光合作用产物的生产性得以提高的藻类、及其利用的制作方法

专利名称：光合作用产物的生产性得以提高的藻类、及其利用的制作方法
技术领域：
本发明涉及光合作用产物的生产性得以了提高的藻类、及其利用。具体涉及光合作用产物的生产性得以了提高的藻类、该藻类的制造方法、以及运用该藻类的生物量(biomass)制造方法。
背景技术：
人们一直期望来自生物量的燃料即生物燃料(例如生物乙醇、生物柴油)能成为一种可取代化石燃料的燃料。糖类(例如淀粉)及油脂等是生物燃料的原料，它们通过植物的光合作用而产生。因此，具有能活跃进行光合作用从而在细胞内积存糖类及油脂等的能力的植物，就能够用在生物量的生产手法中。目前，在生物量的生产中，主要运用的是玉米以及大豆。然而玉米以及大豆也被用作食料和饲料。因此人们一直将生物燃料大量增产所致的食料及饲料的物价高涨，视为一个问题。对此，作为一种可取代玉米及大豆的生物量生产手法，利用藻类的生物量生产技术在本领域中受到了关注(例如可参考专利文献I和专利文献2)。利用藻类的生物量生产技术的利点在于不会与食料及饲料发生竞合，能进行大量增殖等。例如藻类中的衣藻，已知其有细胞壁经缺损的变异体、或细胞壁变薄的变异体(cwl5、cw92等)。这些变异体具有易于将DNA从外部导入细胞内的性质，因此被广泛用于基因导入实验。此外，由于它们的细胞壁易破坏，因此易于收取细胞内容物。从这一观点看，其能提高生物量的生产性。目前已报告有利用这些变异体的生物量生产技术。例如在专利文献3中，揭示了一种利用细胞壁缺损后的衣藻变异体来生产油脂的技术。另外，非专利文献I报告了 细胞壁经变异(cwl5)且淀粉合成基因有缺失的衣藻会向细胞外释放出包含油脂的油滴。而非专 利文献2还作出了以下报告通过破坏衣藻的细胞壁变异体(cwl5)的淀粉合成基因，便能提高其油脂生产性。此外还有非专利文献3，其就衣藻细胞壁的变异而作了研究报告。另外还有一种以藻类中的小球藻作材料，使小球藻生产的淀粉释放至细胞外，然后用该淀粉进行乙醇发酵的技术(专利文献4)。[现有技术文献]专利文献1:日本国专利申请公开“特开平11-196885号公报”;1999年07月27日公开。专利文献2 :日本国专利申请公开“特开2003-310288号公报”;2003年11月05日公开。专利文献3 :国际公开第2009/153439号册子；2009年12月23日公开。专利文献4 :日本国专利申请公开“特开2010-88334号公报”;2010年04月22日公开。非专利文献I Zi Teng Wang,Nico Ullrich, Sunjoo Joo, Sabine Waffenschmidt,and Ursula Goodenough (2009)Eukaryotic Cell Vol. 8(12) : 1856-1868. Algal LipidBodies Stress Induction， Purification， and Biochemical Characterization inWild-Type and Starchless Chlamydomonas reinhardti1.非专利文献2 Yantao Li，Danxiang Han, Guongrong Hu, David Dauvillee，Milton Sommerfeld， Steven Ball and Qiang Hu(2010)Metabolic EngineeringVol. 12 (4) 387-391. Chlamydomonas starchless mutant defective in ADP-glucosepyrophosphorylase hyper-accumulates triacyIglycerol.非专利文献3 ；Hyams, J.，Davies, D. R. (1972)Mutation Research 14(4)381-389.The induction and characterisation of cell wall mutants ofChlamydomonas reinhard1.

发明内容
[本发明所要解决的课题]然而 上述使用藻类的生物量生产技术在生产性方面存在问题。例如，在异养条件下用乙酸等碳源培养藻类来生产生物量时，为了诱发藻类生产/积存生物量，需要通过营养限制步骤来使其处于氮贫乏状态等。由于藻类通常是用含氮的培养液来培养增殖的，因此为了使其处于氮贫乏状态，就得换用不含氮的培养液。因此有工序变复杂、生产性下降、成本升高的问题。本发明是就上述现有的问题而研发的，目的在于提供一种能在不进行营养限制步骤的情况下提高生物量生产性的藻类、及其利用。[用以解决课题的技术方案]本发明的发明者们以解决上述课题为主要目的，进行了各种研究。结果发现，通过人工地使藻类增加其叶绿体内的谷胱甘肽浓度，即使不进行氮贫乏状态等的营养限制步骤，也能提高藻类细胞内的生物量生产性。由此，完成了本发明。即，本发明的藻类的特征在于叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。本发明的藻类的制造方法用以制造上述藻类，其特征在于包含使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的谷胱甘肽浓度增加步骤。本发明的生物量制造方法的特征在于使用本发明的藻类、或经本发明的藻类的制造方法而制得的藻类。本发明的生物量制造方法的特征在于包含在用来增加藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度的物质的存在下，培养该藻类的步骤。[发明效果]由于本发明的藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加，因而即使不使其处于氮贫乏状态，也能提高藻类细胞内的光合作用产物的生产性。因此，若使用本发明的藻类，便不需要通过将培养液换成不含氮的培养液来引发光合作用产物的积存。也就是说，通过本发明，能容易且有效地引发光合作用产物的积存。因此相比于现有技术，本发明的生物量制造方法能廉价且高效地用藻类来制造生物量。本发明的其他目的、特征和优越点在以下的记述中将会十分明了。另外，本发明的益处将通过以下的说明和附图而变得明确。


图1表示实施例1中制成的GSHl过剩表达株的增殖能力及淀粉生产能力的调查结果，(a)是表示GSHl过剩表达株的增殖能力的图表，(b)是表示培养开始309小时后的培养液状态的图，(c)是表示试料4的淀粉遇碘反应结果的图。图2表示母株(野生型株)的增殖能力及淀粉生产能力的调查结果，(a)是表示母株(野生型株)的增殖能力的图表，(b)是表示培养开始215小时后的培养液状态的图。图3表示试料8的母株(野生型株)状态的调查结果，(a)是试料8的母株(野生型株)中的发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的直方图，(b)试料8的母株(野生型株)培养物中的浮游颗粒的大小、与颗粒内部复杂度之间的相关图。图4表示试料4的GSHl过剩表达株的状态的调查结果，(a)是试料4的GSHl过剩表达株中的发出叶绿素荧光的细胞(颗粒)的直方图，(b)是试料4的GSHl过剩表达株培养物中的浮游颗粒的大小、与颗粒内部复杂度之间的相关图。图5的(a)是试料9和试料10中的发出叶绿素荧光的颗粒(即细胞)的密度、和不发出叶绿素荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上变化的图表，(b)是试料9和试料10的每份培养液中的淀粉量在时间上变化的图表，(c)是试料9和试料10中每单个细胞的换算淀粉量在时间上变化的图表；(b)及(c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。图6的(a)是试料11和试料12中的发出叶绿素荧光的颗粒(即细胞)的密度、和不发出叶绿素荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上变化的图表，(b)是试料11和试料12的每份培养液中的淀粉量在时间上变化的图表，(C)是试料11和试料12中每单个细胞的换算淀粉量在时间上变化的图表；(b)及(c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。

图7的(a)是GSHl过剩表达株和母株(野生型株)中发出叶绿素荧光的颗粒的密度、和不发出叶绿素荧光的颗粒的密度在时间上变化的图表，(b)是每份培养液中的淀粉量在时间上变化的图表。图8是GSHl过剩表达株和母株(野生型株)的淀粉遇碘反应结果的图。图9是GSHl过剩表达株的增殖能力的调查结果图。图10表示的是进行各后代接续时的GSHl过剩表达株状态的调查结果，(a)是实施了图9所示“后代接续I”时的GSHl过剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b)是实施了图9所示“后代接续2”时的GSHl过剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(c)是实施了图9所示“后代接续3”时的GSHl过剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图。图11是GSHl过剩表达株释放到其细胞外的淀粉颗粒的形状的观察结果图，(a)是用扫描电子显微镜观察淀粉颗粒的结果图，(b)是GSHl过剩表达株释放到其细胞外的淀粉颗粒的遇碘反应结果图，(c)表示了培养基中添入的GSH合成酶抑制剂BSO的最终浓度达到8mM时的、GSHl过剩表达株的淀粉生产能力。图12表示GSHl过剩表达株的油脂产生能力的调查结果，(a)是母株(野生型株)中发出尼罗红(nile-red)所致荧光的细胞的直方图，(b)是GSHl过剩表达株中发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图，(C)是用共焦激光显微镜观察经尼罗红染色的母株(野生型株)的观察结果图，(d)是用共焦激光显微镜观察经尼罗红染色的GSHl过剩表达株的观察结果图。图13表示GSHl过剩表达株的状态调查结果，(a)是GSHl过剩表达株的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b)是GSHl过剩表达株的细胞大小与尼罗红所致荧光的强度之间的相关关系图，(c)是(b)的方框区域中的、细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(d)是母株(野生型株)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图。图14是气相色谱质量分析的结果图。图15表示GSHl过剩表达株(sta6.背景)和其母株(sta60的状态的调查结果，(a)是母株(sta6_)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图，(b)是GSHl过剩表达株(sta6_背景)的细胞大小与细胞内部复杂度之间的相关关系图。图16表示预培养后、以及培养基交换后第3天的GSHl过剩表达株(sta6_背景)和其母株(sta6_)的油脂生产能力的调查结果，(a)是预培养后的GSHl过剩表达株(sta6_背景)和其母株(sta6_)中发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图，(b)是培养基交换后第3天的GSHl过剩表达株(sta6_背景)和其母株(^&6_株)中发出尼罗红所致荧光的细胞的直方图。图17是实施例1中制备的GSHl过剩表达株的叶绿素量的调查结果图。图18表示从蓝藻性状转换体即E. c. gshA阳株及E. c. gshA阴株中提取出的色素类的吸收光谱的调查结果，(a)表示E. c. gshA阳株的吸收光谱，(b)表示E. c. gshA阴株的吸收光谱，(C)表示从E. c. gshA阳株的吸收光谱中减去E. c. gshA阴株的吸收光谱后的光谱图。图19的(a) 是试料9和试料10中发出叶绿素所致荧光的颗粒(即细胞)的密度、以及不发出叶绿素所致荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上的变化的图表，(b)是试料9和试料10的单份培养液中的淀粉量在时间上的变化的图表，(c)是试料9和试料10中每单个细胞的换算淀粉量在时间上的变化的图表。(b)及(c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。图20的(a)是试料11和试料12中发出叶绿素所致荧光的颗粒(即细胞)的密度、以及不发出叶绿素所致荧光的颗粒(即淀粉颗粒)的密度在时间上的变化的图表，(b)是试料11和试料12的单份培养液中的淀粉量在时间上的变化的图表，(C)是试料11和试料12中每单个细胞的换算淀粉量在时间上的变化的图表。(b)及(c)的凡例中的“TAP通常”、“TAP N-free”分别代表“含氮源的TAP培养基”、“不含氮源的TAP培养基”的意思。
具体实施例方式以下详细说明本发明的实施方式。但本发明并不限于以下的实施方式，也能实现在记述范围内添加了各种变形后的实施方式。另外，本说明书中记载的学术文献以及专利文献均是在本说明书中作为参考而引用的。此外，本说明书中除特别讲明的情况以外，“A B”这一数值范围表达方式均指“A以上且B以下”的意思。〔1.本发明的藻类〕本发明的藻类只要是叶绿体内的谷胱甘肽浓度得到了增加的藻类即可，其他结构并无限定。但本发明优选是光合作用产物的生产性得到了提高的藻类。在此，本发明中所谓的“叶绿体内的谷胱甘肽浓度得到了增加”是指与同种野生型藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度相比，叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加的意思。作为优选，在与经同等条件栽培的同种野生型藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度进行了比较后，若结果为叶绿体内谷胱甘肽浓度达到1.1倍以上，则判断为叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增力口。更优选的，若在t测定中获得了 5%级别的有意义差，则判断为叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。另外，优选以同一方法，同时地测定野生型藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度。但也可以使用至今所积累的背景数据。可以运用使roGFP2存在于叶绿体内的这一方法，来直接测定藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度(例如可参照以下文献MeyerAJ，et al. (2007)Plant Journal 52:973-986.Redox-sensitive GFP in Arabidopsis thaliana is a quantitative biosensor forthe redox potential of the cellular glutathione redox buffer ;以及，GutscherM, et al. (2008)Nat Methods 5 553-559. Real-time imaging of the intracellularglutathione redox potential·)。在此，roGFP2是一种以色调变化来反映氧化还原状态的分子探针(probe)。此外，还可以把与谷胱甘肽的生物合成体系相关的蛋白质的表达量、或编码该蛋白质的多核苷酸的表达量作为一种指标，当这些指标有所增加时，便可间接地测出谷胱甘肽浓度的增加。关于蛋白质以及多核苷酸的表达量的测定方法，可以利用现有公知的技术手法。上述“谷胱甘肽”包括还原型谷胱甘肽(以下简称“GSH”)以及氧化型谷胱甘肽(以下简称“GSSG”)。在本发明的方 法中，只要使GSH和GSSG的其中某一种谷胱甘肽浓度有所增加即可，但也可使GSH和GSSG这两方的浓度有所增加。另外，所谓“光合作用产物的生产性得到提高”，是指与同种野生型藻类的光合作用产物的生产性相比，光合作用产物的生产性有所提高的意思。作为优选，与经同等条件栽培的同种野生型藻类的光合作用产物的生产性进行了比较后，若结果是叶光合作用产物的生产性达到1.1倍以上，则判断为光合作用产物的生产性有所提高。更优选的，若在t测定中获得了 5%级别的有意义差，则判断为光合作用产物的生产性有所提高。关于生产性，例如可从以下等各种方面来进行评价光照条件(光量、强度、时间等)、投予的营养素、是否需要进行在每一单位时间内令其处于氮贫乏的步骤、培养温度。本说明书中，上述“光合作用产物(photosynthate) ”是指藻类通过光合作用下的碳固定而产生的物质。具体例如指糖类(例如淀粉)、油脂等这些生物量及其派生物(代谢产物等)。此处所谓的“光合作用下的碳固定”，是指利用源自光能的化学能来进行的各种碳化合物代谢。因此，进入代谢体系内的碳的来源不仅包括二氧化碳等无机化合物，还包括乙酸等有机化合物。本说明书中，上述“藻类”只要具有光合作用能力且能生成光合作用产物，则无特别限定。关于上述藻类，例如有归类于绿藻植物门绿藻纲的微藻。具体例如有属于绿藻纲衣藻属的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、m-衣藻(Chlamydomonas moewusii)、衣滴虫(Chlamydomonas eugametos)、s_ 衣藻(Chlamydomonas segnis)等；属于绿藻纲杜氏藻属的杜氏盐藻(Dunaliella salina)、t_ 杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)、p-杜氏藻(Dunaliella primolecta);属于绿藻纲小球藻属的小球藻(Chlorella vulgaris)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)等；属于绿藻纲红球藻属的雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)等；属于绿藻纲绿球藻属的绿球藻(Chlorococcum Iittorale)等；属于绿藻纲或黄绿藻纲葡萄属的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)等；属于绿藻纲绿囊藻(Choricystis)属的小绿囊藻(Choricystis minor)等；属于绿藻纲微细绿藻属的微细绿藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)等；属于娃藻纲双眉藻属的双眉藻(Amphorasp.)等；属于娃藻纲菱形藻属的菱形藻(Nitzschia alba)、新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)、菱形滑藻(Nitzschia laevis)等；属于润鞭毛藻纲隐甲藻属的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)等；属于裸藻纲眼虫属的眼虫(Euglena gracilis)、近轴眼虫(Euglena proxima)等；属于纤毛虫门草履虫属的绿草履虫(Paramecium bursaria)等；属于蓝藻门蓝菌属的蓝细菌(Synechococcus aquatilis)、细长聚球藻(Synechococcuselongatus)等；属于蓝藻门螺旋藻属的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)、盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)等；属于蓝藻门原绿球藻属的海洋原绿球藻(Prochlorococcusmarinus)等；属于蓝藻门卵囊藻属的多形卵胞藻(Oocystis poIymorpha)等。关于叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻类的获取方法，并无特别限定。其获取方法将在后文栏目“2.本发明的藻类的制造方法”中具体说明。在本发明的藻类的叶绿体中，优选从Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(以下也称“GSH1”)、谷胱甘肽合成酶(以下也称“GSH2”)、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的表达量及/或活性得到了增加。这些蛋白质是与叶绿体内的谷胱甘肽合成体系相关的酶，因此只要这些酶的表达量有所增加，便能掌握叶绿体内的谷胱甘肽浓度的增加。另外，本发明的藻类中也可以导入编码从GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的多核苷酸。对于导入有该外源性多核苷酸且有(过剩)表达的藻类，可以说其是叶绿体内谷胱甘肽浓度得到了增加的藻类。也可以说，本 发明提供一种性状转换藻类，该性状转换藻类中导入有编码从GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的多核苷酸，且该性状转换藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。当然，该性状转换藻类还是光合作用产物的生产性有所提高的藻类。另外，在本发明的藻类中，编码上述Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸可以选自由以下多核苷酸(a) (d)所组成的群族。多核苷酸(a)，其编码含有序列编号I所示氨基酸序列的多肽；多核苷酸(b)，其含有序列编号I所示氨基酸序列经过了 I个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽；多核苷酸(C)，其含有序列编号2所示的碱基序列；多核苷酸(d)，其具有在严格条件下和含有与上述多核苷酸(a) (C)中任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行了杂交的能力，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽。上述多核苷酸(a) (d)将在后文中详述。
对于本发明的藻类,可以通过现有公知的PCR法、萨瑟恩印迹杂交法(southernhybridization)、诺森印迹杂交法(northern hybridization)等来确认上述多核苷酸已被导入细胞内。另外，还能通过现有公知的免疫学手法，对上述多核苷酸编码的蛋白质的表达进行测定和确认。此外，还能通过现有公知的生化学手法，对上述多核苷酸编码的蛋白质所表现出的酶活性进行测定和确认。由于本发明的藻类的叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加，因此即使不在氮贫乏状态下，也能引发在藻类细胞内生产及/或积存光合作用产物。因此，若使用本发明的藻类，就无需换用不含氮的培养液来引发光合作用产物的积存。以下，通过与野生型藻类作对比，来说明本发明的作用效果。首先，在异养条件(在有乙酸等碳源的情况下)下使藻类处于氮贫乏状态，此时的野生型藻类在其增殖期会在细胞内积存稍许的光合作用产物，另外，在其稳定期虽然会积存光合作用产物，但其细胞外几乎检测不到光合作用产物。与此相比，本发明的藻类无论在其增殖期(对数增殖期)还是在其稳定期均生产/积存光合作用产物，且在其细胞外检测到了多量的光合作用产物。另外，在异养条件下使藻类处于非氮贫乏状态时，野生型藻类在其增殖期于细胞内仅积存极少的光合作用产物，而其稳定期的光合作用产物积存量会进而下降，且细胞外几乎检测不到光合作用产物。另一方面，本发明的藻类无论在其增殖期还是在其稳定期均生产/积存光合作用产物，且在其细胞外检测到了多量的光合作用产物。其次，在自养条件(依靠光合作用下的二氧化碳固定来进行增殖)下时，为了引发野生型藻类在氮贫乏状态下积存光合作用产物，其所需光量一般要高于异养条件下时的所需光量。与此相比，本发明的藻类无需特意增大光强度，便能连续产生光合作用产物。当然，照射的光越强，本发明的藻类的光合作用产物生产性也就越高。例如将衣藻用于本发明中，从衣藻的特性来看，照射越强的光则越利于光合作用产物的生产。但本发明的藻类的特点在于相比于野生型藻类，光量对光合作用产物积存的限制是极小的。此外，本发明的藻类具有能维持低密度栽培的特征。因此本发明的藻类的光利用率较高。所以与同种野生型藻类相比，在同等光量(亮度)下，本发明的藻类能生产/积存更多的光合作用产物。 通常，当细胞密度处在适当级别(例如细胞密度被维持得低于野生型藻类)时，从光利用效率的观点看，该细胞还是有用的。也就是说，随着细胞密度的上升，位于培养槽表面的细胞会导致“日阴效应”，而这会减弱到达培养槽深处的光，因此有光合作用产物的生产能力达到尽头的问题。而本发明的藻类，由于其培养密度可维持得低于野生型藻类，因此能避免上述的问题。再之，本发明的藻类能随着培养时间的增加而线性增加其淀粉颗粒的积存量。因此，通过补充水或添加培养基来维持上述培养状态，也就是通过连续培养，便能连续地生产光合作用产物(例如连续生产出淀粉的颗粒等)。相比于野生型藻类，本发明的藻类留有供增加培养密度的较大空间余地。通过人工操作(例如经过滤步骤等，来降低细胞分散介质(例如水)的含量)，能将本发明的藻类的培养密度提高到光合作用产物的饱和生产上限，由此能有效地生产光合作用产物。另外，本发明的藻类中休止细胞很少。因此，若用本发明的藻类来制造生物量，便有良好的收率，且能节约培养液。另外，由于废弃物较少，所以能降低废弃物的处理费(脱水、焚烧、地埋)，因此尤其利于批次培养。此外，废弃物少，就意味着有助于收率的增加。具体比如说葡萄酒的酿造，其发酵后废弃物中的固体几乎都是细胞，而本发明的藻类在释放淀粉颗粒的同时，其细胞破裂而自我分解，因此死细胞的分解物可成为其他细胞的养分，所以收率可得到提闻。此外，本发明的藻类能将其细胞内积存的光合作用产物排出到细胞外，因此能容易地收取光合作用产物。例如，当光合作用产物为淀粉时，能够在不挤碎藻类细胞的情况下，使经光合作用而积存的淀粉以颗粒的方式排出到细胞外。因此，若用本发明的藻类来制造生物量，便能相对容易地进行淀粉提纯。本发明的 藻类所生成的淀粉颗粒的特征在于很细小。用例如玉米、马铃薯、小麦等制成的一般淀粉颗粒的平均粒径为ΙΟμπι 50μπι。与此相比，本发明的藻类所生成的淀粉颗粒的尺寸均匀且细小，其平均粒径为长径1. 3 μ m(标准差为O. 181)，短径1. O μ m(标准差为O. 204)。稻子以及南美藜麦等虽然会生成平均粒径2 3 μ m的细小淀粉颗粒，但它们也与玉米、马铃薯、小麦等中生成的淀粉颗粒同样，是通过汇集而形成组织化胚乳的。因此，在将玉米、马铃薯、小麦、稻子、南美藜麦用作原料时，需要通过细磨等这些费成本的处理来将其制备成呈颗颗散开状态的细小淀粉颗粒。这些细小淀粉颗粒有助于医药品的制造。也就是说，若使用本发明的藻类，便能大量生产细小且尺寸均匀的淀粉颗粒，且由于淀粉颗粒被排出藻类细胞外，所以能相对容易地进行提纯。而且这些淀粉颗粒不用进行磨碎等处理，便已是颗颗散开的状态。如上所述，与玉米、马铃薯、小麦等所生成的一般淀粉颗粒相比，GSHl过剩表达株所生成的淀粉颗粒较细小。这些细小的淀粉颗粒对于医药品的制造是很有用的。具体为，由于该细小的淀粉颗粒小于肺的细支气管的内径，因此能期待将其用作将肺疾患治疗药输送到细支气管的载体(治疗药与淀粉细小颗粒组合而成的干粉吸入剂)。另外，通过在淀粉颗粒的表面上提呈肽性抗原，便能期待将其运用在所谓的“ 口服疫苗”中(例如在Dauville' e et al. 2010, PLos One 5卷12号，el5424中，以及在日本特表2003-500060号公报(日本专利申请特愿2000-620111号)中揭示了在衣藻产生的淀粉颗粒的表面上提呈疟疾抗原的技术。)。谷胱甘肽是用来调节细胞内的氧化还原状态的物质，已知其能作为细胞或器官的分化调节剂而发挥功能(参照国际公开第01/080638号册子)，还知其能作为植物生长调整助剂而发挥功能(参照日本国专利申请公开公报“特开2004-352679号公报”)。然而仅凭谷胱甘肽的上述现有公知功能，并不能预测到本发明的以下效果等在增加了藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度的情况下，即便不使藻类处于氮贫乏状态，也能引发藻类在其细胞内积存光合作用产物，且能使藻类细胞内积存的光合作用产物排出到细胞外。相比于现有技术，通过使用本发明的藻类，便不仅能简单且高效地引发光合作用产物的积存，还能简单且高效地收取光合作用产物。因此，通过将本发明的藻类用在后述的生物量制造方法中，便能比现有技术廉价且高效地用藻类来制造生物量。(2.本发明的藻类的制造方法〕本发明的藻类制造方法(以下称“本发明的藻类的制造方法”)用以制造叶绿体内谷胱甘肽浓度、及光合作用产物生产性相比于野生型藻类有所提高的上述藻类(本发明的藻类)。本方法至少包含使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的谷胱甘肽浓度增加步骤即可。其他条件、步骤等的技术方案并无特别限定。以下具体说明本发明的藻类的制造方法。(1.谷胱甘肽浓度增加步骤)谷胱甘肽浓度增加步骤，是使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的步骤。在此，上述“使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加”是指相比于同种野生型藻类，叶绿体内的谷胱甘体浓度有所增加的意思。换而言之，经谷胱甘肽浓度增加步骤后的藻类相比于同种的野生型藻类，具有高谷胱甘肽浓度。可根据〔1.本发明的藻类〕栏目中叙述的方法，来判断得知藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度相比于同种野生型藻类株有所增加。只要谷胱甘肽浓度增加步骤的结果是使叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加，则不对谷胱甘肽浓度增加步骤中的、使藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度增加的方法加以特别限定。例如能通过以下方法等来获得上述结果方法(i)，运用公知的变异诱发法，诱发目标藻类的随机变异；方法(ii)，向细胞内导入(视情况不同，也会向藻类的基因组内导入)使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质。以下具体说明上述方法(i)和方法(ii)。(i)诱发藻类的随机变异的方法诱发藻类的随机变异的方法并无特别限定，可适当地选择运用公知的方法。具体例如有以下的方法等用化学物质(例如EMS、NTG等)对藻类进行处理；利用放射线来诱发变异；利用转位子来诱发变异；利用T-DNA来诱发变异；利用原核细胞与真核细胞的结合来诱发变异；物理性地用基因枪来诱发变异。例如，对于GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、丝氨酸乙酰转移酶等这些与叶绿体内的谷胱甘肽合成 体系相关的蛋白质，可以通过上述的方法来诱发编码这些蛋白质的多核苷酸发生变异，以提高这些蛋白质的表达量及/或活性，其结果是绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加，然后收取叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加的藻类即可。关于发生了期望变异的藻类的筛选方法，可利用公知手法，其并无特别限定。例如有以下的方法等通过可直接测定上述叶绿体内谷胱甘肽浓度的方法，来收取谷胱甘肽浓度有所增加的变异藻类；GSH1、GSH2、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、丝氨酸乙酰转移酶等这些蛋白质的表达量及/或活性得以了增加的变异藻类的取得方法。(ii)向细胞内导入使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质的方法作为上述“使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质”，例如可以采用编码用以使藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度增加的蛋白质的多核苷酸(A);针对导致藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度下降的蛋白质，而具有降低该蛋白质表达量的功能的多核苷酸(B)。通过导入该多核苷酸(A)、多核苷酸(B)，便能获取叶绿体内谷胱甘肽浓度得到了增加的藻类。上述多核苷酸㈧或⑶可单独使用，也可以并用。本说明中所用的术语“多肽”，能和“肽”或“蛋白质”换用。另外，本说明书中所用的术语“多核苷酸”，能和“基因”、“核酸”或“核酸分子”换用，其意思是指核苷酸的聚合物。所谓“导入多核苷酸”，只要作为导入对象的多核苷酸存在于藻类细胞内即可。另夕卜，所谓“导入多核苷酸”，也包括以下情况作为导入对象的多核苷酸被插入(导入)在藻类基因组中。可以通过现有公知的PCR法、萨瑟恩印迹杂交法、诺森印迹杂交法等来确认多核苷酸已导入在藻类细胞内。通过在藻类细胞内导入上述多核苷酸㈧的至少I种，便能使用以增加叶绿体内谷胱甘肽浓度的蛋白质的表达量得到增加，其结果是能使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加。作为此类多核苷酸，可优选例如编码Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸(以下有时也称“GSH1基因”)、编码谷胱甘肽合成酶的多核苷酸(以下有时也称“GSH2基因”)、编码ATP硫酸化酶的多核苷酸、编码腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶的多核苷酸、编码亚硫酸还原酶的多核苷酸、编码半胱氨酸合成酶的多核苷酸、编码丝氨酸乙酰转移酶的多核苷酸等。这些多核苷酸优选是来源于植物的多核苷酸，更优选是宿主藻类自己所拥有的多核苷酸。但也能较好地采用来源于宿主藻类以外的藻类的多核苷酸、或来源于其他高等植物的多核苷酸。上述-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHl) ”是指使谷氨酸在Y位上与半胱氨酸发生酰胺缩合，以合成Y-谷氨酰半胱氨酸的酶。另外，上述“谷胱甘肽合成酶(GSH2)”是指使甘氨酸附加到Y -谷氨酰半胱氨酸上，以合成谷胱甘肽的酶。上述“GSH1基因”并无特别的具体限定例。作为本发明中优选的GSHl基因的一种，例如有本发明的发明人在实施例中使用的衣藻的GSHl基因(CHLREDRAFT_181975)。该衣藻的GSHl包含序列编号I所示的氨基酸序列，编码该GSHl的基因(全长cDNA)包含序列编号3所示的碱基序列。在序列编号3所示的碱基序列中，第134位 第136位为起始密码子，第1571位 1573位为终止密码子。即，衣藻GSHl基因拥有占据序列编号3所示碱基序列中第134位 第1573位的开放阅读框(ORF)。序列编号2所示的碱基序列是衣藻GSHl基因中的ORF的碱基序列。衣藻GSHl基因的翻译产物在其N末端区域具有叶绿体跨膜转移信号肽。因此，衣藻GSHl基因的翻译产物，也就是衣藻的GSH1，一般存在于叶绿体中。 在本发明中，被导入藻类的核苷酸优选例如是以下的多核苷酸(a) (d)。多核苷酸(a)，其编码含有序列编号I所示氨基酸序列的多肽；多核苷酸(b)，其含有序列编号I所示氨基酸序列经过了 I个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽；多核苷酸(C)，其含有序列编号2所示的碱基序列；多核苷酸(d)，其具有在严格条件下和含有与上述多核苷酸(a) (C)中任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交的能力，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽。序列编号2表示的是一例编码含有序列编号I所示氨基酸序列的多肽的碱基序列。在此，上述“经过了 I个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加后”是指局部特异性突变诱发法等这些公知的变异肽制备法所可能实现的缺失数量、取代数量或附加数量(该数量优选是10个以下，更优选是7个以下，尤其优选是5个以下)的氨基酸发生缺失、取代或附加的意思。此类变异蛋白质并不限于是经公知的变异肽制备法而人工引发有变异的蛋白质，也可以是天然的蛋白质经分离纯化后的产物。蛋白质的氨基酸序列中的一部分氨基酸，能在实质不影响该蛋白质的构造或功能的情况下容易地进行改变。这在本领域中是周知的。此外，不光是经人工改变的蛋白质变异体，天然蛋白质中也存在不会实质改变该蛋白质的构造或功能的变异体。这在本领域中也是周知的。所优选的变异体是，经过了保留性或非保留性的氨基酸取代、氨基酸缺失、或氨基酸添加后的产物。优选经过了同义取代、添加、以及缺失，尤其优选经过了保留性的取代。这些变异体不会改变本发明的多肽的活性。具代表性的保留性取代，例如有以下情形脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu、以及lie这些中的某I类氨基酸被其他氨基酸取代；羟基残基Ser与Thr互换；酸性残基Asp与Glu互换；在酰胺残基Asn与Gln间的区间进行取代；碱性残基Lys与Arg互换；在芳香族残基Phe与Tyr间的区间进行取代。本说明书，上述“严格条件”是指，仅在序列间具有至少90%的一致度时，优选仅在具有至少95 %的一致度时，更优选仅在具有至少97%的一致度时，才发生杂交。具体例如是指以下条件以42°C，在杂交溶液(含50%甲酰胺、5 X SSC(150mM的Nacl、15mM的柠檬酸三钠)、50mM的磷酸钠(pH7. 6)、5X邓哈特溶液、10%硫酸葡萄糖、以及20 μ g/mL的剪断改性的鲑鱼精子DNA)中培养(incubation) —晚后，在O.1 X SSC中以65°C来清洗滤膜。关于杂交，可以运用Sambrook等人的Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory (2001)中记载的周知方法来进行。一般而言，温度越高或盐浓度越低，严格度就越高(杂交越困难)，但能获得相同性较高的多核苷酸。关于氨基酸序列以及碱基序列的一致度，可利用Karl in和Altschul提出的BLAST算法(Karlin S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 87 =2264-2268 (1990) ；Karlin S,Altschul SF，Proc. Natl. Acad Sc1. USA，90 :5873_5877 (1993))来决定。针对 BLAST 算法，目前已开发出了称为 BLASTN、BLASTX 的运算程序(Altschul SF, et al. ,J. Mol. Biol. ,215 403(1990))ο在本发明中 ，上述“ Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性”是指，帮助谷氨酸在Y位上与半胱氨酸发生酰胺缩合反应的催化活性。“ Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性”例如可根据以下方法来确定对溶液实施氮取代等来防止氧化，然后对挤碎了的藻类进行离心分离而获得上清质，将该上清质作为试料而对其添加含有半胱氨酸、谷氨酸以及ATP的反应液，然后求取在给定时间内合成出的“ Y-谷氨酰半胱氨酸”的量。另外，也可以对该合成反应中附随生成的磷酸进行定量，由此换算出“ Y -谷氨酰半胱氨酸”的量。关于来自衣藻以外的植物的GSHl基因，已知的例如有阿拉伯芥(TAIRAccession Gene :2127172、Name AT4G23100.1)、百日草(Genbank accession :AB158510)、稻子(Genbank accession :AJ508915)、烟草(Genbank accession DQ444219)等的 GSHl 基因。这些GSHl基因也能较好用在本发明中。另外这些基因的翻译产物也与衣藻同样，在N末端区域具有叶绿体跨膜转移信号肽。另外，通过将上述多核苷酸(B)导入藻类细胞内，便能降低导致叶绿体内谷胱甘肽浓度下降的蛋白质的表达量。其结果是能使叶绿体内的谷胱甘肽浓度得到增加。关于此类多核苷酸，例如有用在现有公知的RNA干扰(RNA interference ；RNAi)法中的双链RNA(dsRNA)、siRNA(short interfering RNA)、这些 RNA 的模板 DNA 等。关于上述“导致藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度下降的蛋白质”，例如可例举CLTl等。上述“CLT1”是将谷胱甘肽从叶绿体输送到细胞质的运载体，其最初发现于阿拉伯芥中，因而得名为 CLTl (参照 Proc Natl Acad Sci USA (2010)第 107 期(5)的 2331 2336页)。也就是说，作为上述多核苷酸(B)的一例，例如有能使CTLl等谷胱甘肽运载体的表达量减少的多核苷酸。本发明的藻类的制造方法中所用的“多核苷酸”可以来源于基因组DNA，也可以来源于cDNA，也可以是化学合成出的DNA，还可以是RNA。其可以视目的而适当选择。关于本发明的藻类的制造方法中所用的多核苷酸的获取方法，例如若要获取GSHl基因，则可用公知技术对编码GSHl的DNA片段进行分离，然后进行克隆。还可以制备出用以与编码衣藻GSHl的DNA的部分碱基序列进行特异杂交的探针，然后用该探针来筛选基因组DNA文库以及cDNA文库。另外，作为本发明的藻类的制造方法中所用的多核苷酸的获取方法，例如有利用PCR等扩增手法来获取该多核苷酸的方法。例如，若要获取GSHl基因，则可以先针对编码衣藻GSHl的cDNA，根据其5'侧序列和3'侧序列(或这些序列的互补序列)来分别制备引物，然后以基因组DNA (或cDNA)为模板，用这些引物来进行PCR等，以扩增夹在两引物间的DNA区域。这样，便能大量获取编码本发明中所用GSHl的DNA片段(GSH1基因)。至于GSH2基因、ATP硫酸化酶基因、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶基因、亚硫酸还原酶基因、半胱氨酸合成酶基因、丝氨酸乙酰转移酶基因以及CLTl基因，也能用同样的方法来获取。本发明中，能以所期望的藻类为提供源，来获取本藻类制造方法中所用的多核苷酸。在本发明的藻类的制造方法中，将多核苷酸导入藻类的方法并无特别限定。例如，可以导入具有该多核苷酸的表达载体，由此将该多核苷酸导入藻类细胞内。另外，关于表达载体的制作方法，可以运用现有公知的方法，其并无特别限定。例如可以依照日本国专利申请公开公报“特开2007-43926 号公报”以及日本国专利申请公开公报“特开平10-0570868号公报”中揭示的表达载体制造法和藻类性状转换法，在被导入体即多核苷酸的上游区，连接针对藻类细胞发挥功能的启动子，且在该多核苷酸的下游区，连接针对藻类细胞发挥功能中止子，由此制出重组表达载体，然后将该重组表达载体导入藻类。作为上述“启动子”，例如可较好地采用PsaD启动子。相比于GSHl基因的内源性启动子，PsaD启动子的启动活性更强。因此，通过使用PsaD启动子，便能使Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶更强地表达。另外，由于PsaD基因是与光合作用相关的基因，因此若使用PsaD启动子来获得表达载体并将该表达载体导入藻类细胞内，便能通过光照强度来对被导入体，即基因的表达量加以调整。(2.其他步骤)本发明的藻类的制造方法中，不仅包含上述“谷胱甘肽浓度增加步骤”，还可以包含对叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻类进行筛选的筛选步骤。例如，能以卡那霉素抗性及潮霉素抗性等这些药剂抗性标志物的表达为指标，通过现有公知的药剂选择法，来选出导入有目标基因的性状转换藻类；然后，通过PCR法、萨瑟恩印迹杂交法、诺森印迹杂交法等来确认目标基因是否已导入藻类。例如，可以从性状转换藻类中提取出DNA，然后针对此导入的DNA来设计特异性引物，并进行PCR，之后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或毛细管电泳等，并用溴化乙锭等来染色，最后对目标扩增产物进行检测。如此便能得知藻类已发生了性状转换。
至于叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻细胞个体，可以通过叶绿体内谷胱甘肽浓度的上述测定方法等来将其筛选出。叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加后，其结果是光合作用产物的生产性得到提高。因此能容易地理解到叶绿体内谷胱甘肽浓度有所增加的藻类，就是光合作用产物的生产性得以提高了的藻类。至于筛选出的藻细胞个体的光合作用产物的生产性是否有所提高，可以通过光合作用产物生产性的前述测定方法来进行确认。〔3.本发明的生物量的制造方法〕本发明的生物量的制造方法(以下称“本发明的生物量制造方法”)是用叶绿体内谷胱甘肽浓度比野生型藻类有所增加的藻类(本发明的藻类)、或经本发明的藻类制造方法而制得的藻类，来制造生物量的方法。关于本发明的藻类，已在“1.本发明的藻类”栏目中作了说明。另外，关于本发明的藻类的制造方法，已在“2.本发明的藻类的制造方法”栏目中作了说明。因此在此省略它们的说明。本说明书中，上述“生物量”是指，藻类经光合作用下的碳固定而产生的物质。例如指糖类(如淀粉)、油脂等。其也可以换说成“光合作用产物”。在本发明的生物量制造方法中，引发在藻类细胞内生产或积存光合作用产物的方法并无特别限定。例如，本发明的生物量制造方法中可以包含通过向藻类照射光来引发在藻类细胞内生产或积存光合作用产物的光照射步骤。在现有方法中，为了引发藻类在其细胞内积存光合作用产物，不仅需要使细胞处于氮贫乏条件，而且为了促进光合作用产物的显著积存，还需要照射200 μ E/m2/秒以上光量的光。然而在本发明的生物量制造方法中，无需特意调节光量，便能引发光合作用产物的积存。但优选对藻类 照射1000 μ E/m2/秒以下光量的光，更优选照射500 μ E/m2/秒以下光量的光，进而逐次优选照射400 μ E/m2/秒以下、300 μ E/m2/秒以下、200 μ E/m2/秒以下、150 μ E/m2/秒以下、100 μ E/m2/秒以下、80 μ E/m2/秒以下光量的光。照射的光量越低，能量利用效率就越高，生产性也越高。相比于现有的野生型藻类，本发明的藻类的优点是，在低光量下就能在其细胞内及细胞外产生光合作用产物。照射的光量并无特别的下限，但从现实性观点看，例如可以将光量设定在40 μ E/m2/秒以上。并非需要特别的光照装置来照射落入上述光量范围内的光。例如可以利用阳光；经反射镜、光纤、滤光器、光栅等而被调节了性质或物理量的阳光；白灼灯、荧光灯、水银灯、发光二极管等的人造光。另外，所照射的光可以是适于一般藻类进行光合作用的波长域下的光，例如优选波长400nm 700nm的光。另外，本发明的生物量制造方法中，无需在氮贫乏条件下培养藻类来引发在藻类细胞内生成或积存光合作用产物。因此，上述光照射步骤可以在非氮贫乏条件下进行。在此，上述“非氮贫乏条件”是指在含有藻类生育上所需的量的无机态氮的培养液中，进行培养。在此，藻类生育上所需的量是指以氮原子来换算时，培养液中的无机态氮占O. 001重量％ O.1重量％,优选占O. 005重量％ O. 05重量％。上述“无机态氮”是指,例如以氨的形态存在的氮、以亚硝酸的形态存在的氮、以硝酸的形态存在的氮等。另外，在后述实施例所用的TAP培养基中，培养液内所含的无机态氮以氮原子来换算时，其约占O. 01重量％。关于含有藻类生育上所需的量的无机态氮的培养液，可以采用供培养藻类的一般培养液，其并无特别限定。作为此类培养液，例如有以往所周知的TAP培养基、HSM培养基、ATCC897培养基等。在本发明的一实施方式中，通过一边照射45 μ E/m2/秒的光，一边用TAP培养基来培养本发明的藻类，便能引发在细胞内积存淀粉。而在另一实施方式中，通过一边照射80 μ E/m2/秒的光，一边用TAP培养基来培养本发明的藻类，便能引发在细胞内积存淀粉。上述光照射步骤也可以在氮贫乏条件下进行。上述“氮贫乏条件”是指在无机态氮的氮原子换算含量为O. 001重量％以下的培养液中，进行培养。当在氮贫乏条件下进行光照射步骤时，例如可以较好地将TAP N-free培养基用作不含氮的培养液。但培养基并无特别限定。在本发明的一实施方式中，通过一边照射80 μ E/m2/秒的光，一边在氮贫乏条件(用TAP N-free培养基)下培养本发明的藻类，能引发在细胞内积存淀粉。如上所述，本发明的藻类的特征例如在于在使藻类产生光合作用产物时，无需实施氮贫乏状态等这类营养限制步骤。也就是说，在本发明的生物量制造方法中，实质上能够不进行氮贫乏状态等这类营养限制步骤(实质上不包含氮贫乏状态等这类营养限制步骤)。由于本发明的藻类具有该特征，因此能简化步骤，提高光合作用产物的生产性。另外，光照射步骤也可以在自养条件下进行。在此，上述“自养条件”是指除二氧化碳以外，不提供其他碳源来进行培养。具体例如可以一边提供空气，一边照射光来在HSM培养液中培养本发明的藻类，也就是可以在自养条件下进行光照射步骤。二氧化碳的提供源并不限于是空气，也可以利用火力发电厂、炼钢厂等烟道中的二氧化碳。通过向培养基送入浓度高于空气内二氧化碳的二氧化碳，便能提高生产性。在自养`条件下，可以从培养容器的底部附近送入(通入)二氧化碳或含二氧化碳的气体。相比于空气而言，二氧化碳在水中的扩散速度极慢，因此需要搅拌培养基。而通过搅拌培养基，还能使藻类均匀地得到光照。二氧化氮在水中时为阴离子，因此培养基的缓冲能力若较低，那么培养基会因二氧化碳气体的导入而偏向酸性侧，于是二氧化碳的溶解度会下降，而导致难以进行光合作用。所以，培养基优选具有能将自身PH值维持在中性附近或碱性侧的缓冲能力。关于此类培养基，较好的例如有以往公知的HSM培养基等。(2.其他步骤)在本发明的生物量制造方法中，除上述“光照射步骤”以外，还可以包含收取光合作用产物的步骤。例如，若光合作用产物是淀粉，那么通过本发明的生物量制造方法，能使细胞内积存的淀粉以淀粉颗粒的方式排出到细胞外，而且通过收取光合作用产物的步骤，能将排出在细胞外的淀粉颗粒与藻类分离，之后收取分离出的淀粉颗粒即可。关于将排出在细胞外的淀粉颗粒与藻类分离的方法，并无特别限定。例如可以根据淀粉颗粒和藻类细胞的粒径及/或形状等这些物理性质，运用静置自然沉淀、离心分离、过筛等分离手法来实现分离。在本发明的生物量制造方法中，可以使用叶绿体内的谷胱甘肽浓度得以增加了的藻类。至于谷胱甘肽浓度，可以使用能以接触藻类的方式使藻类吸收的物质来增加谷胱甘肽浓度。也就是说，包含以下步骤的生物量制造方法也属于本发明的范围，该步骤为在用以增加藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度的物质的存在下，培养藻类的步骤。作为能以接触藻类的方式使藻类吸收且使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质，具体例如有谷胱甘肽、谷胱甘肽结合体、活性氧(例如过氧化氢等)、活性氮、聚胺、氧化钛、茉莉酮酸、水杨酸、半胱氨酸、胱氨酸、重金属鎘、铁离子。在此，聚胺可以成为过氧化氢的原料。氧化钛可通过光而产生活性氧。半胱氨酸和胱氨酸是谷胱甘肽的前驱物。重金属鎘、铁离子优选过剩投予。考虑到成本，尤其优选采用过氧化氢。关于能以接触藻类的方式使藻类吸收且使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的物质，例如可以使藻类进行光合作用时所用的培养液含有该物质，由此便能使藻类接触并吸收该物质。在本发明的生物量制造方法中，由于是使用本发明的藻类或经本发明的藻类制造方法而制得的藻类来制造生物量，因此如后述实施例那样，即使在不照射强光、不调整成氮贫乏状态的条件下培养藻类，也能引发在藻类细胞内积存光合作用产物。另外，通过使叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加，便使藻类将其细胞将内积存的光合作用产物排出到细胞外，因此能容易地收取光合作用产物。也就是说，相比于现有技术，通过本发明的生物量制造方法，能够容易且有效地引发光合作用产物的积存并收取光合作用产物。因此，通过本发明的生物量制造方法，能比现有技术更廉价、高效地用藻类来制造生物量。在本发明的藻类的叶绿体中，从Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的表达量及/或活性也可以有所增加。本发明的藻类中可以导入有编码从上述Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的外源性多核苷酸。在本发明的藻类中，编码上述Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸可以选自由以下多核苷酸(a) (d)所组成的群族多核苷酸(a)，其编码含序列编号I所示氨基酸序列的多肽；

多核苷酸(b)，其含有序列编号I所示氨基酸序列经过了 I个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽；多核苷酸(C)，其含序列编号2所示的碱基序列；多核苷酸(d)，其具有在严格条件下和含有与上述多核苷酸(a) (C)中任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行杂交的能力，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽。在本发明的藻类制造方法中，上述谷胱甘肽浓度增加步骤可以是如下步骤将编码从Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中选择的至少一类蛋白质的外源性多核苷酸，导入藻类。本发明的生物量制造方法还可以包含向上述藻类照射光的光照射步骤。在本发明的生物量制造方法中，上述光照射步骤可以在实质上的非氮贫乏条件下进行。本发明并不限于上述各实施方式，可以根据权利要求所示的范围进行各种变更，适当地组合不同实施方式中记述的技术方案而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。[实施例]
以下具体说明本发明的实施例，但本发明并不限于这些实施例。〔实施例1〕〈GSH1过剩表达株的制备〉将编码来源于衣藻的Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(序列编号I所示)的GSHl基因(序列编号2所示)，连接至PsaD基因的启动子(PsaD启动子)的下游区，由此制备了质粒。具体为，同时使用限制性内切酶EcoR I及EcoR V来进行处理，以使衣藻用载体即环状 DNA pSP124S(参照了 Plant Journal (1998) Vol. 14(4) :441 447 页)开环，然后连接上序列编号4所示的多核苷酸(约3130对碱基)，并使之再次成环。通过公知的方法，利用大肠杆菌来扩增该环状DNA，然后从大肠杆菌中提取、纯化了该环状DNA。序列编号4所示的多核苷酸是通过以下方法制得的。(I):用TAP培养基，在24°C、50yE/m2/秒的光照条件下，培养莱茵衣藻CC503株(美国DuKe大学衣藻中心出让的衣藻)4天。以从该培养物中收集的细胞为原料，用cDNA合成试剂盒(日本TAKARA BIO株式会社制造的“Solid phase cDNA synthesis kit”)而调配出了 cDNA混合物。以该cDNA混合物为模板，使用序列编号5及6所示的寡核苷酸，通过公知的方法进行了 PCR反应(退火温度为58°C )，由此收得了作为衣藻GSHl基因的多核苷酸，该多核苷酸包含开放阅读框(ORF)、以及占据了连在该开放阅读框后的3' UTR区域的、约2270个连续碱基对。进而，用限制性内切酶EcoR I对该多核苷酸的末端构造进行了加工。(2):与上述(I)同样地进行了培养，并以收集的CC503的细胞为原料，用DNA提取试剂盒(日本GENE株式会社制造的“Isoplant”)而调配出了基因组DNA。以该基因组DNA为模板，使用序列编号7以及8`所示的寡核苷酸，通过公知的方法进行了 PCR反应(退火温度为56°C )，由此收取了作为衣藻PsaD基因中启动子区域的、约含860个碱基对的多核苷酸。此外，还用限制性内切酶Hpa I对该多核苷酸的末端构造进行了加工。(3):使用DNA连接酶(日本东洋纺株式会社制造的“Ligation High”)，用公知方法来连接了上述方法(I)和(2)中制备的两种多核苷酸。通过以上的实验操作，制备出了PsaD启动子-GSHl基因的多核苷酸片段。该PsaD启动子-GSHl基因的多核苷酸片段的一端为平滑末端(blunt end),另一端为由EcoR I剪断出的粘性末端(sticky end)。序列编号4所示的碱基序列中，第853位 第855位为起始密码子，第2294位 第2296位为终止密码子。也就是说，衣藻GSHl基因拥有占据序列编号3所示碱基序列第853位 第2296位的开放阅读框(ORF)。· 5，GCTCTCGCCTCAGGCGTT 3，(序列编号 5)· 5’ GGGGAATTCCTGAGCGAGGGCCTTACAAG 3’(序列编号 6)· 5’ ATCAGCACACACAGCAGGCTCAC 3’ (序列编号 7).ytgttaaccattttggcttgttgtgagtagc3'(序列编号 8)用限制性内切酶EcoR I，将含有上述所制备的PsaD启动子-GSHl基因的多核苷酸的质体断开成线状，然后通过电穿孔法(参照Funct. Plant Biol. (2002), Vol29 231 241页),将该线状的质体导入了莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC503株(以下简称“衣藻”)。以CC503株是否获得了博莱霉素抗性为指标而选拔出了 经细胞复制后，子代的基因组DNA内插有该多核苷酸，且稳定继承了该多核苷酸的性状转换株(以下称“GSH1过剩表达株”)。通过PCR法，确认到含该多核苷酸的质体DNA已插入在基因组DNA中。PsaD基因是与光合作用相关的基因。因此，通过改变光照强度来调节PsaD启动子的活性，便能调节GSHl基因的表达量。也就是说，若对GSHl过剩表达株照射强光，GSHl过剩表达株中的外源性GSHl的表达量就增加，若照射弱光，GSHl过剩表达株中的外源性GSHl的表达量就减少。〔实施例2〕使用pH7 的三-乙酸-磷酸(TAP)培养基(参照 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 54,1665 1669页)，在半异养条件下培养了实施例1中制备的GSHl过剩表达株，然后评价了其增殖能力及淀粉产生能力。作为对照(control)，使用了野生型衣藻株、即CC503株(以下称“母株(野生型株)”)。各试料的培养条件示于表I及表2中。[表I]

权利要求
1.一种藻类，其特征在于叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。
2.根据权利要求1所述的藻类，其特征在于 在叶绿体中，选自由γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中的至少一类蛋白质的表达量及/或活性有所增加。
3.根据权利要求2所述的藻类，其特征在于导入有 编码选自由所述γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中的至少一类蛋白质的外源性多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的藻类，其特征在于 编码所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的多核苷酸选自由以下多核苷酸(a) (d)所组成的群族 多核苷酸(a)，其编码含有序列编号I所示氨基酸序列的多肽； 多核苷酸(b)，其含有序列编号I所示氨基酸序列经过了 I个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加后的氨基酸序列，且编码具有Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽； 多核苷酸(c)，其含有序列编号2所示的碱基序列； 多核苷酸(d),其具有在严格条件下和含有与所述多核苷酸(a) (C)中任意方互补的碱基序列的多核苷酸进行了杂交的能力，且编码具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的多肽。
5.一种藻类的制造方法，用以制造权利要求1 4中任一项所述的藻类， 该藻类的制造方法的特征在于包含 使藻类叶绿体内的谷胱甘肽浓度增加的谷胱甘肽浓度增加步骤。
6.根据权利要求5所述的藻类的制造方法，其特征在于 所述谷胱甘肽浓度增加步骤为 把编码选自由Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶、ATP硫酸化酶、腺苷5'-磷酸硫酸酯还原酶、亚硫酸还原酶、半胱氨酸合成酶、以及丝氨酸乙酰转移酶所组成的群族中的至少一类蛋白质的外源性多核苷酸，导入藻类的步骤。
7.一种生物量制造方法，其特征在于 使用权利要求1 4中任一项所述的藻类、或经权利要求5或6所述的藻类制造方法而制得的藻类。
8.根据权利要求7所述的生物量制造方法，其特征在于 包含向所述藻类照射光的光照射步骤。
9.根据权利要求8所述的生物量制造方法，其特征在于 实质上是在非氮贫乏条件下进行所述光照射步骤。
10.一种生物量制造方法，其特征在于包含 在用来增加藻类叶绿体内谷胱甘肽浓度的物质的存在下，培养该藻类的步骤。
全文摘要
本发明提供一种光合作用产物的生产性得以提高了的藻类、及其利用。在本发明的藻类中，叶绿体内的谷胱甘肽浓度有所增加。另外，本发明的生物量制造方法使用本发明的藻类、或经本发明的藻类制造方法而制得的藻类，来制造生物量。
文档编号C12N15/09GK103068966SQ20118004023
公开日2013年4月24日 申请日期2011年8月29日 优先权日2010年8月31日
发明者小川健一, 西川正信 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构