底物特异性得到改变的阿马多里酶的制作方法

文档序号:407393阅读:488来源:国知局
专利名称:底物特异性得到改变的阿马多里酶的制作方法
技术领域
本发明涉及底物特异性得到改变的阿马多里酶、其基因和重组体DNA、以及底物特异性得到改变的阿马多里酶的制造方法。
背景技术
糖化蛋白质是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶方式形成共价键并进行阿马多里重排而生成的。作为蛋白质的氨基,可举出氨基末端的α氨基、蛋白质中的赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为在生物体内产生的糖化蛋白质,已知血液中的血红蛋白被糖化而成的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化而成的糖化白蛋白等。这些在生物体内产生的糖化蛋白质中,在糖尿病的临床诊断领域中,作为用于糖尿病患者的诊断、症状管理的重要的血糖对照标记,糖化血红蛋白(HbAlc)受到关注。血液中的HbAlc浓度反映过去的一定期间的平均血糖值,其测定值在糖尿病症状的诊断、管理中成为重要的指标。作为迅速且简便地测定该HbAlc的方法,提出了使用阿马多里酶的酶方法,S卩,将HbAlc用蛋白酶等分解,对从其β链氨基末端游离的α-果糖基缬氨酰基组氨酸(以下表示为aFVH)、或a -果糖基缴氨酸(以下表示为a FV)进行定量的方法(例如,参照专利文献I 6)。实际上,从HbAlc切出a FV的方法被认为夹杂物等带来的影响大,特别是现在测定a FVH的方法成为主流。阿马多里酶催化如下反应:在氧存在的条件下,将亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“阿马多里化合物”)氧化,生成乙醛酸或a -酮醛、氨基酸或肽、以及过氧化氢。就阿马多里酶而言,从细`菌、酵母、真菌中发现,而作为特别是对HbAlc的测定有用的具有对a FVH和/或a FV的酶活性的阿马多里酶,例如报告了来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、节菱抱(Arthrinium)属、弯抱(Curvularia)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、蛇抱腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、细基格抱(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属的阿马多里酶(例如,参照专利文献1、7 11,非专利文献I 4)。应予说明,上述报告例中,根据文献不同,阿马多里酶有时也被记载为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等表达。利用酶方法的HbAlc的测定中,作为阿马多里酶的性质要求严格的底物特异性。例如,如上所述,通过将游离的aFVH进行定量而实施HbAlc的测定时,优选使用对于在样品中以游离状态存在的、和/或在使用了蛋白酶等的HbAlc的处理工序中游离的除了 a FVH以外的糖化蛋白质氨基酸、糖化蛋白质肽难以作用的阿马多里酶。特别是,已知血红蛋白分子中所含的赖氨酸残基侧链的ε位的氨基受到糖化,启示来自该受到糖化的赖氨酸残基的ε位氨基被糖化的ε-果糖基赖氨酸(以下表示为ε FK)通过蛋白酶处理等而被游离(例如,参照非专利文献5)。因此,强烈期望难以对可成为测定误差的原因物质的eFK进行作用的、底物特异性高的阿马多里酶。另一方面,以往已知的阿马多里酶的大部分不能说对ε FK的反应性充分低。作为通常的技术,已知为了改变酶的底物特异性,对编码酶的DNA加入变异,对酶的氨基酸导入取代,选拔具备目标底物特异性的酶的方法。另外,在同源性高的酶中,在已知通过氨基酸取代而提高底物特异性这样的例子的情况下,也可以基于该信息来预想底物特异性的提闻。实际上,关于来自棒弯孢(Curvularia clavata) ΥΗ923的酮胺氧化酶以及来自侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta) 474的酮胺氧化酶,示出了通过取代多个氨基酸而提高了对a FVH的底物特异性的改变型酮胺氧化酶(参照专利文献I )。例如,在来自棒弯孢ΥΗ923的酮胺氧化酶中,通过将58位的异亮氨酸取代为缬氨酸、将62位的精氨酸取代为组氨酸、将330位的苯丙氨酸取代为亮氨酸,从而对ε -果糖基-(α -苄氧基羰基赖氨酸)(以下表示为ε FZK)的酶活性除以对a FVH的酶活性而导出的活性比ε FZK/ a FVH显示出从0.95向0.025减少。但是,就在上述文献中被用于评价改变型酮胺氧化酶的底物特异性的SFZK而言,与在将糖化血红蛋白用蛋白酶进行处理的工序中实际产生的eFK相比,在分子量、结构方面是相当不同的化合物。因此,难以根据对eFZK的反应性减少而说明对可成为实际测定误差的原因物质的eFK的反应 性减少。另外,也没有记载使用上述文献中的改变型酮胺氧化酶来确认对ε FK的反应性的减少的内容。除此以夕卜,还报告了通过对来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans) A89的果糖基氨基酸氧化酶导入氨基酸取代来改变底物特异性,从而新赋予了对a FVH的反应性的改变型果糖基氨基酸氧化酶(例如,参照专利文献10)。例如,显示了将来自构巢曲霉Α89的果糖基氨基酸氧化酶的59位的丝氨酸取代为甘氨酸、且将65位的赖氨酸取代为甘氨酸,或将109位的赖氨酸取代为谷氨酰胺,从而对aFVH新赋予酶活性。但是,并没有记载该氨基酸取代有助于对eFK的反应性的减少。另外,除此以外,还报告了通过对来自构巢曲霉A89的果糖基氨基酸氧化酶导入氨基酸取代来改变底物特异性,从而使对ε FK的酶活性除以对a FV的酶活性而得到的活性比ε FK/a FV减少的改变型果糖基氨基酸氧化酶(例如,参照专利文献12)。但是,对于该改变酶的对a FVH的酶活性没有任何提及。即,就包括天然型或变异型阿马多里酶在内的对ε FK的酶活性除以对a FVH的酶活性而导出的活性比ε FK/a FVH低和/或ε FK/a FV低的阿马多里酶的例子而言,迄今为止仅有极少报告,依然要求能够实现精度高的HbAlc的测定的、对ε FK的反应性充分低的阿马多里酶。专利文献1:国际公开第2004/104203号专利文献2:国际公开第2005/49857号专利文献3:日本特开2001-95598号公报专利文献4:日本特公平05-33997号公报专利文献5:日本特开平11-127895号公报专利文献6:国际公开第97/13872号
专利文献7:日本特开2003-235585号公报专利文献8:日本特开2004-275013号公报专利文献9:日本特开2004-275063号公报专利文献10:日本特开2010-35469号公报专利文献11:日本特开2010-57474号公报专利文献12:日本特开2010-104278号公报非专利文献非专利文献I:Biochem.Biophys.Res.Commun.311, 104-11,2003非专利文献2:Biotechnol.Bioeng.106, 358-66, 2010非专利文献3 J.Biosc1.Bioeng.102,241-3,2006非专利文献4:Eur.J.Biochem.242,499-505,1996非专利文献5 J.Biol.Chem.279,27613-20,200
发明内容
本发明所要解决的课题是提供对ε FK的反应性低,具体而言,ε FK/ a FVH低、和/或ε FK/a FV低的阿马多里酶。
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本发明的发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究,结果发现通过将来自锥毛壳属的阿马多里酶中的特定氨基酸残基取代为特定氨基酸残基,能够解决上述课题,从而完成了本发明。即,本发明如下。(I) 一种阿马多里酶,具有以下(a)和/或(b)的性质:(a)具有在序列号I所示的氨基酸序列进行了 I个或多个氨基酸的缺失、插入、添力口、和/或取代的氨基酸序列,与具有序列号I所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少。(b)具有在序列号I所示的氨基酸序列进行了 I个或多个氨基酸的缺失、插入、添力口、和/或取代的氨基酸序列,与具有序列号I所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。(2) 一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号I所示的氨基酸序列与选自以下(C)至(S)中的氨基酸对应的位置具有I个或更多的氨基酸残基的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。(C) 98位的谷氨酸(d) 259位的缬氨酸(e) 154位的丝氨酸(f) 125位的组氨酸(g) 261位的酪氨酸(h) 263位的甘氨酸(i) 106位的天冬氨酸
(j) 103位的甘氨酸(k) 355位的丙氨酸(I) 96位的天冬氨酸(s) 66位的赖氨酸或/和67位的缬氨酸(m) 70位的谷氨酰胺(O) 100位的苏氨酸(P) 110位的谷氨酰胺(q) 113位的丙氨酸(r) 114位的亮氨酸(s) 156位的天冬氨酸(3) 一种阿马多里酶,其特征在于,序列号I所示的氨基酸序列的氨基酸的与选自以下(t)至(a j )中的I个或更多的氨基酸对应的位置的氨基酸被取代为以下(t)至(a j )的各项中记载的取代后的氨基酸残基,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少: (t) 98位的谷氨酸被脯氨酸以外的氨基酸、即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸所取代;(u) 259位的缬氨酸被丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸所取代;(V) 154位的丝氨酸被甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸所取代;(w) 125位的组氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代;(X) 261位的酪氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸所取代;(y) 263位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代;(z) 106位的天冬氨酸被分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺所取代;(aa) 103位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸所取代;(ab) 355位的丙氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代;(ac) 96位的天冬氨酸被丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸所取代;(ad) 66位的赖氨酸被甘氨酸或/和67位的缬氨酸被脯氨酸所取代;(ae) 70位的谷氨酰胺被脯氨酸所取代;(af) 100位的苏氨酸被精氨酸所取代;(ag)110位的谷氨酰胺被丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代;(ah) 113位的丙氨酸被谷氨酸、赖氨酸所取代;(ai) 114位的亮氨酸被赖氨酸、精氨酸所取代;(aj) 156位的天冬氨酸被天冬酰胺所取代。
(4)根据上述(3)所述的阿马多里酶,其中,在序列号I所示的氨基酸序列中具有选自以下(ba)至(be)中的氨基酸残基的取代:(ba)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;(bb)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺;(be)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸;(bd)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;(be)与110位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。(5) 一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号272所示的氨基酸序列中具有与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的取代、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸向天冬酰胺的取代、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,且与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。(6) —种阿马多里酶,其特征在于,在序列号241所示的氨基酸序列中具有选自以下(ca)至(cc)中的氨基酸残基的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,且与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少:(ca)与98位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与110位的赖氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;(cb)与98位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸;(cc)与110位的赖氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。(7) 一种阿马多里酶基因,编码上述(I) (6)中任一项所述的氨基酸序列。(8)—种重组载体,包含上述(7)所述的阿马多里酶基因。(9) 一种宿主细胞,包含上述(8)所述的重组载体。(10) 一种制造阿马 多里酶的方法,包括以下工序:(ak)培养上述(6)所述的宿主细胞的工序;(al)使宿主细胞所含的阿马多里酶基因表达的工序;以及(am)从培养物分离阿马多里酶的工序。
(11)一种用于测定糖化血红蛋白的试剂盒,其中,包含上述(I) (6)中任一项所述的阿马多里酶。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-176967号以及2010-213070号的说明书和/或附图中记载的内容。根据本发明,能够提供可作为糖尿病的诊断用酶、另外能够被有效地用于糖尿病标记物测定试剂盒的底物特异性优异的阿马多里酶,具体而言,能够提供ε FK/ a FVH低、和/或ε FK/a FV低的阿马多里酶。


图1是例示各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列中的同源性的图。图2是表示利用本发明的阿马多里酶的a FVH定量性的图表。
具体实施例方式下面详细说明本发明。(阿马多里酶)阿马多里酶也被称为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶,是指在氧存在的条件下,催化将亚氨基二乙酸或其衍生物(阿马多里化合物)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽、以及过氧化氢的反应的酶。阿马多里酶在自然界广泛分布,可通过探索微生物、动物或植物起源的酶而获得。在微生物中,例如,可由丝状菌、酵母或细菌等获得。本发明的阿马多里酶是基于具有序列号I所示的氨基酸序列的来自锥毛壳属的阿马多里酶而制作的、底物特异性得到改`变的阿马多里酶的改变体。作为这样的变异体的例子,可举出具有与序列号I具有高的序列同源性(例如,75%以上,优选为80%以上,更优选为85%以上,进一步优选为90%以上,进一步优选为95%以上,进一步优选为97%以上,最优选为99%以上)的氨基酸序列的阿马多里酶,以及具有在序列号I的氨基酸序列中,I个至多个氨基酸被改变或变异、或缺失、取代、添加和/或插入而得的氨基酸序列的阿马多里酶。应予说明,只要是满足与专利请求保护范围中记载的底物特异性和/或氨基酸序列相关的条件,也可以是基于来自例如正青霉属、节菱孢属、弯孢属、小球腔菌属、新赤壳菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、棘壳孢属、曲霉属、隐球菌属、暗球腔菌属、细基格孢属、或青霉属这样的其它生物种类的阿马多里酶而制作的。底物特异性得到改变的阿马多里酶的改变体可通过在阿马多里酶的氨基酸序列中至少取代I个氨基酸残基而获得。作为带来底物特异性的改变的氨基酸的取代,可举出与序列号I所示的氨基酸序列中的以下位置的氨基酸对应的位置的氨基酸的取代。(1)98位的谷氨酸的取代,例如,被取代为脯氨酸以外的氨基酸,即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。(2) 259位的缬氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸。(3) 154位的丝氨酸的取代,例如,被取代为甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸。(4) 125位的组氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸。(5)261位的酪氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸。(6) 263位的甘氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。(7)106位的天冬氨酸的取代,例如,被取代为分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺。(8) 103位的甘氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸。(9) 355位的丙氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。(10) 96位的天冬氨酸的取代,例如,被取代为丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸。(11)66位的赖氨酸的取代,例如,被取代为甘氨酸。(12) 67位的缬氨酸的取代,例如,被取代为脯氨酸。(13) 70位的谷氨酰胺的取代,例如,被取代为脯氨酸。
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(14) 100位的苏氨酸的取代,例如,被取代为精氨酸。(15)110位的谷氨酰胺的取代,例如,被取代为丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸。(16) 113位的丙氨酸的取代,例如,被取代为谷氨酸、赖氨酸。(17) 114位的亮氨酸的取代,例如,被取代为赖氨酸、精氨酸。(18) 156位的天冬氨酸的取代,例如,被取代为天冬酰胺。底物特异性得到改变的阿马多里酶的变异体只要至少具有I个上述氨基酸取代即可,也可以具有多个氨基酸取代。例如,具有上述氨基酸取代中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17 或 18 个。其中,优选具有与以下氨基酸的位置对应的氨基酸的取代的变异体。在本发明中,例如,将第110位的谷氨酰胺(Q)被取代为精氨酸(R)的变异表示为Q110R。66位的赖氨酸和67位的缬氨酸的取代,例如,具有K66G和V67P的变异体。66位的赖氨酸、67位的缬氨酸和98位的谷氨酸的取代,例如,具有K66G、V67P和E98A的变异体。66位的赖氨酸、67位的缬氨酸和110位的谷氨酰胺的取代,例如,具有K66G、V67P和QllOR的变异体。98位的谷氨酸和110位的谷氨酰胺的取代,例如,具有E98A和QllOR的变异体。110位的谷氨酰胺和125位的组氨酸的取代,例如,具有QllOR和H125Q的变异体。110位的谷氨酰胺和154位的丝氨酸的取代,例如,具有QllOR和S154G或S154N的变异体。110位的谷氨酰胺和355位的丙氨酸的取代,例如,具有QllOR和A355K的变异体。98位的谷氨酸和103位的甘氨酸的取代,例如,具有E98A和G103R的变异体。98位的谷氨酸和154位的丝氨酸的取代,例如,具有E98A或E98R和S154N的变异体。110位的谷氨酰胺和154位的丝氨酸的取代,例如,具有Q11OR和S154C的变异体。98位的谷氨酸、106位的天冬氨酸和154位的丝氨酸的取代,例如,具有E98A、D106S和S154N的变异体。98位的谷氨酸、110位的谷氨酰胺和154位的丝氨酸的取代,例如,具有E98A、QlIOR和S154N的变异体。110位的谷氨酰胺、125位的组氨酸和154位的丝氨酸的取代,例如,具有Q110R、H125Q和S154N的变异体。98位的谷氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有E98Q和V259A、E98Q和V259C、E98H 和 V259A、E98H 和 V259C、E98R 和 V259C、E98A 和 V259C 的变异体。98位的谷氨酸和263位的甘氨酸的取代,例如,具有E98A和G263R的变异体。110位的谷氨酰胺和259位的缬氨酸的取代,例如,具有QlIOR和V259A的变异体。154位的丝氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有S154D和V259A的变异体。98位的谷氨酸、154位的丝氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有E98A、S154N和V259C的变异体。110位的谷氨酰胺、154位的丝氨酸和259位的缬氨酸的取代,例如,具有Q110R、S154N和V259A的变异体。在这些氨基酸取代的组合中,优选以下(ba) (be)中的任一组合。(ba)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。(bb)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺。(be)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。(bd)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。(be)与110位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。本发明的底物特异性得到 改变的阿马多里酶变异体包含由如下的氨基酸序列构成、具有阿马多里酶活性且底物特异性得到改变的阿马多里酶变异体,所述氨基酸序列在序列号I所示的氨基酸序列中具有带来上述底物特异性的改变的氨基酸的取代,在这些取代氨基酸以外的位置,进一步缺失、插入、添加和/或取代有I个或多个(例如I 10个、优选为I 5个、进一步优选为I 3个、特别优选为I个)氨基酸。进而,包含由如下的氨基酸序列构成、具有阿马多里酶活性且底物特异性得到改变的阿马多里酶变异体,所述氨基酸序列具有带来上述底物特异性的改变的氨基酸的取代变异、使耐热性提高的氨基酸的取代变异,相对于序列号I所示的氨基酸序列中的将该取代了的氨基酸以外的氨基酸排除的部分的氨基酸序列,具有90%以上、进一步优选为95%以上、进一步优选为97%以上、特别优选为99%以上的氨基酸序列同源性。在上述氨基酸取代中,氨基酸的位置表示序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置,在来自其它生物种类的阿马多里酶的氨基酸序列中,与序列号I所示的氨基酸序列中的位置对应的位置的氨基酸被取代。对于“对应位置”的含义在后叙述。(编码阿马多里酶的基因的取得)为了得到编码这些阿马多里酶的本发明的基因(以下,仅称为“阿马多里酶基因”),通常使用一般使用的基因的克隆方法。例如,可以由具有阿马多里酶生产能力的微生物菌体、各种细胞,利用常规方法,例如Current Protocols in Molecular BiologyCffILEYInterscience, 1989)记载的方法,提取染色体DNA或mRNA。进而,可以将mRNA作为模板来合成cDNA。使用这样得到的染色体DNA或cDNA,能够制作染色体DNA或cDNA的文库。接下来,基于上述阿马多里酶的氨基酸序列,合成适当的探针DNA,利用其从染色体DNA或cDNA的文库中选拔阿马多里酶基因的方法、或者基于上述氨基酸序列,制作适当的引物DNA,通过5’ RACE法、3’ RACE法等适当的聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction、PCR法)来扩增包含编码阿马多里酶的目标基因片段的DNA,使这些DNA片段连结,能够得到包含目标阿马多里酶基因的全长的DNA。作为这样得到的编码阿马多里酶的基因的优选的一个例子,可举出来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(专利文献7)。从操作方面考虑,优选这些阿马多里酶基因按照常规方法与各种载体连结。例如,由包含对来自锥毛壳属NISL9330株的阿马多里酶基因进行编码的DNA的重组体质粒PKK223-3-CFP (专利文献7),通过用QIAGEN (QIAGEN公司制),能够提取、纯化对阿马多里酶基因进行编码的DNA。
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(载体)作为能够在本发明中使用的载体,不限于上述质粒,可以使用除此以外的例如噬菌体、粘粒等本领域技术人员公知的任意载体。具体而言,例如,优选pBluescriptll SK+(STRATAGENE 公司制)等。(阿马多里酶基因的变异处理)阿马多里酶基因的变异处理可以用与意图的变异形态相应的公知的任意方法来进行。即,可以广泛使用使阿马多里酶基因或整合了该基因的重组体DNA与成为变异原的药剂接触 作用的方法;紫外线照射法;基因工程学手段;或运用蛋白质工程学手段的方法
坐寸ο作为成为在上述变异处理中使用的变异原的药剂,例如,可举出羟基胺、N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼、甲酸、或5-溴尿嘧啶等。该接触.作用的各种条件可以采用与所使用的药剂的种类等相应的条件,只要是在现实中能够在阿马多里酶基因中引起所期望的变异就没有特别限定。通常,优选在0.5 12M的上述药剂浓度中,在20 80°C的反应温度下接触 作用10分钟以上、优选为10 180分钟,从而能够引起所期望的变异。在进行紫外线照射的情况下,也可以如上所述根据常规方法来进行(现代化学,024 30,1989年6月号)。作为运用蛋白质工程学手段的方法,一般可以使用作为位点特异性突变(Site-Specific Mutagenesis)而已知的手段。例如,可举出 Kramer 法(Nucleic AcidsRes., 12, 9441 (1984):Methods Enzymo1.,154, 350 (1987):Gene, 37,73 (1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res.,13,8749 (1985):Nucleic Acids Res.,13,8765 (1985):NucleicAcids Res, 14, 9679 (1986))、Kunkel 法(Proc.Natl.Acid.Sc1.U.S.A.,82,488 (1985):Methods Enzymol., 154, 367 (1987))等。另外,也可以使用作为一般的PCR法而已知的手段(Technique, 1,11 (1989)参照)。应予说明,除了上述基因改变法以外,也可以通过有机合成法或酶合成法来直接合成所期望的改变阿马多里酶基因。在进行由上述方法得到的阿马多里酶基因的DNA碱基序列的确定或确认的情况下,例如,可以通过使用多毛细管DNA解析系统CEQ2000 (Beckman Coulter公司制)等来进行。(转化 转导)可以将上述得到的阿马多里酶基因利用常规方法导入噬菌体、粘粒、或者被用于原核细胞或真核细胞的转化的质粒等载体中,将与各个载体对应的宿主利用常规方法进行转化或转导。例如,使用例如得到的重组体DNA,将作为宿主的属于埃希氏菌属的微生物,例如大肠杆菌K-12株、优选为大肠杆菌JM109株、大肠杆菌DH5a株(同为Takara Bio公司制)等进行转化或转导至它们中,得到各种菌株。(氨基酸序列的同源性)氨基酸序列的同源性可以利用GENETYX-Mac (Software Development公司制)的最大匹配、同源性检索等程序,或DNASIS Pro (Hitachi Soft制)的最大匹配、多序列比对等程序来进行计算。(与氨基酸对应的位置的确定)“与氨基酸对应的位置”是指与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列的特定位置的氨基酸对应的来自其它生物种类的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。作为确定“与氨基酸对应的位置”的方法,可以如下进行:使用例如Lipman-Pearson法等公知的算法来比较氨基酸序列,对各阿马多里酶的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基赋予最大的同源性。通过将阿马多里酶的氨基酸序列用这种方法进行排列,可以不管氨基酸序列中存在的插入、缺失,都能够确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列中的序列中位置。认为相同位置是在三维结构中存在于同一位置,关于作为对象的阿马多里酶的特异性功能,能够推定具有类似效果。图1中表示来自各种生物种类的阿马多里酶的序列的比对。由图1可知与来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列的特定位置的氨基酸对应的来自其它生物种类的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。图1中表示来自锥毛壳属的阿马多里酶、来自土正青霉(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶、来自棘壳孢属(Pyrenochaeta sp.)的酮胺氧化酶、来自节菱孢属(Arthrinium sp.)的酮胺氧化酶、来自棒弯孢(Curvularia clavata)的酮胺氧化酶、来自侵管新赤壳菌(Neocosmosporavasinfecta)的酮胺氧化酶、来自 新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的果糖基氨基酸氧化酶、来自颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基肽氧化酶、来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的果糖基氨基酸氧化酶、来自细基格孢属(Ulocladium sp.)的果糖基氨基酸氧化酶和来自微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶的氨基酸序列。应予说明,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的66位的赖氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为66位的甘氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为66位的赖氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为66位的脯氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为66位的赖氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为66位的赖氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的脯氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为66位的脯氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为65位的赖氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的赖氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的甘氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的67位的缬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的67位的缬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为67位的脯氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为67位的缬氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为67位的缬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为67位的缬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为66位的脯氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为67 位的缬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为67位的脯氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的70位的谷氨酰胺对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的70位的谷氨酰胺对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为70位的谷氨酰胺,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为69位的谷氨酰胺,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为70位的谷氨酰胺,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为70位的谷氨酰胺。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的96位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。
S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为96位的天冬氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为95位的天冬氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为96位的天冬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为96位的天冬氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的98位的谷氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为98位的丝氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为98位的丙氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为98位的谷氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为98位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为98位的谷氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为98位的丙氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为98位的丙氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为97位的丝氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为98位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为98位的丝氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的100位的苏氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为100位的丝氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为100位的甘氨酸,来自节菱 孢属的酮胺氧化酶中为100位的苏氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为100位的甘氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为100位的丝氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为100位的苏氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为100位的甘氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为99位的苏氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为100位的甘氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为100位的丝氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸对应的位置”是指将将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的103位的甘氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为103位的甘氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为103位的甘氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为103位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为103位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为102位的甘氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为103位的甘氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为103位的甘氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的106位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为106位的天冬酰胺,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为106位的丙氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为106位的甘氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为106位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为105位的甘氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为106位的天冬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为106位的丝氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的Iio位的谷氨酰胺对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为110位的赖氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为Iio位的丙氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为110位的谷氨酰胺,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为110位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为110位的谷氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为110位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为110位的甘氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为109位的赖氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为110位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为110位的赖氨酸。另外,在本发明中,“与序`列号I记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的113位的丙氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为113位的苏氨酸、来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为113位的苏氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为113位的苏氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为113位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为113位的赖氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的丙氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为113位的丙氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为112位的丝氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的天冬氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的114位的亮氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为114位的亮氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为114位的亮氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为114位的异亮氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为114位的亮氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为113位的亮氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为114位的亮氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为114位的亮氨酸。另外,“与序列号I记载的氨基酸序列的125位的组氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I记载的氨基酸序列的125位的组氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为125位的天冬酰胺,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为125位的天冬酰胺,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为125位的苏氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为125位的苏氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为125位的组氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为125位的组氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为123位的天冬酰胺,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为124位的天冬酰胺,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为125位的苏氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为125位的天冬酰胺。另外,“与序列号I记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的154位的丝氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为154位的半胱氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为154位的丝氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为154位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为152位的丝氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为153位的半胱氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为154位的丝氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为154位的半胱氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的156位的天冬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的156位的天冬氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为156位的天冬氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为156位的谷氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为154位的天冬 氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为155位的天冬氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为156位的天冬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为156位的天冬氨酸。
另外,“与序列号I记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的259位的缬氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为259位的缬氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为257位的缬氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为259位的缬氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为257位的缬氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为259位的缬氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的缬氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为255位的缬氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的缬氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为257位的缬氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的缬氨酸。另外,“与序列号I记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的261位的酪氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为261位的酪氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为259位的酪氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为261位的酪氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为259位的酪氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为261位的酪氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的酪氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为257位的酪氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的酪氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为259位的酪氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的酪氨酸。另外,在本发明中,“与序列号I记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下, 与序列号I的阿马多里酶的263位的甘氨酸对应的氨基酸。由此,可以用特定的方法排列氨基酸序列而确定上述的“对应的位置的氨基酸”。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为263位的甘氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为261位的甘氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为263位的甘氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为261位的甘氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为263位的甘氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为263位的丝氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为259位的甘氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为263位的甘氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为261位的甘氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为263位的甘氨酸。另外,“与序列号I记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸对应的位置”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列与序列号I所示的来自锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列相比较的情况下,与序列号I的阿马多里酶的355位的丙氨酸对应的氨基酸。这也可以用上述方法排列氨基酸序列而确定。S卩,来自土正青霉的阿马多里酶中为355位的丙氨酸,来自棘壳孢属的酮胺氧化酶中为353位的丙氨酸,来自节菱孢属的酮胺氧化酶中为356位的丙氨酸,来自棒弯孢的酮胺氧化酶中为353位的丙氨酸,来自侵管新赤壳菌的酮胺氧化酶中为355位的丝氨酸,来自新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为355位的丙氨酸,来自颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为351位的丙氨酸,来自构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为355位的丙氨酸,来自细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为353位的丙氨酸,来自微紫青霉菌的果糖基氨基酸氧化酶中为355位的丙氨酸。(本发明的阿马多里酶的生产)使用具有上述得到的底物特异性得到改善的阿马多里酶的生产能力的菌株生产该阿马多里酶时,可以将该菌株用通常的固体培养法来进行培养,但优选尽可能采用液体培养法来进行培养。另外,作为培养上述菌株的培养基,例如可以使用如下得到的培养基,S卩,在酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆或小麦麸的浸出液等I种以上的氮源中添加氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等无机盐类中的I种以上,另外根据需要而适当添加糖质原料、维生素等。应予说明,培养基的初始pH优选调整为pH7 9。优选如下实施培养,即,利用通气搅拌式深部培养、振荡培养、静置培养等在20 42°C的培养温度、优选为37°C左右的培养温度下实施4 24小时,进一步优选在37°C左右的培养温度下实施4 8小时。培养结束后,由该培养物采集阿马多里酶时可以使用通常的酶采取手段。例如,可利用常规方法将菌体进行超声波破坏处理、磨碎处理等,或溶菌酶等溶解酶提取本酶,或在甲苯等存在的条件下振荡或放置而进行溶菌,使本酶排出到菌体外。然后,将该溶液进行过滤、离心分离等而除去固态部分,根据需要利用链霉素硫酸盐、鱼精蛋白硫酸盐、或硫酸锰等除去核酸后,向其中添加硫酸铵、醇、丙酮等而分离,采集沉淀物,得到阿马多里酶的粗酶。
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为了由上述阿马多里酶的粗酶进一步得到阿马多里酶纯化酶标准品,例如可以将使用葡聚糖凝胶、Superdex或Ultrogel等的凝胶过滤法;使用离子交换体的吸附溶出法;使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法;使用羟基磷灰石的吸附溶出法;蔗糖密度梯度离心法等沉降法;亲和层析法;使用分子筛膜或中空丝膜等的分离法等进行适当选择,或将它们组合而实施,从而能够得到纯化的阿马多里酶酶标准品。这样能够得到所期望的底物特异性得到改善的阿马多里酶。(本发明的阿马多里酶中的对εFK的反应性的降低)用上述手段得到的本发明的阿马多里酶的特征是通过基因改变等,在其氨基酸序列产生变异,结果与改变前的阿马多里酶相比较,提高了底物特异性。具体而言,其特征是与改变前的阿马多里酶相比较,“对ε FK的反应性”相对于“对a FVH的反应性”的比例、或者“对ε FK的反应性”相对于“对a FV的反应性”的比例减少。或者,其特征是与改变前的阿马多里酶相比较,“对eFK的反应性”相对于“对aFVH的反应性”的比例、以及“对ε FK的反应性”相对于“对a FV的反应性”的比例均减少。在糖化血红蛋白的测定中,对eFK的反应性高可成为测定误差的原因,因此对eFK的反应性的比例越低越好。具体而言,优选本发明的阿马多里酶中的显示对eFK的反应性相对于对a FVH的反应性的比例的ε FK/ a FVH相对于改变前减少10%以上、优选为20%以上、更优选为30%以上、进一步优选为40%以上。另外,优选本发明的阿马多里酶中的显示对ε FK的反应性相对于对a FV的反应性的比例的ε FK/ a FV相对于改变前减少10%以上、优选为20%以上、更优选为30%以上、进一步优选为40%以下。对ε FK的反应性相对于对a FVH的反应性的比例、或者对ε FK的反应性相对于对aFV的反应性的比例能够用公知的阿马多里酶的测定法,在任意条件下测定,并与改变前的阿马多里酶进行比较。例如,可通过求出PH7.0时,添加5mM的ε FK而测定的活性除以添加5mM的a FVH而测定的活性的比率,从而算出对ε FK的反应性相对于对a FVH的反应性的比例,将其以改变前的情形与改变后的情形进行比较。另外,例如,可通过求出ΡΗ7.0时,添加5mM的ε FK而测定的活性除以添加5mM的a FV而测定的活性的比率,从而算出对ε FK的反应性相对于对a FV的反应性的比例,用将其比较改变前的情形与改变后的情形进行比较。作为与改变前相比底物特异性提高的本发明的阿马多里酶的一个例子,例如可举出由大肠杆菌JM109 (pKK223-3-CFP-T7-Y261W)株生产的阿马多里酶。这样的底物特异性得到改善的阿马多里酶能够良好地减少将eFK作为噪声而测量到的程度,仅测定属于来自HbAlc的β链氨基末端的糖化蛋白质氨基酸的a FVH、或属于来自HbAlc的β链氨基末端的糖化蛋白质氨基酸的a FV,因此能够进行精度高的测定,在产业利用上非常有利。(阿马多里酶活性的测定方法)作为阿马多里酶的活性的测定方法,可以使用各种方法,作为一个例子,下面,对本发明中使用的阿马多里酶活性的测定方法进行说明。作为本发明中的阿马多里酶的酶活性的测定方法,可举出测定由酶反应而生成的过氧化氢量的方法、测定由酶反应而消耗的氧量的方法等作为主要测定方法。下面,作为一个例子,示出测定过氧化氢量的方法。对于本发明中的阿马多里酶的活性测定,除非另有说明,将aFVH、或eFK、或a FV用作底物。应予说明,就酶效价而言,将aFVH、或ε FK、或a FV作为底物来进行测定时,将I分钟生成I μ mo I过氧化氢的酶量定义为1U。ε FK等的糖化蛋白质氨基酸、以及a FVH等的糖化蛋白质肽例如可以使用基于阪上等的方法而合成、纯化的产物(参照日本特开2001-95598号公报)。A.:试剂的制备(I)试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液将5.0kU的过氧化酶(ΚΙΚΚ0ΜΑΝ公司制)、IOOmg的4_氨基安替比林(东京化成公司制)溶解于0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0或ρΗ7.5或ρΗ8.0),定容至1000ml。(2)试剂 2:TOOS 溶液将500mg的TOOS (同仁化学研究所制)溶解于离子交换水,定容至100ml。(3)试剂3:底物溶液(150mM ;终浓度5mM)将a FVH625mg、或ε FK462mg或a FV419mg溶解于离子交换水,定容至10ml。B:活性测定法

将2.7ml的试剂1、100 μ I的试剂2和100 μ I的酶液混合,在37°C下预加热5分钟。然后,加入100 μ I的试剂3,充分混合后,利用分光光度计(U-3010A,Hitachi HighTechnologies公司制)测定555nm下的吸光度。测定值为555nm下的I分钟后至2分钟后的每I分钟的吸光度变化。应予说明,对照液除了代替100 μ I的试剂3而加入100 μ I的离子交换水以外与上述相同。使用将其预先制作的过氧化氢的标准溶液来代替试剂3,另夕卜,代替酶液,使用离子交换水,从而准备调查了与其生成色素量的关系的图表。利用该图表,计算37°C下、每I分钟生成的过氧化氢的微摩尔数,将该数值作为酶液中的活性单位。以下,通过实施例进一步具体说明本发明。但是,本发明的技术范围不限于这些例子。实施例1(I)重组体质粒 pKK223-3-CFP-T7DNA 的制备将具有来自锥毛壳属的阿马多里酶基因(序列号2)的重组体质粒的大肠杆菌JM109 (pKK223-3-CFP-T7)株(参照国际公开第 2007/125779 号)接种于 3ml 的 LB-amp 培养基[1% (w/v) BACTO 胰蛋白胨、0.5% (w/v)蛋白胨、0.5% (w/v) NaCl、50 μ g/ml 氨苄青霉素],在37°C下振荡培养16小时,得到培养物。将该培养物以IOOOOXg离心分离I分钟,从而进行集菌而得到菌体。使用质粒提取试剂盒(GenElute Plasmid Min1-Prep Kit, Sigma-Aldrich公司制),由该菌体提取并纯化重组体质粒PKK223-3-CFP-T7,得到2.5 μ g的重组体质粒pKK223_3-CFP_T7DNA。(2)重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA的部位特异性改变操作将得到的重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号3、4的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),用以下条件进行PCR反应。S卩,加入10XKOD- Plus-缓冲液5 μ1、以dNTP成为各2mM的方式制备的dNTPs混合溶液5 μ l、25mM的MgSO4溶液2 μ1、成为模板的pKK223-3-CFP_T7DNA50ng、上述合成寡核苷酸各15pmol、l个单位的KOD-Plus-,利用灭菌水使总量为50 μ I。将制备的反应液利用热循环仪(Eppendorf公司制)在94°C下孵育2分钟,接着,将“94°C、15秒,,-“50。。、30秒“68°C、6分钟”的循环重复进行30次。将反应液的一部分用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,确认了约6000bp的DNA被特异性地扩增。将这样得到的DNA用限制性内切酶DpnI (New England Biolabs公司制)处理,将残存的模板DNA切断后,转化大肠杆菌JM109,展开于LB-amp琼脂培养基。将生长的菌落接种于LB-amp培养基进行振荡培养,用与上述(I)相同的方法分离质粒DNA。对该质粒中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列利用Multi Capillary DNA解析系统CEQ2000(BeckmanCoulter公司制)进行确定,得到对序列号I记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸被取代为甘氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-K66G)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的67位的缬氨酸取代为脯氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号5、6的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对编码序列号I记载的氨基酸序列的67位的缬氨酸被取代为脯氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-V67P)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸取代为甘氨酸、并将67位的缬氨酸取代为脯氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号7、8的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对编码序列号I记载的氨基酸序列的66位的赖氨酸被取代为甘氨酸、且67位的缬氨酸被取代为脯氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-K66GV67P)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的70位的谷氨酰胺取代为脯氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号9、10的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对编码序列号I记载的氨基酸序列的70位的谷氨酰胺被取代为脯氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-Q70P )。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号11、12的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的96位的天冬氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-D96A)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸取代为谷氨酰胺,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号13、14的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的98位的谷氨酸被取代为谷氨酰胺的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-E98Q )。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸取代为精氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为`模板,使用序列号15、16的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的100位的苏氨酸被取代为精氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-T100R)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸取代为精氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号17、18的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的103位的甘氨酸被取代为精氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-G103R)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号19、20的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的106位的天冬氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-D106A)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺取代为丙氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号21、22的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的110位的谷氨酰胺被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-Q110A)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸取代为谷氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号23、24的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的113位的丙氨酸被取代为谷氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-Al 13E )。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸取代为赖氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号25、26的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的114位的亮氨酸被取代为赖氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-L114K)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的125位的组氨酸取代为谷氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号27、28的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的125位的组氨酸被取代为谷氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-Hl 25E )。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸取代为谷氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号29、30的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的154位的丝氨酸被取代为谷氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-S154E)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的156位的天冬氨酸取代为天冬酰胺,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号31、32的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的156位的天冬氨酸被取代为天冬酰胺的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK 223-3-CFP-T7-D156N)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒pKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号33、34的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的259位的缬氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFPT7-V259A )。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸取代为丙氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号35、36的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的261位的酪氨酸被取代为丙氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(pKK223-3-CFP-T7-Y26 IA )。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸取代为精氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号37、38的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的263位的甘氨酸被取代为精氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7-G263R)。接着,为了将序列号I记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸取代为赖氨酸,将重组体质粒PKK223-3-CFP-T7DNA作为模板,使用序列号39、40的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东阳纺织公司制),在与上述相同的条件下进行PCR反应、大肠杆菌JM109的转化以及生长菌落保持的质粒DNA中的编码阿马多里酶的DNA的碱基序列确定。其结果是,得到对序列号I记载的氨基酸序列的355位的丙氨酸被取代为赖氨酸的改变型阿马多里酶进行编码的重组体质粒(PKK223-3-CFP-T7 -A355K )。(3)各种改变型阿马多里酶的生产将保持由上述步骤得到的上述重组体质粒的各个大肠杆菌JM109株在添加有0.1mM的IPTG的LB_amp培养基3ml中于30°C培养16小时。将得到的各培养菌体用20mM的HEPES-NaOH缓冲液(pH7.0)清洗后,悬浮于上述缓冲液中并进行超声波破碎处理,以20000 Xg离心分离10分钟,制备了用于确认底物特异性的酶液0.6ml。(4) ε FK/ a FVH、ε FK/ α FV 的测定使用上述酶液,利用上述B:活性测定法所示的方法,测定对a FVH、a FV和ε FK的酶活性。另外,为了比较,对于由大肠杆菌JM109 (PKK223-3-CFP-T7)株生产的改变前的阿马多里酶也进行同样的测定。应予说明,活性测定中使用了调整为ΡΗ7.0的试剂1:过氧化酶、4-氨基安替比林溶液。其结果是,由上述酶活性测定的结果得到的大肠杆菌JM109 (pKK223-3-CFP-T7)株所生产的改变前的阿马多里酶的ε FK/ a FVH为0.316,ε FK/ a FV为0.093。与此相对,将通过导入部位特异性变异而制作的改变后的各种阿马多里酶的ε FK/ a FVH、ε FK/ α FV、以及改变前的阿马多里酶的ε FK/ a FVH、ε FK/ a FV的值为100%时的改变后的阿马多里酶的ε FK/ a FVH、ε FK/ α FV的比率如表I所示。表I
权利要求
1.一种阿马多里酶,具有以下(a)和/或(b)的性质: (a)具有在序列号I所示的氨基酸序列进行了I个或多个氨基酸的缺失、插入、添加和/或取代的氨基酸序列,与具有序列号I所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少; (b)具有在序列号I所示的氨基酸序列进行了I个或多个氨基酸的缺失、插入、添加和/或取代的氨基酸序列,与具有序列号I所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。
2.—种阿马多里酶,其特征在于,在序列号I所示的氨基酸序列的与选自以下(C)至(S)中的氨基酸对应的位置具有I个或更多的氨基酸残基的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少, (C) 98位的谷氨酸 Cd) 259位的缬氨酸 Ce) 154位的丝氨酸 Cf) 125位的组氨酸 (g)261位的酪氨酸 (h)263位的甘氨酸 (i)106位的天冬氨酸 (j) 103位的甘氨酸 (k) 355位的丙氨酸 (I)96位的天冬氨酸 (s) 66位的赖氨酸或/和67位的缬氨酸 Cm) 70位的谷氨酰胺 (ο) 100位的苏氨酸 (P) 110位的谷氨酰胺 (q) 113位的丙氨酸 Cr) 114位的亮氨酸 (s) 156位的天冬氨酸。
3.—种阿马多里酶,其特征在于,序列号I所示的氨基酸序列的氨基酸的与选自以下(t)至(aj)中的I个或更多的氨基酸对应的位置的氨基酸被取代为以下(t)至(aj)的各项中记载的取代后的氨基酸残基,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少: (t) 98位的谷氨酸被脯氨酸以外的氨基酸,即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸所取代; (U) 259位的缬氨酸被丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸所取代;(v)154位的丝氨酸被甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸所取代; (w)125位的组氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代; (X) 261位的酪氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸所取代; (y) 263位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代; (z) 106位的天冬氨酸被分子量比天冬氨酸小的氨基酸,即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺所取代; (aa)103位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸所取代; (ab)355位的丙氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代; (ac)96位的天冬氨酸被丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸所取代; (ad)66位的赖氨酸被甘氨酸或/和67位的缬氨酸被脯氨酸所取代; (ae)70位的谷氨酰胺被脯氨酸所取代; (af)100位的苏氨酸被精氨酸所取代; (ag)110位的谷氨酰胺被丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代; (ah)113位的丙氨酸被谷氨酸、赖氨酸所取代; (ai)114位的亮氨酸被赖氨酸、精氨酸所取代; (aj) 156位的天冬氨酸被天冬酰胺所取代。
4.根据权利要求3所述的阿马多里酶,其中,在序列号I所示的氨基酸序列中具有选自以下(ba)至(be)中的氨基酸残基的取代: (ba)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸; (bb)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺; (be)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸; (bd)与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸; (be)与110位的谷氨酰胺对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为天冬酰胺、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸。
5.一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号272所示的氨基酸序列中具有与98位的谷氨酸对应的位置的氨基酸向丙氨酸的取代、与154位的丝氨酸对应的位置的氨基酸向天冬酰胺的取代、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸向半胱氨酸的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,且与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。
6.一种阿马多里酶,其特征在于,在序列号241所示的氨基酸序列中具有选自以下(ca)至(cc)中的氨基酸残基的取代,与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少,且与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较,对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少; (ca)与98位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、与110位的赖氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸; (cb)与98位的丝氨酸对应的位置的氨基酸被取代为丙氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸; (cc)与110位的赖氨酸对应的位置的氨基酸被取代为精氨酸、以及与259位的缬氨酸对应的位置的氨基酸被取代为半胱氨酸。
7.—种阿马多里酶基因,编码权利要求1 6中任一项所述的氨基酸序列。
8.一种重组载体,包含权利要求7所述的阿马多里酶基因。
9.一种宿主细胞,包含权利要求8所述的重组载体。
10.一种制造阿马多里酶的方法,包括以下工序: (ak)培养权利要求9所述的宿 主细胞的工序; (al)使宿主细胞所含的阿马多里酶基因表达的工序;以及 (am)从培养物分离阿马多里酶的工序。
11.一种用于测定糖化血红蛋白的试剂盒,其中,包含权利要求1 6中任一项所述的阿马多里酶。
全文摘要
本发明的目的是提供对果糖基缬氨酰基组氨酸的底物特异性高的阿马多里酶。本发明是在与选自来自锥毛壳(Coniochaeta)属的阿马多里酶的98位、259位、154位、125位、261位、263位、106位、103位、355位、96位、66位、67位、70位、100位、110位、113位、114位和156位中的氨基酸对应的位置具有1个或更多的氨基酸残基的取代的阿马多里酶,根据本发明,即便是在ε-果糖基赖氨酸的存在下,也能够正确测定来自糖化血红蛋白的β链氨基末端的α-果糖基缬氨酰基组氨酸。
文档编号C12N1/21GK103080308SQ20118003892
公开日2013年5月1日 申请日期2011年8月4日 优先权日2010年8月6日
发明者一柳敦, 广川浩三, 田锅康子, 钺阳介 申请人:龟甲万株式会社
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