活体样品中的一次纤溶物及二次纤溶物均一地反应，从而完成本发明。即，本发明提供FDP測定用试剂，其含致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体，其选自不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应的第I单克隆抗体、不与X级分及D级分反应,但与XDP级分、DD/E级分、DD级分及Y级分反应的第2单克隆抗体、及不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应，对于FDP的反应性与第I单克隆抗体不同的第3单克隆抗体。另外，本发明提供FDP測定用试剂盒，其含含缓冲液的第I试剂、及上述的含致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体的第2试剂。再者，本发明提供FDP測定方法，其包括上述的将致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液和活体样品混合的步骤，以及測定由抗原抗体反应产生的，上述载体粒子的凝集的程度的步骤。发明效果本发明的FDP測定用试剂及试剂盒、以及測定方法对于用以往的FDP測定用试剂正确的測定是困难的含一次纤溶物的活体样品，也可高精度測定FDP。另外，本发明的FDP測定用试剂及试剂盒、以及測定方法，由于对一次纤溶物及ニ次纤溶物均等反应，所以作为待测样品而可使用血清及血浆二者。

图1是示本发明的FDP测定试剂的对一次纤溶物及二次纤溶物的反应性的坐标图。图2是示本发明的FDP测定试剂的对一次纤溶物和二次纤溶物的反应比率的坐标图。图3是示在本发明的FDP測定试剂及他公司制品中，对一次纤溶物和二次纤溶物的反应比率的差异的坐标图。实施方式在本说明书中，“ FDP”是指纤维蛋白分解产物及纤维蛋白原分解产物二者。在本说明书中，“纤维蛋白分解产物”也被称为二次纤溶物，是作为由凝血酶等的酶的作用而血液中的纤维蛋白原凝固而形成的聚合物的稳定化纤维蛋白被纤溶酶等的酶分解而发生的蛋白质组。作为纤维蛋白分解产物，可举出DD级分、DD/E级分、XDP级分等。作为XDP级分，可举出DD/E级分的多聚体、例如作为DD/E级分的3聚体的DXD/YY级分、作为DD/E级分的5聚体的YXY/DXXD级分、作为DD/E级分的7聚体的DXXD/YXXY级分等。另夕卜，在所述技术中，XDP级分也被总称为D ニ聚体。在本说明书中，“纤维蛋白原分解产物”也被称为一次纤溶物，是血液中存在的纤维蛋白原被纤溶酶等的酶分解而发生的蛋白质组。作为纤维蛋白原分解产物可举出X级分、Y级分、D级分及E级分。在本说明书中，“对于FDP的反应性”由抗FDP单克隆抗体特异性地反应的FDP的种类而规定，或者，由致敏抗FDP单克隆抗体的载体和FDP的抗原抗体反应产生的凝集的程度规定。从而，在可在某抗FDP单克隆抗体和别的抗FDP单克隆抗体之间特异性地反应的FDP的种类互相不同之时，这些的抗体的对于FDP的反应性被确定为互相不同。另外，与互相相同的种类的FDP反应时，在各自使用致敏某抗FDP单克隆抗体的载体和致敏别的抗FDP单克隆抗体的载体的FDP测定中，在凝集的程度互相显著地不同之时，这些的抗体的对于FDP的反应性被确定为互相不同。本发明的FDP測定用试剂(以下，也被称为本发明的试剂)中使用的单克隆抗体是对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体。作为那样的单克隆抗体，从以下的第I单克隆抗体、第2单克隆抗体及第3单克隆选择至少2种是优选的。第I单克隆抗体是不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应的抗体。第2单克隆抗体是不与X级分及D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分及Y级分反应的抗体。第3单克隆抗体是不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应，对于FDP的反应性与第I单克隆抗体不同的抗体。作为本发明的试剂中含的单克隆抗体的组合，可举出例如“第I单克隆抗体和第2单克隆抗体”、“第I单克隆抗体和第3单克隆抗体”、“第2单克隆抗体和第3单克隆抗体”及“第I单克隆抗体和第2单克隆抗体和第3单克隆抗体”。上述的第1、第2及第3单克隆抗体是来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马等之任何的哺乳动物的抗体也可，但在它们之中小鼠也是优选的。另外，抗体的同种型是IgG、IgM、IgE、IgA等之任何也可。在抗体中含抗体的片段及其衍生物。作为具体例，可举出Fab片段、F (ab’)2片段等。上述的第1、第2及第3单克隆抗体可由所述技术中公知的免疫学方法得到。即，通过作为抗原将FDP (—次纤溶物及/或二次纤溶物)和佐剂任意地混合而免疫动物，将从该动物取得的B淋巴细胞和适当的骨髓瘤细胞融合而制备杂交瘤，纯化该杂交瘤的培养上清，可得到单克隆抗体。
具体而言，由以下的方法可得到本发明的试剂中使用的第1、第2及第3单克隆抗体。
抗原的取得
作为抗原使用的FDP可通过使如纤溶酶一样的可分解纤维蛋白及纤维蛋白原的酶作用于纤维蛋白及纤维蛋白原而得到。再有，成为FDP的原料的纤维蛋白及纤维蛋白原有市售。另外，纤维蛋白可通过向纤维蛋白原作用凝血酶、第XIII因子及钙盐而得到。
免疫方法
可用将如上述一样得到的抗原与佐剂任意地混合，在适当的缓冲液中溶解或悬浮而得到的抗原液免疫动物。该抗原液中的抗原的浓度是50 500 μ g/ml左右是优选的。抗原的免疫原性低时，也可将如白蛋白、钥孔青贝血蓝蛋白一样的载体蛋白质任意地与抗原彡口口
作为佐剂，可使用在所述技术中公知的佐剂。作为那样的佐剂，可举出例如弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、Ribi (MPL),Ribi (TDM),Ribi (MPL+TDM)、百日咳疫苗(Bordetella pertussis vaccine)、胞壁酰二肽(MPD)、招佐剂(ALUM)及这些的组合。在初次免疫时使用FCA，在追加免疫时使用FIA或Ribi佐剂的组合是特别优选的。
待免疫的动物是小鼠、大鼠、仓鼠、马、山羊、兔等之任何均可，优选为小鼠、更优选是BALB/c小鼠。
免疫法可根据使用的抗原的种类或佐剂的有无而适宜选择。例如使用小鼠时，将佐剂混合抗原液O. 05 Iml (抗原10 200 μ g)注射到腹腔内、皮下、肌肉内或尾静脉内， 从初次免疫每约4 21天进行I 4次追加免疫，再者约I 4周后，进行最终免疫。通过使抗原量变多而进行腹腔内注射，不向抗原液使用佐剂而进行免疫也可。追加免疫的约 5 10天后，采集血液而测定抗体价。抗体价可根据如后述的抗体价测定一样的本技术中公知的方法测定。从最终免疫约3 5天后，从被免疫的动物摘出脾脏，分离脾脏细胞而可得到产生抗体的细胞。
单克隆抗体的制备
单克隆抗体可根据所述技术中公知的方法、例如Kohler及Milstein, Nature, 256，495-497 (1975)所述的方法制备。
使用的骨髓瘤细胞是小鼠、大鼠、人等任何的哺乳动物来源的细胞均可，可举出例如小鼠骨髓瘤 P3 X 63-Ag8、P3 X 63_Ag8_Ul、P3NSl-Ag4、SP2/o_Agl4、P3 X 63_Ag8 ·653 等的株化骨髓瘤细胞。在骨髓瘤细胞之中有产生免疫球蛋白轻链的种类的骨髓瘤细胞，将其作为融合对象使用，则产生抗体的细胞产生的免疫球蛋白重链和此轻链随机地结合。从而，使用不产生免疫球蛋白轻链的骨髓瘤细胞、例如P3X63-Ag8 · 653、SP2/o_Agl4等是优选的。 产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞是同种动物、特别是同系统的动物来源的细胞是优选的。
作为将产生抗体的细胞和骨髓瘤细胞融合而制备杂交瘤的方法，可举出使用聚乙二醇(PEG)的方法、使用仙台病毒的方法、使用电融合装置的方法等。使用PEG时，在含约 30 60%的PEG (平均分子量1000 6000)的适当的培养基或缓冲液中将脾脏细胞和骨髓瘤细胞以I 10:1、优选为5 10:1的混合比悬浮，在温度约25 37°C、pH6 8的条件下反应约30秒钟 3分钟左右即可。反应结束后，清洗细胞，除去含有PEG的溶液而再悬浮于培养基中，接种到微滴定板上培养。
将如上述一样融合的细胞在选择培养基上培养，可进行杂交瘤的选择。作为选择 培养基，只要是仅融合细胞可增殖的培养基即可，可使用例如次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧 啶(HAT)培养基。杂交瘤的选择，通常、可在细胞融合的I 7天后，与培养基之一部分、优 选为约半量的选择培养基交换，再每2 3天同样重复培养基交换而培养,在培养结束后， 通过显微镜观察选择杂交瘤的集落生长的孔来进行。
如此得到的杂交瘤是否产生所望的抗体，可通过采集该杂交瘤的培养上清，进行 抗体价分析来确认。抗体价分析可通过所述技术中公知的方法进行。例如，可通过向固定化 到固相的抗原蛋白质添加阶段稀释的培养上清，再与用荧光物质、酶或放射性同位素(RI) 标记的第二抗体(抗球蛋白抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体等)反应而检测抗体。
由上述的抗体价测定确认产生所望的抗体的杂交瘤，可由有限稀释法、软琼脂法、 使用荧光激发细胞分选仪的方法等，分离单一克隆。例如在有限稀释法的情况中，通过在培 养基中阶段稀释而培养至杂交瘤的集落成I细胞/孔左右，可单离产生目的抗体的杂交瘤。
从杂交瘤的单克隆抗体的取得方法可根据单克隆抗体的必要量或杂交瘤的性状 适宜选择。可举出例如，从移植该杂交瘤的小鼠的腹水取得的方法、由细胞培养从培养上清 取得的方法等。只要是可在小鼠的腹腔内增殖的杂交瘤，从腹水可得到数mg/ml的高浓度 的单克隆抗体。在体内无法增殖的杂交瘤的情况中，可从细胞培养的培养上清取得单克隆 抗体。此时，尽管产生抗体的量低，但免疫球蛋白或其他杂质的混入少而容易纯化。
从移植杂交瘤的小鼠腹腔内取得抗体时，向预先施用例如如姥鲛烷 (2，6，10，14-四甲基十五烷)一样的有免疫抑制作用的物质的BALB/c小鼠的腹腔内移植杂 交瘤(约IXlO6个以上)，约I 3周后，采集贮留的腹水。在移植异种杂交瘤时，使用裸鼠、 放射线处理小鼠等是优选的。
从细胞培养上清取得抗体时，例如除了细胞维持使用的静置培养之外，由高密度 培养法或旋转瓶培养法等培养杂交瘤，可得到含有抗体的培养上清。如果向培养基添加血 清，则含其他抗体或白蛋白等的杂质，抗体的纯化多会变得烦琐，所以使向培养基的血清的 添加量尽可能少是优选的。将杂交瘤由惯用的方法在无血清培养基中驯化，在无血清培养 基中培养是更优选的。由此，抗体纯化变得容易。
从腹水或培养上清的单克隆抗体的纯化可通过公知的方法进行，可举出例如通过 使用硫酸铵、硫酸钠等的盐的盐析的分级分离法、聚乙二醇分级分离法、乙醇分级分离法、 DEAE离子交换层析法、基于凝胶过滤层析法等的方法。
目的的抗体是小鼠IgG时，可利用使用蛋白A结合载体或抗小鼠免疫球蛋白结合 载体的亲和层析法来纯化抗体。
作为本发明的试剂中使用的第I单克隆抗体，可举出例如由以保藏号NITE BP-950在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、 日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，于2010年6月I日保藏的杂交瘤“FDP3-797”产 生的抗体(以下，也被称为“FDP3-797抗体”)。
作为本发明的试剂中使用的第2单克隆抗体，可举出例如由以保藏号NITE BP-951在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、 日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，于2010年6月I日保藏的杂交瘤“FDP3-2935”产生的抗体(以下，也被称为“FDP3-2935抗体”)。
作为本发明的试剂中使用的第3单克隆抗体，可举出例如由以保藏号NITE BP-952在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(邮政编码292-0818、 日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，于2010年6月I日保藏的杂交瘤“DD-M1051”产生的抗体(以下，也被称为“DD-M1051抗体”)。
在本发明的试剂中，各单克隆抗体之间的浓度比不特别限定，本领域技术人员可适宜决定。
本发明的试剂含选自上述的第1、第2及第3单克隆抗体的，致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体。作为那样的载体，可举出有机高分子化合物、无机化合物、红细胞等。作为有机高分子化合物，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、纤维素、乳胶、聚苯乙烯、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-缩水甘油基(甲基)丙烯酸共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、聚醋酸乙烯基丙烯酸酯等。作为无机化合物，可举出氧化硅、氧化铝等。
上述的载体的形状不特别限定，是球状、平面状等任何的形状也可。是球状时，载体粒子的平均径可根据测定机器等适宜选择，但通常是O. 05 O. 5 μ m为适当的。作为粒子的材质，乳胶是特别优选的。
作为用第1、第2及第3单克隆抗体致敏载体的方法，所述技术中公知的物理的吸附法及化学结合法之任何也可，但由于操作简便，而物理吸附法是优选的。
上述的载体是粒子的情况中，该载体粒子是致敏上述的2种或3种单克隆抗体的载体粒子也可，是各单克隆抗体各自个别地致敏的载体粒子的混合物也可。第1、第2及第 3单克隆抗体之间向载体粒子的致敏条件互相不同时，用各抗体个别地致敏 载体粒子是优选的。
上述的载体粒子是乳胶粒子时，将致敏上述的单克隆抗体的载体粒子在适当的缓冲液中悬浮。悬浮液中的乳胶粒子的浓度优选为O. 5 10mg/ml、更优选是O. 75 5mg/ml。 另外，该悬浮液中的单克隆抗体的总浓度优选为10 100 μ g/ml、更优选是20 50 μ g/ ml ο
作为上述的缓冲液，可举出在pH5 10、优选为pH6 9有缓冲作用的缓冲液。具体而言，可举出例如磷酸缓冲液、咪唑缓冲液、三乙醇胺-盐酸、Good缓冲液等。作为Good缓冲液，可举出 MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS, M0PS0, BES, TES, HEPES, HEPPS, Tricine、Tris、Bicine、TAPS 等的缓冲液。它们之中 M0PS0 也是优选的。
上述的缓冲液可再含蛋白质稳定化剂(例如BSA等)、防腐剂(例如叠氮化钠、苯基甲磺酰氟等)、PH调节剂、增感剂(例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚阴离子、聚乙二醇、多糖类等)、 无机盐(例如氯化钠、氯化钙等)、背景抑制剂(例如人抗小鼠抗体(HAMA)吸收剂等)等的添加物。
作为本发明的试剂之一实施方式，可举出FDP测定用试剂盒(以下，也被称为本发明的试剂盒)。本发明的试剂盒含含缓冲液的第I试剂，和含致敏选自上述的第1、第2及第3单克隆抗体的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液的第2试剂。
本发明的试剂盒是用于由免疫测定、例如使致敏上述的至少2种单克隆抗体的乳胶粒子和活体样品中的FDP反应的测定(乳胶凝集法)等，检测该样品中的FDP的试剂盒。
作为本发明的试剂盒中使用的第1、第2及第3单克隆抗体之一例，各自可举出 FDP3-797 抗体、FDP3-2935 抗体及 DD-M1051 抗体。
本发明的试剂盒的形态是如上所述含第I试剂和第2试剂的2试剂型的形态，但是含I个试剂的I试剂型的形态也可。从测定精度的观点等，作为试剂盒的形态，含第I试剂和第2试剂的2试剂型是优选的。更优选为，本发明的试剂盒是含含缓冲液的第I试剂，和含上述的本发明的FDP测定用试剂的第2试剂的形态。
作为可在构成本发明的试剂盒的第I试剂中使用的缓冲液，可举出与在本发明的试剂中可在载体粒子的悬浮中使用的缓冲液相同的缓冲液。第I试剂含上述的蛋白质稳定化剂、防腐剂、PH调节剂、增感剂、无机盐等的添加物也可。
本发明的FDP测定方法可使用本发明的FDP测定用试剂或试剂盒实施。作为本发明的FDP测定方法之一实施方式，对于使用本发明的FDP测定用试剂盒测定活体样品中的 FDP的方法，接下来具体说明。
首先，将含缓冲液的第I试剂和活体样品混合而温育。其中，作为活体样品，可举出从受试者得到的血清、血浆、尿等。将第I试剂和活体样品混合之时的容量比是5:1 50:1左右即可。另外，温育时间是I 10分钟左右即可。
接下来，向第I试剂和活体样品的混合物添加含致敏选自上述的第1、第2及第3 单克隆抗体的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液的第2试剂。将该混合物和第2试剂混合之时的容量比是1:0. 05 1:1. 5左右即可。
如果添加第2试剂而混合，则由抗原抗体反应,发生FDP和第2试剂中的载体粒子的凝集。将此凝集的程度作为每I分钟的吸光度的变化量测定。此测定用可测定散射光强度、吸光度或透射光强度的光学机器进行是优选的。另外，测定波长可选择300 2400nm、 优选为300 lOOOnm、更优选为从500 IOOOnm的范围适宜的波长。
活体样品中的FDP的浓度及/或量可使用由浓度已知的FDP标准物质的测定得到的标准曲线，从测定的吸光度的变化量算出。
在本发明的试剂盒中，将第I试剂和第2试剂混合之后，向两试剂的混合物添加活体样品而可将载体粒子的凝集的程度也在以光学方法测定的方法中利用。
再有，作为本发明的FDP测定方法中使用的第1、第2及第3单克隆抗体之一例，各自可举出FDP3-797抗体、FDP3-2935抗体及DD-M1051抗体。
接下来对实施例进行说明，但本发明不限于这些实施例。实施例
试验例1:各单克隆抗体的反应性的检查
作为第1、第2及第3单克隆抗体，各自使用FDP3-797抗体、FDP3-2935抗体及 DD-M1051抗体，将对各抗体的纤维蛋白及纤维蛋白原分解产物的反应性的差异通过如以下一样的ELISA法检查。
(I) FDP 的制备
(7-1)纤维蛋白原分解产物(FbgDP)的制备
向纤维蛋白原(Sigma公司)241mg (39. 7mg/ml)添加纤溶酶(Sigma公司)至终浓度达60mU/ml，于37°C反应8小时。其后，加抑肽酶至终浓度达lU/ml，停止分解反应。将得到的反应液用12000 Xg离心20分钟，将得到的上清填充到用50mM Tris缓冲液(pH7. 4) 平衡化的赖氨酸-琼脂糖4B柱(硼8ml)而进行层析之后，用旋柱除琼脂糖，制备FbgDP溶液。使用蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司)测定得到的FbgDP溶液的蛋白质浓度。另外，Fb 将gDP溶液之一部分在后述的本发明的FDP测定用试剂的向FDP的反应性的确认中使用。
将得到的FbgDP溶液由超滤用离心管(Amiconl550K ；Millipore公司)用样品缓冲液(62. 5mM Tris、192mM甘氨酸、l%SDS(pH6. 8))取代2次。将得到的溶液填充到S^hacryl S-300 (GE Healthcare公司)，使用蠕动泵使以流速70 80 μ I/分流动而每10分钟回收级分。对于得到的各级分，通过使用分子量标志物的SDS-PAGE解析，各自回收含X级分、Y 级分及D级分的级分。将其由Amiconl550K (Millipore公司)用磷酸缓冲液(PBS)取代2 次，作为FbgDP抗原。
(1-2)纤维蛋白分解产物(FbnDP)的制备
向纤维蛋白原(Sigma公司)92mg (23mg/ml)加氯化I丐、人凝血酶(三菱Pharma公司)及第XIII因子(NIPRO公司)至终浓度分别达25mM、4U/ml及O. 05U/ml，于37°C反应一晚，将纤维蛋白原变换为纤维蛋白。将反应液中产生的纤维蛋白凝胶用Tris缓冲液(TBS (pH7. 4)) 50ml清洗，在4°C、3000Xg离心10分钟而回收纤维蛋白凝胶。将此操作重复2 次之后，使用50ml注射器将纤维蛋白凝胶弄碎。将纤维蛋白凝胶再悬浮于TBS (pH7.4) 4. 6ml。向悬浮液添加纤溶酶至终浓度达75mU/ml，于37°C反应6小时。其后，加抑肽酶至终浓度达lU/ml，停止分解反应。将得到的反应液用12000 X g离心20分钟，将得到的上清填充到用50mM Tris缓冲液(pH7. 4)平衡化的赖氨酸-琼脂糖4B柱(硼3. 5ml)而进行层析之后，用旋柱除琼脂糖，制备FbnDP溶液。使用蛋白质定量试剂(Bio-Rad公司)测定得到的FbnDP溶液的蛋白质浓度。另外，将FbnDP溶液之一部分在后述的本发明的FDP测定用试剂的向FDP的反应性的确认中使用。
将得到的FbnDP溶液由超滤用离心管(Amiconl550K ；Millipore公司)用样品缓冲液(62. 5mM Tris、192mM甘氨酸、l%SDS(pH6. 8))取代3次。将得到的溶液填充到S^hacryl S-300CGE Healthcare公司)，使用蠕动泵使以流速2ml/分流动而每30秒钟回收级分。对于得到的各级分，通过使用分子量标志物的SDS-PAGE解析，各自回收含XDP级分、DD/E级分、DD级分的级分。将其由Amiconl550K (Millipore公司)用磷酸缓冲液(PBS)取代2次， 作为FbnDP抗原。
将各抗FDP单克隆抗体溶液用PBS稀释为O. 5 μ g/ml，各自将各100 μ I分注于96 孔微滴定板的孔，于4°C静置18小时。其后，用含O. 05%Tween20的IOmM磷酸缓冲液(pH7. O) (以下，被称为清洗液)将孔清洗3次。接下来，向孔填充含1%BSA的IOmM磷酸缓冲液(以下，被称为封闭缓冲液)，得到抗FDP单克隆抗体的抗体固相。
将孔用清洗液清洗3次之后，向该抗体固相的各孔各加100 μ I上述制备的FbgDP 各抗原及FbnDP各抗原，于室温反应30分钟。反应结束后，将孔用清洗液清洗3次之后，向各孔各加1001过氧化物酶标记抗纤维蛋白原抗体(DAK0公司)，于室温反应I小时。反应结束后，将孔用清洗液清洗3次之后，向各孔各加100μ I ODP底物液(国际试剂株式会社)，于室温反应15分钟。接下来，向各孔各加100μ 12Ν硫酸，停止反应，测定在490nm的吸光度。
结果不于表I。
表I
权利要求
1.FDP测定用试剂，其含致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体，其选自 不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应的第I单克隆抗体、 不与X级分及D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分及Y级分反应的第2单克隆抗体、及 不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应，对于FDP的反应性与上述第I单克隆抗体不同的第3单克隆抗体。
2.权利要求1所述的FDP测定用试剂，其中上述载体是粒子。
3.权利要求1或权利要求2所述的FDP测定用试剂，其中上述载体粒子是个别地致敏各单克隆抗体的载体粒子的混合物。
4.权利要求1 3之任一项所述的抗FDP单克隆抗体，其中上述第I单克隆抗体是由以保藏号NITE BP-950在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月I日保藏的杂交瘤产生的抗体。
5.权利要求1 4之任一项所述的抗FDP单克隆抗体，其中上述第2单克隆抗体是由以保藏号NITE BP-951在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月I日保藏的杂交瘤产生的抗体。
6.权利要求1 5之任一项所述的抗FDP单克隆抗体，其中上述第3单克隆抗体是由以保藏号NITE BP-952在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心，于2010年6月I日保藏的杂交瘤产生的抗体。
7.FDP测定用试剂盒，其含 第I试剂，其含缓冲液；以及 第2试剂，其含致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液，其选自 不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应的第I单克隆抗体、 不与X级分及D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分及Y级分反应的第2单克隆抗体、及 不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应，对于FDP的反应性与上述第I单克隆抗体不同的第3单克隆抗体。
8.FDP测定方法，其包括 将致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液和活体样品混合的步骤，所述致敏对于FDP的反应性互相不同的至少2种单克隆抗体的载体粒子的悬浮液选自 不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应的第I单克隆抗体、 不与X级分及D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分及Y级分反应的第2单克隆抗体、及 不与D级分反应，但与XDP级分、DD/E级分、DD级分、X级分及Y级分反应，对于FDP的反应性与上述第I单克隆抗体不同的第3单克隆抗体，以及 测定由抗原抗体反应产生的，上述载体粒子的凝集的程度的步骤。
9.权利要求8所述的FDP测定方法，其中上述凝集的程度的测定是吸光度的变化的测定。
全文摘要
本发明涉及含致敏选自对于FDP的反应性互相不同的3种单克隆抗体的至少2种单克隆抗体的载体的FDP测定用试剂。另外，本发明涉及含该试剂的试剂盒、及利用该试剂或试剂盒的FDP测定方法。
文档编号C12P21/08GK103026231SQ20118003645
公开日2013年4月3日 申请日期2011年7月28日 优先权日2010年7月30日
发明者小林克史, 村上真澄, 杉本真由美 申请人:希森美康株式会社