用于使多种逆转录病毒毒株中的不对称靶位点重组的修整重组酶的制作方法

专利名称：用于使多种逆转录病毒毒株中的不对称靶位点重组的修整重组酶的制作方法
用于使多种逆转录病毒毒株中的不对称靶位点重组的修整重组酶
本发明涉及用于制备编码修整重组酶(tailored recombinase)的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使可插入宿主细胞基因组中的多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)内的不对称靶序列重组，以及涉及所获得的表达载体、用所述表达载体转染的细胞、表达的重组酶和包含所述表达载体、细胞和/或重组酶的药物组合物。药物组合物可用于例如治疗和/或预防逆转录病毒感染。特别地，公开了存在于多种HIV-1毒株中的不对称靶序列，以及能够使这些序列重组的修整重组酶(Tre 3.0和4.0)和编码所述修整重组酶的表达载体。技术背景
逆转录病毒感染例如被人免疫缺陷病毒(HIV)感染仍是最重要和最普遍的人类疾病之一。
治疗逆转录病毒(例如HIV)的一种方法是靶向插入宿主细胞基因组中的原病毒。将原病毒DNA从宿主基因组上切除可防止例如HIV进一步复制，而且不同于现有方法，因为它具有根除甚至是存在于宿主基因组中的潜伏病毒的潜力。
考虑用于这种备选方法的一类蛋白质是位点特异性重组酶(Flowers等，1997)。位点特异性重组酶事实上介导从基因重排到基因组分离的许多功能，例如限定DNA单位的切除、倒位或整合(有 关综述参见Stark等，1992)。
最简单和最被了解的重组酶之一是来自噬菌体Pl的Cre重组酶，其通过特定序列的两个相同的双链DNA位点之间的重组使基因组二聚体解离成单体(Hoess和Abremski,1985)。Cre重组酶已广泛用于小鼠遗传学(NAGY，2000)。Cre是以其功能命名的38 kDa蛋白质，因为它引起重组(pauses recombination) (Sternberg 和 Hamilton, 1981)。这种重组的先决条件是在反向平行方向上由Cre识别的两个重组位点的排列，所述重组位点随后被连接构成环的4个相同的Cre亚基结合，其中每个亚基接触2个邻近亚基和一个重组位点的一半位点(Hoess和Abremski, 1985)。被Cre识别的重组位点是称为(出自locus of crossing over (x) ,Pl (交换(x)的基因座 ￡1) ;Sternberg 和 Hamilton, 1981)的34-bp双链DNA序列，除了其8个最里面的碱基对(称为间隔区)外，它是回文的，所述8个最里面的碱基对赋予位点方向性。
一些位点特异性重组系统包括Cre/loxP系统，无需辅助蛋白质或辅因子而发挥作用，并且在广泛多样的细胞条件下发挥作用。然而，因为位点特异性重组酶通过重组酶亚基与其关联DNA靶序列的特定相互作用而发挥作用，所以这些酶的使用受以下必要条件的限制:被靶向的DNA区域必须含有适当定位的靶位点(LEWAND0SKI，2001)。迄今为止，尚未鉴定识别天然逆转录病毒序列作为其DNA靶序列的野生型重组酶。
近年来已进行了大量的位点特异性重组酶的突变和结构分析，以改变其性质，并实现对这些酶的复杂机制的更好理解(有关综述参见van Duyne, 2001 ;以及Coates等，2005)。许多研究集中于Cre重组酶以探究其可进化性(evolvability)。几项研究证实，当Cre在其7ozP识别位点中的少数核苷酸改变时，Cre靶向特异性可被改变(BUCHHOLZ和STEWART, 2001 ；SANTORO 和 SCHULTZ，2002 ；RUFER 和 SAUER，2002)。进一步的研究致力于工程改造含有来自HIV-1 LTR的序列的突变靶位点，以开发可能的靶位点用于使用Cre作为抗病毒策略(Lee和Park，1998 ；Lee等，2000)。
定向进化的方法是选择其特异性发生改变的酶的有力方法(有关综述参见Yuan等，2005 ；以及Johannes和Zhao，2006)。最初，在RNA的基础上，通过选择其底物位点发生改变的RNA分子，而采用这种方法来分离改进的酶。基于PCR的方法的使用允许筛选非常大的文库，和从候选物库中回收成功的编码区。相比之下，在蛋白质的定向进化中，通过蛋白质性质的改变鉴定的改进的突变体的筛选和回收，需要用于寻找编码该蛋白质的核酸序列的方法。通常通过区室化维持蛋白质及其编码序列之间的关联。因此，定向蛋白质进化中的文库筛选限于维持区室的“逐一(one-by-one) ”方法，而且尚无与筛选候选物库有关的优势。
通过开发使用mRNA-蛋白质融合物和核糖体展示，允许蛋白质与其对应的信使RNA (mRNA)交联的方法，克服了这种局限性。因此将改进的蛋白质性质的功能筛选与相应编码分子的直接寻找相联系，并且大的库已在体外进行了筛选(参见例如Buchholz等，1998)。定向蛋白质进化的进一步改进通过所谓的底物关联的蛋白质进化(substrate-1 inked protein evolution, SLiPE ;Buchholz 和 Stewart, 2001)而实现，其中将重组酶的底物置于与蛋白质编码区相同的DNA分子上。以这种方式，当重组酶在区室内表达时，它的作用改变与其自身编码区邻接的DNA底物。因此，可通过只扩增邻接经改变的底物的候选编码区的PCR将文库筛选为库。这允许合宜地筛选大的文库，用于快速寻找成功的编码区。应用这种方法以改变Cre重组酶的DNA特异性，并且使其适应新的识别靶位点(Buchholz 和 Stewart,2001)。
鉴于位点特异性重组酶的潜力和找出从宿主细胞基因组中根除Hiv-1原病毒的AIDS疗法的需要，WO 2008/083931公开了修整重组酶(TRE)的产生，所述修整重组酶能够使插入宿主细胞基因组中的逆转录病毒的原病毒DNA的LTR内的不对称靶位点重组，因此从宿主细胞基因组中切除原病毒。公开于其实施例`中的工程改造的重组酶Tre，识别存在于特定HIV-1毒株中的特异性1xP样位点。WO 2008/083931认为，对于带有不同HIV毒株的患者的治疗，由于逆转录病毒特别是HIV的高序列变异性，可能不得不改变不同的修整重组酶，或制备含有对各种靶序列有特异性的修整重组酶的一批重组酶。
鉴于此，本发明人目前克服了提供能够切除多种逆转录病毒(例如HIV)毒株的修整重组酶的问题。因此，在不需要产生针对每种毒株的新的重组酶的情况下，可将所产生的重组酶应用于多种HIV感染。本发明解决了这个问题。
发明描述 本发明人首次提供用于产生编码修整重组酶的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使插入宿主细胞基因组中的一种病毒种的多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组。通过将底物分解成与原始靶标具有较小差别的许多新的亚组，并逐步修整重组酶以识别这些亚组，而对重组酶进行修整以识别不同于其天然对称靶位点的不对称靶位点(W0 2008/083931)。组合方法允许选择识别给定序列内的不对称靶位点的功能分子。因此，采用在定向分子进化期间穿过底物中间体的方法，可能产生具有远缘的新的不对称靶特异性的酶。本发明利用针对提供能够使多种逆转录病毒毒株、优选来自一种病毒种的毒株重组的修整重组酶的问题的这种方法。他们发现尽管逆转录病毒的高序列变异性，但可能鉴定存在于高比例的特定亚型病毒中的不对称靶序列。
本发明提供用于制备编码修整重组酶的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使可插入宿主细胞基因组中的多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述方法包括以下步骤:在多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR的序列中鉴定与至少一个已知重组酶靶位点的左半位点序列和右半位点序列有至少30%同源性的序列，其中同源序列被5-12个核苷酸的间隔区分隔开，且其中不对称靶序列存在于多种逆转录病毒毒株中；以及通过以下重复步骤产生直到获得对逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性的至少一种重组酶: i)使用修饰的靶序列作为底物对识别已知同源靶位点的至少一种重组酶进行分子定向进化，所述修饰的靶序列基于不对称靶序列的序列，但经修饰以仅含有区别于所述已知靶序列的有限数目的变异；其中，在每一轮中，靶序列在其1、2或3个核苷酸上可不同于已知重组酶对之起作用的靶序列；和 ii)改组重组酶文库，以得到能够使与不对称靶序列更同源的靶序列重组的重组酶文库； 分离所得到的至少一种重组酶的核酸；以及将编码该重组酶的核酸克隆至合适的表达载体中。
公开于WO 2008/083931的产生修整重组酶的方法可用来产生能够使不对称靶序列重组的修整重组酶。
本发明还提供用于制备编码修整重组酶的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使可插入宿主细胞基因组中的多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述方法包括以下步骤: (a)在多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR的序列中鉴定与至少一个已知重组酶靶位点的左半位点序列和右半位点序列有至少30%同源性的序列，其中同源序列被5-12个核苷酸的间隔区分隔开，且其中不对称靶序列存在于多种逆转录病毒毒株中； (b)鉴定两种序列，其中第一序列相当于与所述已知靶位点的左半位点同源的步骤(a)的不对称靶序列的序列，并称为“半位点序列1”，且其中第二序列相当于与右半位点同源的步骤(a)的不对称靶序列的序列，并称为“半位点序列2”； (C)测定步骤(b)的序列内偏离步骤(a)的已知同源靶位点的相应同源左半位点和右半位点序列的核苷酸； (d)产生包含靶序列的两种靶核酸的第一亚组，其中第一靶序列称为亚位点(subsite) 1，包含彼此邻接且按5’至3’顺序的步骤(b)的半位点序列1、不对称靶序列的间隔区序列和半位点序列I的反向重复序列，且其中第二靶序列称为亚位点2，包含彼此邻接且按5’至3’顺序的半位点序列2的反向重复序列、不对称靶序列的间隔区序列和步骤(b)的半位点序列2； (e)在步骤(d)的第一亚组中的靶序列的基础上，产生包含修饰靶序列的靶核酸的第二亚组， 其中，在基于亚位点I的序列中，在左半位点序列中，偏离步骤(a)的至少一个已知靶位点的相应同源半位点序列的核苷酸的一部分被存在于所述已知靶位点上的天然核苷酸置换，直到所述半位点序列含有1、2或3个偏离所述已知靶位点的核苷酸，其中所述修饰靶序列的右半位点通过所述修饰左半位点序列的反向重复而形成，其通过不对称靶序列的间隔区序列而与所述修饰左半位点序列分隔开，和 其中，在基于亚位点2的序列中，在右半位点序列中，偏离步骤(a)的至少一个已知靶位点的相应同源半位点序列的核苷酸的一部分被存在于所述已知靶位点上的天然核苷酸置换，直到所述半位点序列含有1、2或3个偏离所述已知靶位点的核苷酸，其中所述修饰靶序列的左半位点通过所述修饰右半位点序列的反向重复而形成，其通过不对称靶序列的间隔区序列与所述修饰右半位点序列分隔开， 使得合起来看，在来源于步骤(d)的第一亚组的一种靶序列的所有修饰半位点序列中，可找出所有偏离的核苷酸，但是所述修饰半位点序列无一单独包含所有的偏离核苷酸， (f)使用步骤(e)中获得的第二亚组的每种核酸作为底物，分别将分子定向进化应用于识别步骤(a)的已知同源靶位点的至少一种重组酶； (g)改组步骤(f)中进化的重组酶文库，其中将在基于亚位点I的序列上进化的所有重组酶文库组合并改组，且其中将在基于亚位点2的序列上进化的所有重组酶文库组合并改组； (h)使用步骤(d)的亚组的每种核酸作为底物，将分子定向进化应用于步骤(g)中所获得的改组文库； (i)改组在步骤(h)中进化的重组酶文库； U)使用包含步骤(a)的不对称靶序列的核酸作为底物，将分子定向进化应用于步骤(g)中所获得的改组文库，直到获得对步骤(a)的逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性的至少一种重组酶； (k)从文库中分离在步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和 (I)将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体中。
在本发明方法的步骤(a)中，可通过例如使用链终止抑制剂(chain-terminatinginhibitor)的DNA测序,来测定原 病毒DNA的LTR序列(Sanger等，1977)。然而,如果已测定插入宿主基因组中的逆转录病毒DNA的LTR序列，则可参照数据库来确定该序列。以序列信息为基础，进行序列信息的基于计算机的分析，以鉴定其中分别与已知重组酶的已知靶位点的左半位点和右半位点序列有至少30%同源性的序列，所述序列被合适的5-12个核苷酸的间隔区分隔开，其中不对称靶序列存在于多种逆转录病毒毒株中。优选与已知靶位点的左半位点和右半位点序列的同源性为至少40%或至少50%。优选这些逆转录病毒毒株是一种病毒种或其一种亚型的毒株。优选多种毒株包含超过10种毒株、更优选超过100种毒株、超过130种毒株、超过200种毒株或超过300种毒株，例如HIV毒株。毒株可来自病毒的一种亚型，例如HIV-UHIV-1 A和B亚型或HIV-1 B亚型。因此，所获得的重组酶或编码所述重组酶的表达载体可用于治疗多种毒株感染，例如逆转录病毒或其亚型的超过50%、超过70%、超过80%、超过90%或所有已知毒株。
本文所用术语“重组酶”是指涉及重组的蛋白质。就此而言，重组酶识别和结合称为“重组位点”或“靶位点”的两个特定DNA序列，并且介导这两个靶位点间的重组。因此，术语“重组酶”欲指介导在特定DNA基因座中DNA重排的任何重组系统的任何蛋白质组分。天然存在的重组酶识别由两个相同序列组成的对称靶位点，所述相同序列称为“半位点”，具有约9-20 bp，构成反向重复，其中半位点序列被5-12 bp的间隔区序列分隔开来。来自酪氨酸整合酶家族的重组酶的特征在于具有酪氨酸作为用于DNA切割的活性位点亲核体，而来自丝氨酸整合酶家族的重组酶利用丝氨酸而不是酪氨酸。
在本发明的一个实施方案中，其靶序列用于步骤(a)和在步骤(h)和(j)中对其应用分子定向进化的至少一种已知重组酶属于丝氨酸整合酶家族。属于丝氨酸整合酶家族的优选重组酶选自phiC31整合酶(Combes等，2002)、Gin或Hin重组系统的任何组分、Tn3解离酶(Krasnow和Cozzarelli, 1983)或大的丝氨酸重组酶的任何其它成员、VDJ重组系统的Ragl、Rag2或任何其它组分或其变体。
在另一个实施方案中，所述重组酶属于酪氨酸整合酶家族。属于酪氨酸整合酶家族的优选重组酶选自来自噬菌体Pl的Cre (Abremski等，1983，1984)、来自酵母的FLP重组酶(Volkert 和 Broach, 1986)、来自卩遼菌体 D6 的 Dre (Sauer & McDermott, 2004)、来自鲁氏接合糖酵母iZygosaccharomyces rouxii)质粒pSRl的R重组酶、来自果蝇克鲁维氏酵母 iJUuveromyces drosophi lari uni)质粒 pKDl 的 A 重组酶、来自 ZZwFero焊ces waltii质粒pKWl的重组酶、来自芽孢杆菌属(Bacillus)转座子Tn4430的ΤηρΙ、λ Int重组系统的任何组分或其变体。优选所述重组酶为Cre重组酶或其变体。例如可以使用公开于WO2008/083931的修整重组酶(Tre)。
在这种情况下，术语变体是指这样的蛋白质，其通过氨基酸的缺失、取代和/或添加而衍生自上述蛋白质，并且保持它们自其中衍生的蛋白质的一些或全部固有功能。
在一个优选的实施方案中，已知重组酶是通过例如Crameri等(1998)描述的“家族改组”而获得的嵌合重组酶。使用家族改组的先决条件是用于产生嵌合重组酶的重组酶之间的显著同源性。可用于本发明的嵌合重组酶的一个实例是分别由重组酶Cre的序列和重组酶Dre的序列组成的嵌合重组酶。
在一个更优选的实施方案中，重组酶是识别称为7ozP (SEQ ID NO: 3)的34 bp的对称靶位点的Cre重组酶。位点(及野生型重组酶的其它重组位点)是具有被8个最里面的喊基对分隔开的2个13 bp重复序列的回文序列，所述8个最里面的喊基对代表赋予该位点方向性的所谓的间隔区。 重组通过间隔区序列内切割而发生。根据2个参与1xP位点的相对位置和取向，Cre催化DNA整合、切除或重排(Hoess和Abremski，1985)。
一种有用的重组酶是自肠道沙门氏菌erica)分离的Zre (SEQID NO:26)或其例如与野生型序列有至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%同源性且具有重组酶功能的变体、片段和同源物。Zre重组酶使DNA在Z0x位点上重组(

图1)。它们可用于单独或在文库的情况下开始本发明的方法。
在一个实施方案中，重组酶文库用作分子进化的起始点，例如包含不同的野生型和/或改动/改组的重组酶的重组酶文库,例如如下文或实施例2中描述的。这类文库优选用作用于产生能够识别SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的修整重组酶的起始点。
修整重组酶能够使多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组。被重组酶靶定的原病毒DNA可插入宿主细胞的基因组中。或者，本发明的修整重组酶可使多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述不对称靶序列(尚)未整合到宿主细胞基因组中，即其作为未整合的整合前复合体(pre-1ntegrationcomplex, PIC)存在。因此尚未整合到宿主细胞基因组中的HIV以及已经整合的HIV可通过本发明的修整重组酶钝化。
在本发明中以及在本领域中要注意的是，术语“靶序列”、“靶位点”和“重组位点”可互换使用。
与识别对称靶位点的天然存在的重组酶相反，本发明的方法提供识别靶位点的修整重组酶，其并非由被间隔区分隔开的回文序列组成。相反，在不对称靶位点中，该序列不构成对称的反向重复序列。因此，能够识别不对称靶位点的修整重组酶应识别并且使由变化序列的半位点组成的靶位点重组。
在不对称靶位点内，分别称为“左半位点”和“右半位点”的序列，通过其与已知靶位点的左半位点和右半位点的同源性界定。位于与已知祀位点的左半位点和右半位点同源的序列间的序列称为间隔区 。
然而，如果序列存在于只与已知靶位点的左半位点或右半位点序列具有同源性的LTR中，则这些序列仍可用于实施本发明。属于重组酶的靶位点的大小为技术人员所知，所述重组酶的天然靶序列与LTR内的序列具有同源性。例如，如果与被Cre重组酶识别的靶序列的同源性存在于LTR序列内，则被Cre重组酶识别的不对称靶位点可由34个核苷酸组成，其具有两个13个核苷酸的半位点序列，各被8个核苷酸的间隔区分隔开。因此，LTR内的同源序列定义为不对称靶位点的左半位点或右半位点或间隔区，这取决于与已知靶位点的序列的同源性。因此，与已知靶序列的左半位点具有同源性的序列定义为左半位点，与已知靶序列的右半位点具有同源性的序列定义为右半位点。从这个定义开始，在考虑已知靶位点的结构的情况下，定义不对称靶位点的其它部分。因此，如果就与位点(被Cre重组酶识别)的同源性，在定义了例如LTR内右半位点序列后，则可容易地定义相当于不对称靶序列的间隔区和左半位点的其它序列。例如间隔区序列通过计数定义为右半位点序列的序列5’端上游的8个核苷酸来定义，而左半位点序列通过计数先前定义的间隔区序列5’端上游的13个核苷酸来类似地定义。
同源性在这种情况下以及在整个申请中意指序列同一性。用于同源性目的的优选比较是采用本领域已知的标准技术对至少2个序列进行比较，包括但不限于Smith和Waterman (1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch (1970)的同源性比对算法或Pearson和Lipman (1988)的搜索相似性方法。对于本申请的目的，序列同源性优选采用可获自欧洲生物信息学会(European Bioinformatics Institute (EBI))的 ClustalW 计算机程序测定，除非另有说明。
鉴于原病毒基因组必须存在2个相同靶位点以允许重组酶切除这两个靶位点之间的序列的必要条件，在本发明方法的步骤(a)中扫描在基因组中至少出现2次的原病毒DNA序列。这类序列是例如原病毒DNA的LTR序列。因此优选扫描LTR序列，因为原病毒DNA的5’ -LTR和3’ -LTR是相同的。5’ -LTR中存在的不对称靶位点也存在于3’ -LTR中，且因此允许切除位于LTR之间的原病毒DNA。
在LTR序列内鉴定的与已知靶位点具有足够同源性的序列中，优选选择与已知重组酶的靶位点的序列具有最高同源性的序列。然而，也可能选择具有最高同源性的序列以外的序列，例如在最大数目的逆转录病毒毒株中，或在目标逆转录病毒毒株中存在的序列，例如，如果患者被特定毒株感染。
要注意的是，本发明方法的潜力甚至允许修整识别与已知靶位点的同源性小于30%、例如至少11%或至少20%同源性的不对称靶位点的重组酶。然而，为了确保各个不对称靶位点的残余重组活性的存在，优选扫描与已知重组酶的已知靶位点的左半位点和右半位点序列具有至少30%同源性的序列。在其它优选的实施方案中，选择与已知重组酶的已知靶位点的左半位点和右半位点序列具有至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80% 同源性、更优选 85%、特别优选 90% 和最优选95%同源性的不对称靶序列。
在本发明的一个实施方案中，在LTR内选择的序列与被位点特异性重组酶Cre识别的对称靶位点具有同源性。
在一个实施方案中，重组酶文库用作分子进化的起始点，例如，包含不同的野生型和/或改动/改组重组酶的重组酶文库,例如实施例2中描述的文库。示例性文库包含Cre和由其衍生的重组酶。它还可包含Tre、Dre、来自沙门氏菌属(Salmonella)和希瓦氏菌属(Shewanella)的重组酶和/或由其衍生的重组酶。文库可包含例如Cre、Dre、Dre “Cre_ed”(SEQ ID NO: 24)、希瓦氏菌属重组酶(Shew) ,Shew “Cre-ed” (SEQ ID NO:25)和 / 或 Zre(SEQ ID N0:26)。图3A中描述了一种文库。Tre是WO 2008/083931所公开的修整重组酶，其亦称为Tre 1.0。
在一个实施方案中，文库中所有的重组酶都识别具有相同间隔区长度的靶序列。包括间隔区在内的半位点序列I和2的总长度优选为34个核苷酸。
如果至少一种重组酶是重组酶文库，则同源性是与已知重组酶靶位点库的同源性(即在给定位置上与至少一种靶序列的同源性定义为同源性)。因此，在步骤(C)中，仅与至少一种已知靶序列上的核苷酸不一致的那些核苷酸定义为偏离核苷酸。就重组酶文库而言，步骤(e)中的“天然核苷酸”可以是在任何已知靶序列的该位置上存在的核苷酸，优选为在几个或大多数已知靶序列上的该位置上存在的核苷酸。
为了鉴定在多种逆转录病毒毒株中存在的靶序列，文献中已有描述的重组酶的已知识别位点，可用作针对基 因组序列段对保守不对称靶序列进行搜索的查询位点(query)。考虑到区域的重复性质，标准序列相似性搜索工具的使用无论如何都行不通。Sarkar等人(2007)采用BLAST (ALTSCHUL等，1997)跨HIV毒株以寻找1x样结合位点。当跨HIV-1LTR序列进行时，BLAST搜索1x样位点导致发现了存在于单个毒株的唯一一个位点。然而，如果重组酶用作针对逆转录病毒基因组的治疗剂，则关键的是对重组酶进行改造以靶向跨越尽可能多的逆转录病毒毒株而存在的识别位点。
由于对于这类短的丰余序列无法良好地执行BLAST，因此考虑应用HMMER (EDDY等，1998)、RepeatMasker或Emboss软件套装的回文程序。HMMER被开发来根据待查找的序列模式的概率模型查寻远缘同源物，这并非意欲执行的搜索的性质。HMMER可被强制执行以解决这种搜索问题，但是数据和参数的处理前和处理后的量可使之极易出错和低效。R印eatMasker只搜索已充分表征的重复序列和低复杂性区，这同样并非这种搜索的性质。Emboss回文程序与解决搜索问题最接近，但不允许搜索被限定，相反地导致一系列1x样位点的可能性。因此这些应须与目标1x-位点签名(signature)匹配。显然，该策略只能使搜索复杂化和繁重。为了解决寻找1x样位点的程序和方法的缺乏，不得不开发能够搜索基因组序列中的简并1x样位点的程序。
可应用以基于重组酶的已知识别位点的侧翼区的位置权矩阵为基础的算法，根据该程序来鉴定存在于多种逆转录病毒毒株中的不对称靶序列。优选为了使搜索是计算有效的，在把序列转化成位串后，对其采用二进制运算。
在一个优选的本发明的实施方案中，逆转录病毒是HIV，特别是HIV-1。对于HIV-1，测定了合适的不对称靶序列，其具有以下SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示的序列。
左半位点和右半位点序列加下划线，间隔区用黑体字印制:
权利要求
1.用于制备编码修整重组酶的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，所述方法包括以下步骤: (a)鉴定与多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR序列中的至少一个已知重组酶靶位点的左半位点序列和右半位点序列具有至少30%同源性的序列，其中同源序列被5-12个核苷酸的间隔区分隔开，且其中不对称靶序列存在于多种逆转录病毒毒株中； (b)鉴定两种序列，其中第一序列对应于与所述已知靶位点的左半位点同源的步骤(a)的不对称靶序列的序列，称为“半位点序列1”，其中第二序列对应于与右半位点同源的步骤(a)的不对称靶序列的序列，称为“半位点序列2”； (C)确定偏离步骤(a)的至少一个已知同源靶位点的相应的同源左半位点和右半位点序列的步骤(b)序列内的核苷酸； (d)产生包含靶序列的两种靶核酸的第一亚组，其中第一靶序列称为亚位点1，包含彼此邻接且按5’至3’顺序的步骤(b)的半位点序列1、不对称靶序列的间隔区序列和半位点序列I的反向重复序列，且其中第二靶序列称为亚位点2，包含彼此邻接且按5’至3’顺序的半位点序列2的反向重复序列、不对称靶序列的间隔区序列和步骤(b)的半位点序列2 ； (e)在步骤(d)的第一亚组中的靶序列的基础上，产生包含修饰靶序列的靶核酸的第二亚组， 其中，在基于亚位点I的序列中，在左半位点序列中，偏离步骤(a)的至少一个已知靶位点的相应的同源半位点序列的核苷酸的一部分被存在于所述已知靶位点中的天然核苷酸置换，直到所述半位点序列含有1、2或3个偏离所述已知靶位点的核苷酸，其中所述修饰靶序列的右半位点通过所述修饰左半位点序列的反向重复而形成，其通过不对称靶序列的间隔区序列而与所述修饰左半位点序列分隔开，和 其中，在基于亚位点2的序列中，在右半位点序列中，偏离步骤(a)的至少一个已知靶位点的相应的同源半位点序列的核苷酸的一部分被存在于所述已知靶位点中的天然核苷酸置换，直到所述半位点序列含有1、2或3个偏离所述已知靶位点的核苷酸，其中所述修饰靶序列的左半位点通过所述修饰右半位点序列的反向重复而形成，其通过不对称靶序列的间隔区序列而与所述修饰右半位点序列分隔开， 使得合起来看，在来源于步骤(d)的第一亚组的一种靶序列的所有修饰半位点序列中，可找出所有的偏离核苷酸，但是所述修饰半位点序列无一单独包含所有的偏离核苷酸， (f)使用步骤(e)中获得 的第二亚组的每种核酸作为底物，分别将分子定向进化应用于识别步骤(a)的已知同源靶位点的至少一种重组酶； (g)改组步骤(f)中进化的重组酶文库，其中将在基于亚位点I的序列上进化的所有重组酶文库组合并改组，且其中将在基于亚位点2的序列上进化的所有重组酶文库组合并改组； (h)使用步骤(d)的亚组的每种核酸作为底物，将分子定向进化应用于步骤(g)中所获得的改组文库； (i)改组在步骤(h)中进化的重组酶文库； U)使用包含步骤(a)的不对称靶序列的核酸作为底物，将分子定向进化应用于步骤(g)中所获得的改组文库，直到获得对步骤(a)的逆转录病毒DNA的LTR内的不对称靶序列有活性的至少一种重组酶；(k)从文库中分离编码在步骤(j)中获得的至少一种重组酶的核酸；和 (I)将步骤(k)中获得的核酸克隆到合适的表达载体中。
2.权利要求1的方法，其中所述逆转录病毒是HIV，优选HIV-1。
3.权利要求2的方法，其中所述逆转录病毒是HIV-1，所述不对称靶序列具有SEQIDNO:1或SEQ ID NO: 2所示序列。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中其靶序列用于步骤(a)且在步骤(f)中对其进行分子定向进化的至少一种已知重组酶是重组酶文库的一部分。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所采用的分子定向进化是底物关联的蛋白质进化。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤(I)中的表达载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、泡沫病毒载体和腺病毒载体。
7.用于制备修整重组酶的方法，其中所述方法包括权利要求1-6中任一项的方法和在合适的宿主细胞中自插入到表达载体中的编码重组酶的核酸表达修整重组酶的另外步骤，其中所述重组酶任选作为包含修整重组酶的氨基酸序列的融合多肽表达。
8.用于制备转化细胞的方法，其中所述方法包括权利要求中1-6任一项的方法和体外将表达载体导入细胞的另外步骤，其中所述细胞优选为成体干细胞。
9.权利要求1-8中任一项的方法，所述方法还包括制备作为药物组合物的表达载体、重组酶或细胞的步骤。
10.编码修整重组酶的核酸，所述修整重组酶能够使多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的LTR内的不对称靶序列重组，其中所述修整重组酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:38的序列具有至少97%序列同一性，其中所述核酸任选为表达载体。
11.可获自权利要求1-6中任一项的方法的步骤(k)的核酸或可获自权利要求1-6中任一项的方法的表达载体,其中所述修整重组酶的氨基酸序列任选与SEQ ID NO: 38的序列具有至少97%序列同一性和/或其中由所述核酸编码的修整重组酶任选包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
12.权利要求10或11的任一项的核酸，其中所述修整重组酶包含SEQID NO: 37的氨基酸序列，其中所述修整重组酶包含与Cre序列(SEQ ID NO:36)相比至少一个、优选2、3、4、5、6或7个选自以下的限定的氨基酸交换:P12S、P15L、M44V、K86N、G93A、A175S和P307A。
13.权利要求10-1 2中任一项的核酸，其中所述修整重组酶的氨基酸序列包含SEQIDNO: 38的序列，其中所述修整重组酶的氨基酸序列任选包含SEQ ID NO: 39的序列，和/或其中所述修整重组酶的氨基酸序列任选选自SEQ ID NO:40-64和选自SEQ ID N0:40_64的序列的组合。
14.由权利要求10-13中任一项的核酸编码的修整重组酶，其任选作为融合蛋白表达。
15.包含权利要求10-13中任一项的核酸的转化细胞，其中所述细胞优选是来自造血谱系的干细胞。
16.包含权利要求10-13中任一项的核酸、权利要求14的修整重组酶和/或权利要求15的转化细胞的药物组合物。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗或预防受试者的逆转录病毒感染，其中所述逆转录病毒优选为HIV，特别是HIV-1，其中如果获自受试者的样品中存在的原病 毒DNA包含选择重组酶所针对的步骤(a)中鉴定的不对称靶序列，则任选配制所述药物组合物用于给予受试者。
全文摘要
本发明涉及用于制备编码修整重组酶的表达载体的方法，所述修整重组酶能够使插入宿主细胞的基因组中的多种逆转录病毒毒株的原病毒DNA的长末端重复序列(LTR)内的不对称靶序列重组，以及涉及所获得的表达载体、用所述表达载体转染的细胞、表达的重组酶和包含所述表达载体、细胞和/或重组酶的药物组合物。药物组合物可用于例如治疗和/或预防逆转录病毒感染。具体地说，公开了多种HIV毒株中存在的不对称靶序列以及能够使这些序列组合的修整重组酶(Tre3.0和4.0)和编码所述修整重组酶的表达载体。
文档编号C12N15/867GK103154256SQ201180036911
公开日2013年6月12日 申请日期2011年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者J.豪伯, J.歇姆尼茨, F.布希霍尔茨, J.楚赛诺夫 申请人:海因里希·佩特研究所莱比锡试验病毒学研究所－民法基金会, 马克斯普朗克科学促进协会