专利名称：用于核酸合成和扩增的组合物、方法和试剂盒的制作方法
用于核酸合成和扩增的组合物、方法和试剂盒相关申请的交叉参考本申请根据35U. S. C. § 119(e)要求2010年6月21日提交的美国临时专利申请号61/357，021和2011年3月25日提交的美国临时专利申请号61/467，852的优先权的利益，将所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。领域本公开内容涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步RT-PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括一种或多种用于增强对PCR抑制剂的耐受性的试剂。
背景核酸的检测、分析、转录和扩增是现代分子生物学中最重要的方法中的一些方法。此类方法用于核酸分析的应用在基因表达的研究、感染性试剂或遗传疾病的诊断、cDNA的产生和逆转录病毒的分析等等应用中特别重要。逆转录RNA，随后通过聚合酶链式反应(PCR)进行cDNA扩增，通常称为RT-PCR或RNA-PCR，已被广泛用于检测和定量核酸靶并且对于病毒基因分析特别重要。致癌病毒及其在癌症的病理发生中的作用的研究可在癌症的诊断和治疗中具有重要意义。然而，致癌病毒的检测中的可变性可使这些研究成为挑战性的。检测法的灵敏性和特异性是关键问题。早期检测可通过使用分子生物学技术检测还未经历血清转换的样品中的致癌病毒核酸来实现，此类技术适用于不能在组织培养中繁殖的病毒。常规地，免疫检测法已被用于检测致癌病毒的存在，但此类方法具有几个缺点。在人乳头瘤病毒(HPV)(其可引起宫颈癌)的情况下，检测因早期病毒蛋白质的低表达和可区分HPV类型的的灵敏且特异的高质量抗体的缺乏而十分困难(Villa and Denny, International Journal ofGynecology and Obstetrics, 94 (Suppl.1) : S71-S80 (2006))。当样品因可以在样品收集之前已发生数目或数年的感染(如在爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)的情况下)而显示残余的抗体水平时，结果还可引起误导或不能得出结论，所述爱泼斯坦-巴尔病毒与何杰金淋巴瘤及其它癌相关(国家传染病中心(NationalCenter for Infectious Diseases)。“爱泼斯坦-巴尔病毒和传染性单核细胞增多症”，⑶C. http://www. cdc. gov/ncidod/diseases/ebv. htm(2010年11月))。病毒核酸的基于PCR的检测不仅因序列特异性引物结合而具有高度特异性的有利方面，而且其还因为其扩增更短的核酸片段的能力而比其它杂交技术例如Northern和Southern印迹那样麻烦比它们更灵敏。序列特异性探针结合给实时PCR添加了额外层的特异性并且具有提供病毒载量信息的额外有利方面。RT-PCR通常包括两个单独的分子合成⑴cDNA从RNA模板的合成；和(ii)新合成的cDNA通过PCR扩增的复制。可使用两种或更多种酶，通过单步(或偶联)RT-PCR法进行RT-PCR，其中将至少两种单独的酶(例如，逆转录酶和聚合酶)分别用于初始cDNA合成和随后的扩增。在单步RT-PCR中，将逆转录和PCR扩增组合至单个反应混合物中，这提供了优于两步骤RT-PCR(其中使用两个不同的或单独的反应进行合成和扩增步骤)的众多有利方面。单步骤RT-PCR需要比二步骤RT-PCR更少的对于反应混合物和核酸产物的操作(例如，两个反应步骤之间为了添加组分或酶而进行的反应管的打开)，从而是劳动密集度较低并且耗时较少的方法。必要时，单步骤RT-PCR还允许使用更少的样品，以及减小污染的风险(Sellner 和 Turbett, Biotechniques25:234-238(1998))。然而，单步骤RT-PCR法的使用具有一些缺点。例如，逆转录酶对DNA聚合酶的比率的个体优化对于用于单步骤RT-PCR的即可使用的组合物或试剂盒通常是不可行的。几篇报道也已证明当在单管RT-PCR反应中组合使用时逆转录酶与DNA聚合酶之间的干扰导致低灵敏性或结果的缺乏(Sellner，L. N.，等人，Nucl. Acids Res. 20:1487-1490 (1992))。此外，从其提取病毒核酸的样品通常包含抑制PCR的额外化合物。土壤和粪便中的腐殖酸、血液中的血色素、血清中的免疫球蛋白G以及各种血液抗凝剂如肝素和柠檬酸盐全都是此类抑制剂的实例。此类抑制剂在核酸提取和纯化过程中不可能被完全去除，从而负面影响下游PCR扩增，如通过当利用实时PCR测定时Ct ( S卩，循环阈值)的增加和dRn(即，标准化报道分子信号的差异)的减小所反映的。与低dRn偶联的高Ct通常表示定量PCR (qPCR)和逆转录酶-qPCR (RT-qPCR)应用中的反应中的低靶核酸浓度。显示减小的扩增或无扩增的反应表示靶核酸不存在或以少至不可被检测的量存在。包含可检测量的靶但因PCR抑制剂的存在而被抑制的反应可显示假的高Ct和低dRn，这可导致用户相信靶核酸的量少于实际存在的量。如果抑制的水平足够严重，则反应可能不能完全扩增，从而导致假阴性结果。由于核酸合成应用对分子生物学和细胞生物学领域的重要性，因此以一般化的即可使用的组合物的形 式存在的显示高灵敏性的、不受样品的量限制、减少医生操作的量、使污染的风险降至最低、使试剂的费用减少至最少、以及使核酸终产物的量最大化的单步骤RT-PCR系统，是本领域所需要的。此外，减少或消除PCR抑制剂的负面影响的方法，特别地当分析其中样品来源通常包含此类抑制剂的病毒靶时，是确保准确结果所必需的。概述本发明总地说来涉及用于合成核酸的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用于在单步骤RT-PCR法中使用与一种或多种DNA聚合酶例如来自水生栖热菌(Thermophi Iusaquaticus) (Taq)的DNA聚合酶组合的一种或多种逆转录酶例如莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒。优选地，所述组合物还包含一种或多种用于增强对通常在从其提取核酸，特别地病毒核酸的样品(例如，粪便、血液、土壤等)中发现的多种化合物的耐受性(即，阻断或减缓PCR抑制)的试剂。此类PCR抑制剂阻断剂可包括例如牛血清白蛋白(BSA)和鱼胶(fish gelatin)。本教导从而有利于核酸分子的快速和高效的扩增和靶序列的检测和定量(这可用于多种工业、医学、法医和诊断目的)。本文中公开的实施方案对于病毒基因包括RNA和DNA靶的快速扩增和检测是特别有用的。具体地,本教导涉及包含至少一种活性DNA聚合酶和至少一种活性逆转录酶(RT)的组合物。在一些实施方案中，此类组合物还包含至少一种PCR抑制剂阻断剂，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂(如果存在的话)的耐受性。在一些实施方案中，本发明的逆转录酶为逆转录酶。在一些优选实施方案中，逆转录酶是热稳定性的。例如，热稳定性逆转录酶可以是M-MLV逆转录酶、其突变体、变体或衍生物。在一些实施方案中，M-MLV RT可包含一个或多个突变。此类突变可包括例如Y64、R116、D124、Η126、Υ133、Κ152、Q190、Τ197、Η204、V223、Μ289、Τ306 或 F309。在一些实施方案中，逆转录酶的浓度为约O. 5U/ μ L至约5U/ μ L。在一些实施方案中，本发明的聚合酶为DNA聚合酶。在一些优选实施方案中，DNA聚合酶为热稳定性DNA聚合酶。例如，热稳定性DNA聚合酶可以是Taq DNA聚合酶、其突变体、变体或衍生物。在一些实施方案中，DNA聚合酶的浓度为约O. 005υ/μ L至约O. 5U/y L。在一些实施方案中，本发明组合物的PCR抑制剂阻断剂为蛋白质、多肽或其肽衍生物。在一些优选实施方案中，PCR抑制剂阻断剂可以是明胶、白蛋白或其组合。这些可以包括例如鱼胶或牛血清白蛋白(BSA)。在一些更优选实施方案中，本发明组合物可包含至少鱼胶和BSA。在一些实施方案中，本发明组合物中BSA的浓度可以为约500ng/u L至约5000ng/u L。在其它实施方案中，本发明组合物中鱼胶的终浓度可以为约0.4%至约4%。在一些实施方案中，PCR抑制剂，如果存在于组合物中，可以是血色素、腐殖酸、肝素、EDTA、柠檬酸钠或免疫球蛋白G(IgG)。在一些实施方案中，本发明组合物在-20° C可以是液体或凝胶。在其它实施方案中，组合物在约-20° C可以不是固体。在其它实施方案中，组合物在约-20° C可以不冻结。在一些优选实施方案中，组合物在使用前不需要解冻。在一些实施方案中，本发明组合物还可包含一种或多种核苷酸(dNTP)。此类核苷酸可以是例如dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。在一些实施方案中，组合物中每一种核苷酸的浓度为约O. 5mM至约5mM。在一些实施方案中，本发明组合物还可包含甘油。在一些实施方案中，甘油的浓度为约5%至约50%。在本发明组合物的一些实施方案中，组合物还可包含RNA酶抑制蛋白(RIP)。在一些实施方案中，RIP的浓度为约O.1U/μ L至约l.OU/yL。在一些实施方案中，本发明组合物还可包含一种或多种去垢剂。在一些实施方案中，一种或多种去垢剂的浓度为约O. 005%至约O. 05%。在一些实施方案中，一种或多种去垢剂可以是阳离子、两性离子、阴离子或非离子型的。在一些实施方案中，非离子型去后剂可以是例如Nonidet P-40 (NP-40)去垢剂或TWEEN20去垢剂。在一些实施方案中，本发明组合物还可包含一种或多种被动参考对照(passivereference control)。在一些实施方案中，一种或多种被动参考对照可以是例如ROX染料。在一些实施方案中，可将本发明组合物配制为浓缩原液。在一些实施方案中，此类浓缩原液可以为约2X至约6X原液。在一些实施方案中，此类原液可被稀释用于随后用于例如核酸合成法中。在一些优选实施方案中，可将组合物配制为至少4X原液。本教导还涉及用于进行核酸样品的RT-PCR的方法。在一些实施方案中，本方法可包括步骤(i)将包含至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶或至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物与(a)核酸样品；(b) —种或多种标记的探针；和(c) 一种或多种引物混合，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂(当存在时)的耐受性；和(ii)对所述核酸样品进行RT-PCR。在本发明方法的一些实施方案中，可从来源例如血液、汗、眼泪、土壤、唾液、尿或粪便提取核酸样品。
在本发明方法的一些实施方案中，可在单个容器(例如，管、室、孔)或单个反应混合物中进行RT-PCR。在本发明方法的一些实施方案中，将包含至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物与(a)核酸样品；(b) —种或多种标记的探针；或(C) 一种或多种引物混合。在本发明方法的一些实施方案中，一种或多种标记的探针可以是
权利要求
1.包含至少一种DNA聚合酶、至少一种逆转录酶(RT)和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性。
2.权利要求1的组合物，其中所述逆转录酶为热稳定性的逆转录酶。
3.权利要求2的组合物，其中所述热稳定性的逆转录酶为M-MLV逆转录酶或其突变体、 变体或衍生物。
4.权利要求3的组合物，其中所述MMLVRT包含选自Y64、R116、D124、H126、Y133、K152、 Q190、T197、H204、V223、M289、T306 或 F309 的一个或多个突变。
5.权利要求1的组合物，其中所述DNA聚合酶是热稳定性DNA聚合酶。
6.权利要求5的组合物，其中所述热稳定性DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶或其突变体、 变体或衍生物。
7.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂阻断剂为蛋白质。
8.权利要求7的组合物，其中所述蛋白质为明胶。
9.权利要求8的组合物，其中所述明胶为鱼胶。
10.权利要求7的组合物，其中所述蛋白质为白蛋白。
11.权利要求10的组合物，其中所述白蛋白为牛血清白蛋白(BSA)。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含至少鱼胶和BSA。
13.权利要求12的组合物，其中BSA的浓度是约500ng/ μ L至5000ng/ μ L。
14.权利要求12的组合物,其中所述鱼胶的浓度是约O. 4%至4%。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20° C为液体或凝胶。
16.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20° C不为固体。
17.权利要求1的组合物，其中所述组合物在-20° C不冻结。
18.权利要求1的组合物，其中所述组合物在使用之前不需要解冻。
19.权利要求1的组合物，其中所述PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸、肝素或EDTA。
20.权利要求1的组合物，还包含一种或多种核苷酸(dNTP)。
21.权利要求20的组合物，其中所述核苷酸选自dTTP、dATP、dCTP、dGTP或dUTP。
22.权利要求20的组合物，其中所述核苷酸的每一种的浓度为约O.5mM至5mM。
23.权利要求1的组合物,还包含甘油。
24.权利要求23的组合物，其中所述甘油的浓度为5%-50%。
25.权利要求1的组合物，还包含RNA酶抑制蛋白(RIP)。
26.权利要求25的组合物，其中所述RIP的浓度为O.1U/ μ L至1. OU/ μ L。
27.权利要求1的组合物,还包含去垢剂。
28.权利要求27的组合物，其中所述去垢剂为ΝΡ-40或TWEEN20。
29.权利要求27的组合物，其中所述去垢剂的浓度为O.005%至O. 05%。
30.权利要求1的组合物，还包含被动参考对照。
31.权利要求30的组合物，其中所述被动参考对照为ROX染料。
32.权利要求1的组合物，其中所述组合物为浓缩原液。
33.权利要求32的组合物，其中所述浓缩原液为2Χ至5Χ原液。
34.权利要求1或32的组合物，其中所述组合物用于核酸合成、核酸扩增或RT-PCR法。
35.进行核酸样品的RT-PCR的方法，包括将组合物与 a)核酸样品; b)一种或多种标记的探针； c)一种或多种引物混合， 所述组合物包含 至少一种活性逆转录酶； 至少一种活性DNA聚合酶；和 至少一种PCR抑制剂阻断剂，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性；和 对所述核酸样品进行RT-PCR。
36.权利要求35的方法，其中所述核酸样品获自包含PCR抑制剂的来源。
37.权利要求36的方法，其中所述核酸来源选自血液、汗、眼泪、土壤、唾液、尿和粪便。
38.权利要求35的方法，其中所述标记的探针为
39.权利要求35的方法，其中所述一种或多种PCR抑制剂选自血色素、腐殖酸和肝素。
40.权利要求35的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为鱼胶。
41.权利要求35的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为BSA。
42.权利要求35的方法，其中在单个管或反应中进行所述RT-PCR。
43.权利要求35的方法，其中在所述与a、b或c混合之前不解冻所述组合物。
44.权利要求34的方法，其中所述增强的耐受性通过Ct的减小来表示。
45.权利要求34的方法，其中所述增强的耐受性是当与使用不含PCR抑制剂阻断剂的组合物的方法比较时增强至少10%。
46.权利要求44的方法，其中Ct减小至少ICto
47.权利要求41的方法，其中所述BSA的浓度为至少500ng/μ L。
48.权利要求46的方法，其中当至少40μ M血色素存在于所述组合物中时观察到至少为8的Ct的减小，当至少IOng/ μ L腐殖酸存在于所述组合物中时，观察到至少为7的Ct的减小。
49.权利要求40的方法，其中鱼胶的所述浓度为至少1%。
50.权利要求46的方法，其中当至少IOng/μL腐殖酸存在于所述组合物中时观察到至少为3的Ct的减小，或当至少O. 06U的肝素存在于所述组合物中时观察到至少为6的Ct的减小。
51.用于扩增核酸分子的方法，所述方法包括 将核酸模板与包含一种或多种逆转录酶、一种或多种DNA聚合酶以及一种或多种PCR抑制剂阻断剂的组合物混合以形成反应混合物；和 在足以扩增与所述核酸模板的全部或部分互补的核酸分子的条件下温育所述反应混合物。
52.权利要求51的方法,其中所述核酸模板为RNA。
53.权利要求51的方法,其中所述核酸模板为DNA。
54.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为鱼胶。
55.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂的至少一种为BSA。
56.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂增强对一种或多种PCR抑制剂的耐受性。
57.权利要求51的方法，其中所述PCR抑制剂的至少一种选自血色素、腐殖酸或肝素。
58.权利要求56的方法，其中所述耐受性的增加由Ct的减小来表示。
59.权利要求58的方法，其中所述Ct的减小是减小至少lCt。
60.用于核酸合成的方法，所述方法包括将一种或多种第一核酸分子与一种或多种逆转录酶、一种或多种聚合酶和一种或多种 PCR抑制剂阻断剂混合；和在足以产生与所述一种或多种第一核酸分子的全部或部分互补的一种或多种第二核酸分子的条件下温育所述混合物。
61.权利要求60的方法,其中所述第一核酸分子为RNA。
62.权利要求60的方法,其中所述第一或第二核酸分子为DNA。
63.权利要求60的方法，其中所述PCR抑制剂阻断剂为鱼胶或BSA。
64.反应混合物，其包含至少一种逆转录酶；至少一种聚合酶；至少一种PCR抑制剂阻断剂；和至少一种核苷酸。
65.权利要求64的反应混合物，还包含标记的探针。
66.权利要求65的反应混合物，其中所述探针为TaqMan :探针。
67.权利要求64的反应混合物，还包含至少一种引物。
68.权利要求64的反应混合物，还包含核酸模板。
69.权利要求68的反应混合物，其中所述核酸模板为RNA。
70.权利要求68的反应混合物，其中所述核酸模板为DNA。
71.试剂盒，其在单个容器中包含含有至少一种逆转录酶、至少一种DNA聚合酶和至少一种PCR抑制剂阻断剂的组合物。
72.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物在-20°C为凝胶。
73.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物在-20°C不是固体。
74.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物在-20°C不冻结。
75.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物为4X浓缩原液。
76.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物用于RT-PCR法。
77.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物用于核酸合成方法。
78.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物用于核酸扩增方法。
79.权利要求71的试剂盒，还在至少一个其它容器中包含含有至少一种探针和/或至少一种引物的组合物。
80.权利要求79的试剂盒，其中所述探针为TaqMan 探针。
81.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物还包括至少一种核苷酸。
82.权利要求71的试剂盒，其中所述组合物还包含缓冲剂或盐溶液。
83.权利要求76-78的任一项的试剂盒，其中所述方法包括热循环。
84.权利要求83的试剂盒，其中所述热循环为快速热循环。
85.权利要求76-78的任一项的试剂盒，其中所述方法包括多路。
86.权利要求71的试剂盒，其中所述逆转录酶为M-MLV或其具有逆转录酶活性的任何突变体、变体或衍生物。
87.权利要求71的试剂盒，其中所述聚合酶为TaqDNA聚合酶或其具有DNA聚合酶活性的任何突变体、变体或衍生物。
全文摘要
本发明涉及用于合成核酸分子的组合物、方法和试剂盒。更具体地，提供了用以在单步骤RT-PCR法中扩增核酸分子的组合物、方法和试剂盒，其包括用于增强对PCR抑制剂的耐受性的一种或多种试剂。
文档编号C12Q1/68GK103038366SQ201180037898
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月20日 优先权日2010年6月21日
发明者C·胡, J·伯克曼, P·严 申请人:生命技术公司