专利名称：诱导型启动子的调控的制作方法
诱导型启动子的调控本发明涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的生产。具体地，本发明涉及通过使用特定底物(诱导物)可诱导的启动子而调节编码多肽的异源核酸序列的表达。最具体地，本发明涉及异源多肽在细菌宿主细胞中的表达的调控，其中已使得细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。
背景技术：
异源多肽在重组微生物中的产生的一个重要方面是选择用于控制编码靶多肽的异源核酸序列的表达的启动子。适当的启动子应当比较强。S卩，以高速率产生相应mRNA，从而允许以较高的量产生多肽。此外，启动子应当容易受到调控并且仅在诱导时开始异源多肽的产生。然而，存在通常诱导底物为微生物的营养物并且被微生物消耗的问题。然而，当用于培养微生物的培养基耗尽诱导底物时，微生物使启动子失活，从而靶多肽的表达停止。为了避免基因表达的不希望的停止，必须以较高的量添加和/或连续补充诱导物。较高量的诱导物的需要增加了发酵工艺的成本。此外，需要昂贵诱导物的高效启动子的使用也受到限制。因此，为了生产重组多肽，需要其中控制异源多肽表达的启动子的活性不依赖于诱导物的存在、但异源多肽的表达仍然可被严密调控的宿主细胞。WO 2006/133210 A2涉及在利用甘露醇、阿糖醇、葡糖醇或甘油-诱导型启动子的细菌宿主细胞中生产重组多肽的方法，其中已使得细菌宿主细胞不能降解或代谢诱导物。根据所述方法，对基因组中编码代谢所述诱导物所需的酶的一个或多个基因进行了遗传改变或缺失，以便细胞不能从其基因组表达代谢或降解所述诱导物所必需的功能性酶。为了确保诱导物的摄入，不影响与诱导物转运至细胞内相关的基因。然而，该方法需要另外添加用于催化控制靶多肽表达的相应启动子的激活的诱导物。此外，诱导物在细胞中的积累可不利地影响细胞的发育。许多细菌能够利用不同的碳源。如果提供以碳源的混合物，则选择允许最快速生长的碳源(主要碳源)。同时牵涉次级碳源的利用的功能被称为碳分解代谢物阻遏(CCR)的现象抑制。除了 CCR外，参与较不优选的次级碳源的利用的特定分解代谢基因仅在所述次级碳源存在的情况下表达。因此，参与次级碳源的分解代谢的基因的表达依赖于所述次级碳源的存在(诱导)以及主要碳源(分解代谢抑制)的不存在。Tianqui Sun 等人的出版物 “Characterization of a mannose utilizationsystem in bacillus subtilis “，Journal of Bacteriology, American Society forMicrobiology,第192卷，第8期，2010年4月I日，第2128页至2139页涉及甘露糖操纵子及其基因以及受甘露糖调节的启动子PmanP和PmanR的鉴定。据报导，甘露糖的代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统，并且甘露糖操纵子还受控于碳分解代谢物阻抑。 为了表征和鉴定单个基因的功能，制备缺乏相应基因、从而不存在由所述基因编码的相应蛋白质的敲除突变体。已发现甘露糖转运蛋白基因manP的缺失导致从启动子PmanP和PmanR的组成型表达，这表明甘露糖转运蛋白ManP对甘露糖操纵子和编码甘露糖特异性转录调节剂ManR的manR基因的调控具有负作用。Tobisch 等人“Regulation of the lie operon of Bacillus subtilis andcharacterization of potential phosphorylation sites of the LiR regulatorprotein by site-directed mutangenesis，，，Journal of Bacteriology,第 181 卷，第 16期，1999年8月19日，第4995-5003页报导了:调节剂LicR的EIIA结构域中的磷酰基结合氨基酸替换为另一个氨基酸导致了诱导底物不存在的情况下突变调节蛋白LicR的活性。G ke 等人 “ Carbon catabolite repression in bacteria:Many ways to makethe most out of nutrients”, Nature Reviews.Microbiology,第6卷，第 8 期，2008 年8月，第613-624页涉及缺乏甘露糖转运蛋白EIIAB的链球菌属突变菌株和对磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的影响。已显示甘露糖转运蛋白EIIAB并非仅限于甘露糖的磷酸化，而是同样地还磷酸化葡萄糖、果糖和2-脱氧葡萄糖。此外，已显示即使在甘露糖转运蛋白EIIAB不存在的情况下，甘露糖仍然可通过果糖特异性转运蛋白EIIfku摄入。Deutscher 等人“The mechanisms of carbon catabolite repression inbacteria，，(Current Opinion in Microbiology, Current Biology LTD, GB,第 11 卷，第2期，2008年4月I日，第87-93页)提供了不同细菌例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的碳分解代谢抑制机制的一般概述。发明概述本发明通过提供细菌宿主细胞而利用这些碳分解代谢的调控机制，其中所述细菌宿主细胞中，调控参与次级碳源代谢的基因表达的启动子在其相应的碳源不存在的情况下不被灭活，并且其中所述启动子仅处于碳分解代谢产物阻抑的控制之下。根据本发明，使用的`启动子为调控细菌宿主细胞的次级碳源的利用的启动子。在主要碳源存在的情况下，启动子被CCR抑制。当用于培养重组细菌宿主细胞的培养基耗尽主要碳源或主要碳源的浓度降至低于进行CCR所需的水平时，所述启动子的CCR无效并且启动子自动地起始由所述启动子控制的基因的表达。本发明提供了重组细菌宿主细胞，其中所述重组细菌宿主细胞能够利用一种以上的碳源，其中所述细菌宿主细胞的此类碳源的碳分解代谢受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)和CCR，其中对所述细菌宿主细胞进行了遗传改变，以防止在所述次级碳源不存在的情况下碳源诱导型启动子的转录调节蛋白的失活，但仍然在CCR的控制之下，其中所述碳源是细菌宿主细胞的次级碳源。根据本发明的又一方面，利用包含有效地连接了可被次级碳源诱导的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体转化本发明的重组细菌宿主细胞，其中载体的启动子受转录调节蛋白控制，所述细菌宿主细胞已在遗传上经历改变从而不能在特定相应碳源不存在的情况下灭活所述调节蛋白。此外，本发明提供了用于通过培养利用包含编码多肽的核酸序列的载体转化的本发明重组细菌宿主细胞来制备异源多肽的方法。此外，本发明涉及根据本发明的重组细菌宿主细胞用于产生异源多肽的用途。根据特定方面，本发明涉及需要减少量的诱导物、特别地根本不需要诱导物的基因表达诱导方案。根据进一步具体的方面，本发明涉及适合于高细胞密度发酵的细菌表达系统。具体地，本发明提供了用于在重组细菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，其中使用重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其在遗传上被改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，并且其包含具有有效地连接于启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，所述启动子可被次级碳源诱导并且受转录调节蛋白调控，所述方法包括如下步骤:在不包含诱导性次级碳源但包含不同碳源的细胞培养基中，当该不同碳源的浓度降至低于碳分解代谢物阻抑所必需的水平时，培养细菌宿主细胞由所述不同碳源诱导所述多肽表达，以及从细胞或从细胞培养物回收多肽。此外，本发明还提供了适合进行本发明的方法的重组细菌宿主细胞。例如，本发明涉及重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且已通过在所述细菌宿主细胞的基因组中缺失编码特异于该转录调节蛋白的磷酰基转移酶EII的基因而在遗传上对其进行了改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活可被次级碳源诱导的启动子所特异的转录调节蛋白，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白(对于所述转录调节蛋白，所述细菌宿主细胞在遗传上已被改变从而不能灭活其)调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，并且其中将编码该特异性转录调节蛋白的基因整合入所述载体。
此外，本发明涉及重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其已通过在该细菌宿主细胞的基因组中遗传上改变编码该转录调节蛋白的基因(以便由所述基因表达的转录调节蛋白不能结合通过特异于所述转录调节蛋白的酶EII转移的磷酰基)来在遗传上进行改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白(对于所述转录调节蛋白，所述细菌宿主细胞遗传上已被改变从而不能灭活其)调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，并且所述载体中额外地整合了编码不能结合由相应的酶EII转移的磷酰基的转录调节蛋白的加工基因。根据其它方面，本发明涉及用于通过培养重组细菌宿主细胞生产异源多肽的方法，其中使用其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统控制之下的重组细菌宿主细胞，并且所述重组细菌宿主细胞已被遗传改造，从而其不能代谢碳源诱导型启动子的诱导性碳源，其中所述诱导性碳源为该细菌宿主细胞的次级碳源，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有可被所述次级碳源诱导的启动子和有效地连接于该启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，其中所述方法是补料分批法，其中在分批期(batch phase)后，通过添加第一部分诱导性次级碳源、并且同时开始第二部分的进料来起始诱导。根据下列详细说明，参考附图和所附权利要求书，其它目的和有利方面对于本领域普通技术人员来说将变得显而易见。
根据上文提及的实施方案，靶多肽的表达的诱导不依赖于该启动子的诱导性碳源的存在。因此，该实施方案是特别有利的，因为不需要诱导性碳源。然而，如果可减少诱导启动子必需的碳源的量的话，那么从经济的观点来看其也是有利的。因此，根据可选择的技术方案，本发明涉及用于通过表达编码所述靶多肽的核酸来生产靶多肽的方法，其中表达处于碳源诱导型启动子的控制之下，其中细菌宿主细胞(该细菌宿主细胞应当用具有所述启动子和靶多肽的核苷酸序列的载体转化)对该诱导性碳源的分解代谢的过程被中断或至少被延迟。根据本发明，该替代方案可通过消除或在遗传上改变细菌宿主细胞的基因组中的编码诱导性碳源特异性异构酶的核苷酸序列来实现，所述诱导性碳源一旦被转运至细胞内即被所述异构酶转化成果糖-6-磷酸。当碳源已被转运进入细胞时，对果糖-6-磷酸的异构化是碳源的分解代谢的第一步。中断或延迟碳源的异构化意味着碳源可供长时期诱导。因此，可减少诱导性碳源的量。根据实例，该替代方案涉及甘露糖诱导型启动子以及具有这样的启动子的细菌宿主细胞，其中在该细菌宿主细胞的基因组中已消除或遗传上改变了编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为ManA)的基因，从而不可能发生或至少延迟了转运入细胞就发生的甘露糖异构化。附图概述在如下图中显示了:
图1:甘露糖操纵子的示意性结构，各基因和启动子的排列和方向以及ManR对其的激活由箭头标示；图2:甘露糖分解代谢`的流程图，涉及至细胞内的转运、在转运过程中甘露糖至甘露糖-6-磷酸的磷酸化以及向果糖-6-磷酸的转化；图3:具有不同结构域和潜在的磷酸化位点的ManR激活蛋白的示意性结构；图4:包含manR启动子的枯草芽孢杆菌启动子区域的核酸序列；图5:用于启动子-探针载体PSUN272.1 (用于研究甘露糖和葡萄糖对manP启动子的诱导性和分解代谢物阻抑以及ManR结合位点的测定)的枯草芽孢杆菌的核酸序列；图6:枯草芽孢杆菌中通过CcpA分解代谢物阻抑和激活的机制；图7:表达载体pSUN279.2的质粒图谱；图8:分别包含质粒pSUN279.2、pSUN284.1和pSUN291的枯草芽孢杆菌3NA的β-半乳糖苷酶活性；图9:包含质粒pSUN284.1以及含有图5中所示核酸序列的不同长度片段的其它质粒的枯草芽孢杆菌3ΝΑ的β -半乳糖苷酶活性；图10:包含具有图4中所示核酸序列的载体pSUN291、pSUN385.2和pSUN386.9的枯草芽孢杆菌3NA的β -半乳糖苷酶活性；图11:表达载体P丽168.1的质粒图谱；图12:插入载体pSUN356.7 (AmanP)的质粒图谱；图13:显示在枯草芽孢杆菌TQ356/pMW168.1 (AmanP-突变体)的整个发酵工艺期间中标绘的对数干生物质浓度和在整个工艺期间标绘的荧光信号(RFU)的图解；和
图14:从利用枯草芽孢杆菌TQ356/pMW168.1的发酵获取的细胞样品的SDS-PAGE ；
图15:质粒pMwl68.1的制备流程图。发明详述如本文中所用，提供下列定义以帮助理解本发明。“酶EII”、“EII”或“转运蛋白”是指磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统(PTS)的碳源特异性通透酶，其催化碳源的转运和伴随性磷酸化。PTS包含多种EII,每一种特异于一种碳源例如糖。EII是通常由3个结构域A、B和C以及有时有第4结构域D组成的复合体，其中EIIA和EIIB参与相应碳源的磷酸化，并且膜结合性EIIC (EIID，如果存在的话)介导该特异性碳源通入细胞。在特异性碳源不存在的情况下，相应的EIIA和在某些情况下EIIB通过将磷酰基转移至转录调节蛋白中存在的相应磷酸化位点(称为EIIA和EIIB结构域，取决于该磷酸化EII)来灭活相应碳源特异性转录调节蛋白。“转录调节蛋白”或“调节剂”正面调控(即，激活)特异性碳源的分解代谢操纵子。转录调节蛋白通常包含两个可被磷酸化的保守性调节结构域(PTS调节结构域，PRD)。此夕卜，一些转录调节蛋白另外地包含称为EIIA和EIIB的其它磷酸化位点。取决于转录调节蛋白，该转录调节蛋白通过酶II的磷酰基转移至EIIA和EIIB和/或PRDI结构域中的上述磷酰基结合位点中的一个或多个来灭活，以及通过将磷酰基从组氨酸蛋白(HPr)转移至PRDII结构域来激活。PTS的各种碳源特异性转录调节蛋白可以是激活物或抗终止因子(antiterminator)ο如本文中所用，“启动子”是指调控表达的核酸序列。“启动子区域”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并且起始下游(3'方向)编码序列的转录的调控区域。在启动子区域内有负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序列)例如-35盒和-10盒(Pribnow盒)。此外，启动子区域可包含转录起始位点和其特异性转录调节蛋白的结合位点。“变体”或“序列的变体”意指与参照序列相比的差异在于保守核酸置换的核酸序列，由此一个或多个核酸可被具有相同特征的另一个核酸替代。变体还包括简并序列、具有缺失和插入的序列，只要此类修饰序列显示与参照序列相同的功能(功能上等同)即可。“可在宿主中表达的载体”或“表达载体”是重组或合成地产生的多聚核酸构建体，其具有一系列指定的允许特定核酸序列在宿主细胞中转录的多聚核酸元件。通常，这样的载体包括包含有效地连接于启动子的待转录的特定核酸序列的转录单位。可在宿主中表达的载体可以是例如自主或自身复制的质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。术语“转化”、“转化的”或“向宿主细胞中引入核酸”意指其中细胞外核酸如载体(具有或不具有伴随材料)进入宿主细胞的任何过程。可利用公知的方法例如显微注射、电穿孔、微粒轰击或利用化学方法例如磷酸I丐介导的转化和利用天然转化系统(例如在Maniatise等人，Molecular Cloning Alaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)中或 Ausubel 等人，Currentprotocols in molecular biology, John Wiley 和 Sohns (1984)中描述的)实现例如表达载体对适当的宿主细胞的转化。
“异源核酸序列”或“对于宿主是异源的核酸序列”意指编码例如对于宿主是外来的“异源表达”或“异源产物”的表达产物例如多肽的核酸序列，即源于与宿主不同的供体的核酸序列或化学合成的核酸序列，其编码例如对于宿主是外来的表达产物例如多肽。如果宿主是特定的原核生物物种，则异源核酸序列优选源自生物的科的不同属，更优选源自不同目或纲，特别地源自不同门，最特别地来自不同域(界)。可在将其引入宿主细胞之前，通过对单个核酸或部分异源核酸序列的突变、插入、缺失或置换来修饰源于与宿主不同的供体的异源核酸序列，只要此类修饰序列显示与参照序列相同的功能(功能上等同的)即可。本文中提及的异源核酸序列还包括源自生物的不同域(界)例如源自真核生物(真核生物来源的)的核酸序列，例如人抗体，所述抗体已被用于噬菌体展示文库并且其中的单个核酸或核酸序列的部分已根据原核宿主的“密码子使用”进行了修饰。本发明的意义内的“异源多肽”或“靶多肽”可以是人、哺乳动物或原核生物来源的异源蛋白质。其它蛋白质为来自微生物病原体(病毒和抗细菌的)以及来自肿瘤的抗原例如糖蛋白和碳水化合物。其它异源多 肽为酶如凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、脱氢酶、核酸酶、葡聚糖酶、氧化酶、α -淀粉酶、氧化还原酶、脂酶、酰胺酶、腈水合酶、酯酶或腈水解酶。“碳源”是指可被细菌细胞摄入和代谢并且处于PTS和碳分解代谢物阻抑(CCR)之下的碳源，通常是碳水化合物，碳水化合物的典型实例为糖和糖衍生物。许多细菌可利用I种以上的碳水化合物作为碳源和能源。通过使用特定细胞外酶，细菌例如芽孢杆菌能够降解以大量存在于植物生物质中的几种多糖。所得的低聚糖、二糖或单糖被运输进入细胞并且进一步被加工。通常，当特定底物存在于培养基中并且优选碳源和能源不存在时，仅合成参与糖的代谢或降解的分解代谢酶。用于将碳水化合物转运通过细菌细胞的膜的优选碳水化合物转运途径是PTS。在PTS中，碳水化合物通过细胞膜的转运和随后的磷酸化由特异于所述碳水化合物的称为酶II (EU)的酶介导。由于EII介导其相应碳源至细胞内的转运，因此EII也被称为“转运蛋白”。在碳水化合物的混合物存在的情况下，细胞选择性摄入给它们提供最多能量和生长有利方面(主要碳源)的碳源。同时，它们抑制参与次优选碳源(次级碳源)的分解代谢和摄入的各种功能。通常地，用于大多数细菌的主要碳源为葡萄糖，并且取决于细菌，许多其它糖和糖衍生物被用作次级碳源。然而，主要碳源也可以是另一种化合物。例如在假单胞菌的情况下，主要碳源可以是芳香化合物。次级碳源包括例如甘露糖、乳糖和蜜二糖，但不限于此类糖在PTS中，参与特异性碳源的代谢的各种分解代谢基因受转录调节蛋白控制。此类转录调节蛋白可用作抗终止因子或转录激活物并且仅在特异性碳源(诱导物)存在时才具有活性。已发现EII通过将磷酰基转移至转录调节蛋白中存在的特异性结合位点而对其相应的转录调节蛋白具有负(灭活)调控作用。在主要碳源不存在并且启动子特异性诱导性碳源存在的情况下，启动子被其相应的转录调节蛋白激活，从而表达处于该启动子的控制之下的基因。在诱导性碳源不存在的情况下，调节该启动子的转录调节蛋白通过将磷酰基从其EII转移至该转录调节蛋白上的相应结合位点来灭活，从而灭活所述启动子并终止处于所述启动子控制之下的基因的表达。另外，在优选主要碳源存在的情况下-无论次优选的次级碳源是否存在-所述次级碳源的分解代谢基因的表达被CCR抑制。一般而言，本发明基于抑制所述特异性碳源不存在的情况下对碳源持异性转录调节蛋白的调控。具体地，本发明基于阻止通过相应的EII将磷酰基转移至转录调节蛋白产生的抑制或灭活。如果碳源持异性转录调节蛋白的抑制被阻止，所述转录调节蛋白作为其激活物的启动子具有活性，无论作为所述启动子的诱导物的碳源是否存在。因此，诱导性碳源对于处于此类启动子的控制之下的基因的表达不是必需的，此夕卜，此基因连续表达。鉴于上述内容，本发明利用可被次级碳源诱导的启动子，其中所述启动子一方面受PTS控制，另一方面受CCR控制。因此，本发明寻求通过阻止特异于碳源诱导型启动子的转录调节蛋白的灭活来阻止在靶多肽的表达中用作启动子的所述碳源诱导型启动子的灭活。根据第一方法，该目标可这样实现:通过使转录调节蛋白对于由EII转移的磷酰基的至少一个结合位点不能结合磷酰基来中断其特异性EII对转录调节蛋白的磷酸化。为此，在细菌宿主细胞的基因组中，可遗传操作编码转录调节蛋白的基因，以便所述基因表达不能结合从EII转移的磷酰基的转录调节蛋白。根据第二方法，通过`在细菌宿主细胞的基因组中缺失编码EII (即调节转录调节蛋白的活性的酶)的基因来中断磷酸化。根据本发明，将异源多肽的表达置于特异于上文中提及的转录调节蛋白的启动子的控制之下，可通过在遗传上改变细菌宿主细胞来阻止通过EII的磷酰基转移引起的灭活。本发明提供了用于通过利用载体(其包含有效地连接于碳源诱导型启动子的编码所述多肽的异源核酸)转化的本发明重组细菌宿主细胞的发酵来生产异源多肽的有利系统，其中即使在发酵培养基中不存在诱导性碳源时所述启动子仍然具有活性。由于控制编码靶多肽的核酸序列的表达的启动子仍然处于碳分解代谢物阻抑的控制之下，因此在主要碳源例如葡萄糖存在的情况下表达不发生，但当系统耗尽该主要碳源时自动地获得诱导(自动诱导)。由于控制异源多肽表达的启动子的活性不依赖于诱导性碳源的存在，因此在发酵培养基中，无需诱导性碳源即可实现靶多肽表达的诱导。本发明的一个有利之处在于，重组细菌宿主细胞可在其主要碳源存在的情况下生长至高细胞密度，并且一达到期望的细胞密度，就可在消除控制表达的启动子的碳分解代谢物阻抑下自动地开始靶多肽的产生。本发明的另一有利方面在于，在补料分批发酵中，在分批期中没有或几乎没有靶多肽产生，即存在强分解代谢物阻抑。适用于本发明的细菌宿主细胞是可利用I种以上的碳源的那些细菌宿主细胞，其中不同碳源的利用受控于碳分解代谢物阻抑并且其中碳源通过细胞膜的转运以及其磷酸化受控于磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统。
适用于本发明的细菌宿主细胞可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细胞。优选实例为属于厚壁菌门(phylum Firmicutes)的细菌，特别地，属于芽孢杆菌纲(classBacilli)的细菌。具体的实例为芽孢杆菌属的细菌例如枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌(B.amy1Iiquefaciens),地衣芽抱杆菌(B.licheniformis)、纳豆芽抱杆菌(B.natto)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)等，其它优选实例包括例如链球菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、埃希氏菌属或肠杆菌(Enterobacteria)的其它成员，但不限于此。通常，硬壁菌门是革兰氏阳性并且具有低GC含量。“低GC含量”意指在细菌基因组中低于52%的碱基对为GC对。例如，革兰氏阳性细菌例如芽孢杆菌属和梭菌属(Clostridium)的细菌在基因组中包含40%或更低的GC对。其它适当的细菌宿主细胞为肠细菌，例如属于肠杆菌目的细菌。此类肠细菌的实例是革兰氏阴性细菌(例如埃希氏菌属细菌)。具体的实例为大肠杆菌的菌株，例如TG1、W3110、DHUXLl-Blue 和 Origami。大肠杆菌和肠细菌在基因组中包含约50%的GC含量，因此是低GC含量生物。根据公知的革兰氏染色方法确定革兰氏阳性和革兰氏阴性生物。革兰氏阳性生物为在标准革兰氏染色下呈现紫罗兰色的生物。革兰氏阴性生物结合负染剂而非主要的革兰氏染色剂。在硬壁菌门和肠细菌中存在不同的CCR机制，所述机制已在作为模型生物的枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中得到详细研究(参考例如J.StUlke等人，“Regulationof carbon catabolism in Bacillus species，，，Annu.Rev.Microbiol.(2000)54:849-880 ； Qcirke B.et Stiilke J., “Carbon catabolite repression in bacteria:many ways to make the most out of nutrients，，，Nat.Rev.Microbiol.(2008)6:613-624 ；Gosset G.等人,Transcriptome analysis of Crp-dependent catabolitecontrol of gene expression in Escherichia coli, J.Bacterio1., (2004) 186:3516-3524，Martinez-Antonio A.等人,Identifying global regulators intranscriptional regulatory networks in bacteria，，Curr.0pin.Microbiol.(2003)6:482-489)。虽然CCR的总体机制不同，但结果相同，即在主要碳源存在的情况下，参与次级碳源的摄入和磷酸化的各种分解代谢操纵子被阻遏。本发明的重组细菌宿主细胞被遗传改造来阻止控制异源核酸序列的表达的碳源诱导型启动子的阻遏，这通过抑制在所述诱导性碳源不存在的情况下启动子特异性转录调节蛋白的灭活来实现。因此，在本发明的重组细菌宿主细胞中，控制异源核酸序列的表达的碳源诱导型启动子仅受控于碳分解代谢物阻抑。在主要碳源存在的情况下异源多肽的表达受CCR抑制。根据本发明，除非碳分解代谢物阻抑受到更优选的主要碳源刺激，否则无论诱导性碳源存在与否，碳源诱导型启动子都以其活性状态存在。因此，本发明提供了异源多肽的生产而无需诱导物来诱导控制编码多肽的基因的启动子。一般而言，适合于本发明的启动子是在细菌细胞中受控于PTS和CCR的启动子。具体地，相应的转录调节蛋白是处于所述启动子的控制之下的分解代谢操纵子的激活物或抗终止因子。此类启动子在本领域是已知的。适用于本发明的启动子的实例以参照各操纵子
的方式示于下表中:
权利要求
1.一种用于在重组细菌宿主细胞中生产异源多肽的方法， 其中使用重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且其在遗传上已被改变，从而不能在诱导性的次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白；并且其包含具有有效地连接于启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，所述启动子可被次级碳源诱导并且受转录调节蛋白调控， 所述方法包括包括如下步骤:在不包含所述诱导性次级碳源但包含不同碳源的细胞培养基中培养细菌宿主细胞，当该不同碳源的浓度降至低于碳分解代谢物阻抑所必需的水平时，由所述不同碳源诱导所述多肽表达， 以及从细胞或从细胞培养物回收所述多肽。
2.权利要求1或2的方法， 其中使用细菌宿主细胞，其中通过遗传改变，阻止了通过特异于所述转录调节蛋白的酶EII的磷酸化而对转录调节蛋白的灭活。
3.权利要求3的方法， 其中i)在所述细菌宿主细胞的基因组中，缺失编码特异于所述转录调节蛋白的磷酰基转移酶EII的基因，或 其中ii)在所述细菌宿主细胞的基因组中，对编码转录调节蛋白的基因进行遗传改变，从而由所述基因表达的转录调节蛋白不能结合从酶EII转移的磷酰基。
4.权利要求4的方法， 其中在情形i)中，将编码控制所述载体的启动子的转录调节蛋白的基因整合进入所述载体；或 其中在情形ii)中，将编码不能结合从相应酶EII转移的磷酰基的转录调节蛋白的细菌宿主细胞遗传上操作的基因整合进入所述载体。
5.权利要求1至5中任一项的方法， 其中所述细菌宿主细胞选自芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌(Chlostridia)和埃希氏菌属。
6.权利要求1和5中任一项的方法， 其中所述培养基包含酪蛋白氨基酸。
7.权利要求1至7中任一项的方法， 其中在无所述诱导物诱导的情况下开始所述多肽的表达。
8.权利要求1至8中任一项的方法， 其中在无碳分解代谢物阻抑的诱导的情况下，将所述至少一种碳源以足以维持细菌宿主细胞的预定生长速率的量添加至培养物。
9.权利要求1和8中任一项的方法， 其中所述碳源诱导性启动子为甘露糖操纵子的启动子并且其中所述诱导性碳源为甘露糖。
10.权利要求10的方法， 其中所述启动子为甘露糖操纵子的Pmanp或ρ_κ启动子。
11.权利要求11的方法， 其中i)在细菌宿主细胞的基因组中缺失所述编码manP的基因，或其中ii)在所述细菌宿主细胞的基因组中，遗传上改变编码所述转录调节蛋白ManR的基因，从而由所述基因表达的ManR不能结合从特定酶Ell转移的磷酰基。
12.一种用于通过培养重组细菌宿主细胞生产异源多肽的方法，其中使用其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统控制之下的重组细菌宿主细胞，并且所述重组细菌宿主细胞已被遗传改造，从而其不能代谢碳源诱导型启动子的诱导性碳源，其中所述诱导性碳源为细菌宿主细胞的次级碳源，并且所述重组细菌宿主细胞包含具有可被所述次级碳源诱导的启动子和有效地连接于该启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体， 其中所述方法是补料分批法，其中在分批期后，通过添加第一部分的诱导性次级碳源起始诱导，同时开始第二部分的补料。
13.权利要求13的方法， 其中在所述细菌宿主细胞的基因组中，缺失编码诱导物特异性6-磷酸异构酶的基因。
14.权利要求14的方法， 其中该基因为甘露糖操纵子的基因manA。
15.权利要求1至15的方法， 其中所述细菌宿主细胞选自芽孢杆菌属。
16.一种重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下，并且已通过缺失所述细菌宿主细胞的基因组中编码特异于转录调节蛋白的磷酰基转移酶EII的基因而在遗传上进行了改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白，并且所述重组细菌宿`主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，对于所述转录调节蛋白而言，所述细菌宿主细胞已被遗传上改变从而不能灭活，并且在所述载体中整合了编码该特异性转录调节蛋白的基因。
17.—种重组细菌宿主细胞，其碳源的分解代谢处于碳分解代谢物阻抑和磷酸烯醇丙酮酸:碳水化合物磷酸转移酶系统的控制之下， 并且其已通过遗传上改变细菌宿主细胞的基因组中编码转录调节蛋白的基因，从而由所述基因表达的转录调节蛋白不能结合通过特异于所述转录调节蛋白的酶EII转移的磷酰基，而在遗传上进行改变，从而其不能在诱导性次级碳源不存在的情况下灭活特异于可被该次级碳源诱导的启动子的转录调节蛋白， 并且所述重组细菌宿主细胞包含具有有效地连接于受转录调节蛋白调控的启动子的编码多肽的异源核酸序列的载体，对于所述转录调节蛋白，所述细菌宿主细胞在遗传上已被改变从而不能灭活，并且 其中在载体中额外地整合了编码不能结合由相应酶EII转移的磷酰基的转录调节蛋白的已操作基因。
全文摘要
本发明涉及异源多肽在重组细菌宿主细胞中的产生，其中使得所述细菌宿主细胞不能在诱导物不存在的情况下失活控制异源多肽表达的启动子。
文档编号C12N15/75GK103108954SQ201180036765
公开日2013年5月15日 申请日期2011年7月27日 优先权日2010年7月29日
发明者M·文泽尔, J·埃尔滕布克纳, C·基茨亚克 申请人:龙沙股份公司