具有前导序列功能的多核苷酸的制作方法

文档序号:601589阅读:440来源:国知局

专利名称::具有前导序列功能的多核苷酸的制作方法
技术领域
:本发明涉及具有前导序列功能的多核苷酸。具体而言,本发明涉及在真菌宿主细胞中具有前导序列功能的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞,以及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。
背景技术
:在真菌宿主细胞,特别是丝状真菌宿主细胞如曲霉属(Aspergillus)细胞中异源蛋白的重组产生,可对于以商业上重要的量产生所述蛋白提供更理想的媒介。异源蛋白的重组产生一般通过下述实现构建表达盒,其中编码所述蛋白的DNA置于启动子的表达调控下,所述启动子是从受调节的基因切出的,且适于宿主细胞。将所述表达盒导入宿主细胞。然后,通过在表达盒上所包含的启动子的正常功能所需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现异源蛋白的产生。蛋白的重组表达的改善一般需要新的调节序列的可用性,所述调节序列适于在宿主细胞中调控所述蛋白的表达。所述调节序列可为合适的前导序列,其为对于宿主细胞翻译重要的mRNA的未翻译区。前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。用于丝状真菌宿主细胞的公知的前导序列之前已从例如对于米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)丙糖憐酸异构酶的基因获得。本发明的一个目的是提供用于在真菌宿主细胞中使用的新前导序列,并进一步提供用于在真菌宿主细胞中使用所述新前导序列产生多肽的改善的方法。
发明内容在第一个方面,本发明涉及具有前导序列功能的分离的多核苷酸,其选自下组(a)多核苷酸,其包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1或2具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,且最优选至少95%序列同一性;(b)多核苷酸,其在优选至少中等-高严格条件,最优选至少高严格条件,且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQIDNO:1或2的多核苷酸杂交;(C)SEQIDNO:1或2的包含一个或多个(几个)核苷酸的取代、缺失和/或插入的变体。本发明进一步涉及包含本发明的第一个方面的分离的多核苷酸的核酸构建体如表达载体和质粒,以及宿主细胞。最后,本发明涉及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。定义序列同一性参数“序列同一性”描述两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言,两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2000,TrendsinGeneticsl6:276-277),优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gapopenpenalty)10,缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一'I"生(longestidentity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一'生,并计算如下(同样的残基X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)就本发明而言,两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,2OOO,见上文),优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性,并计算如下(同样的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度一比对中缺口的总数)亚序列术语“亚序列(subsequence)”在本文中定义为从SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列;其中所述亚序列编码具有作为前导序列发挥功能的能力。在一个优选的方面,亚序列含有SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列或其同源序列的至少10个核苷酸,更优选至少25个核苷酸,和甚至更优选至少50个核苷酸,且最优选75个核苷酸。等位变体(allelicvariant):术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或更多种可选形式。等位变异通过突变天然地发生,并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(多核苷酸的功能无变化)或其可导致改变的多核苷酸的功能。具有前导序列功能的多核苷酸的等位变体是来源于基因的等位变体、具有前导序列功能的多核苷酸。分离的多核苷酸术语“分离的多核苷酸”在本文中指从来源分离的多核苷酸。在一个方面,所述变体如通过琼脂糖凝胶电泳测定的,为至少1%纯,优选至少5%纯,更优选至少10%纯,更优选至少20%纯,更优选至少40%纯,更优选至少60%纯,更优选至少80%纯,且最优选至少90%纯。核酸构建体如用于本文中术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子,其分离自天然存在的基因,或受修饰以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式含有核酸的区段,或是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(controlsequence):在本文中术语“调控序列”定义为包括在本发明的方法中对多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于多核苷酸序列可以是天然的或异源的,或各个调控序列对于彼此可以是天然的或异源的。这些调控序列包括但不限于聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况,调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供,所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。启动子术语“启动子”在本文中定义为由宿主细胞识别用于表达可操作连接于所述启动子的的多核苷酸序列的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导所述多核苷酸序列转录的转录调控序列。所述启动子可为任何在所选的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,并可从同源于或异源于宿主细胞、编码胞外或胞内多肽的基因获得。启动子具有复杂的区段-模块结构,并含有许多小的功能元件如转录因子结合位点、RNA聚合酶识别位点、mRNA起始位点。这些序列不具有准确的统一位置,并分散于转录起始的mRNA起始位点上游多至Ikb的5’-侧翼区。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文中表示这样的构型,其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置,使得调控序列指导该多肽的编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及产生多肽的任何步骤,其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文中定义为线性的或环状的DNA分子,其包含具有编码本发明的多肽的多核苷酸,并与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞“宿主细胞”用于本文中包括任何细胞类型,所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。发明详述5’未翻译区(5’UTR)的前导序列前导序列通常理解为mRNA的未翻译区,意指其被转录,但不被翻译。相应的DNA序列位于启动子和基因的编码序列之间,且该前导序列对于宿主细胞的翻译是重要的。所述前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。启动子序列是由用于表达编码多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导所述多肽表达的转录调控序列。本发明的前导序列(或5’未翻译区)在+1位置的转录起始位点开始,并正好在编码区的起始密码子(通常为AUG)之前结束。因此,其会在mRNA起始位点的下游和编码多肽的结构基因的上游。其通常含有核糖体结合位点。前导序列的选择如上所述会影响下游基因的表达水平。之前,对于在丝状真菌中最优表达的优选的前导序列已从对于米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。在一个优选的方面,本发明的核苷酸序列包含或组成为SEQIDN0:1或SEQIDN0:2。本发明亦涉及分离的多核苷酸,其包含或组成为核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDNO:1具有至少60%,优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,最优选至少95%,且甚至最优选至少96%,至少97%,至少98%或至少99%序列同一性程度,且具有前导序列功能。可对于显示为SEQIDNO:1的核苷酸序列进行修饰,例如其亚序列,和/或通过导入一个或几个核苷酸取代,而不显著影响其功能。SEQIDNO:2代表此种修饰,因为其为从相同菌种黑曲霉的另一个菌株分离的相同前导序列的另一个变体。本发明亦涉及分离的多核苷酸,其通过以下获得(a)将DNA群体在非常低、低、中等、中等-高、高或非常高严格条件下与SEQIDNO:1或SEQIDN0:2的核苷酸序列杂交。核酸构建体本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体,所述分离的多核苷酸与编码序列和一个或多个(几个)调控序列可操作地连接,所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导所述编码序列的表达。调控序列可为启动子序列,其为由用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导所述多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性ct-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片键抱Daria(W000/56900)、壤片键抱Quinn(W000/56900)、尖键抱(Fusariumoxysporum)膜蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶。大多数这些启动子会天然地与位于启动子及其调控的基因之间的非翻译前导序列相联。预见将该前导序列用本发明的前导序列替代。调控序列也可以是合适的转录终止子序列,即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列,其是与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列,并且在转录时,宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,MolecularCellularBiologyl5:5983-5990描述。调控序列还可以是信号肽编码序列,其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽,并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列,其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是,编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者,外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而,指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即,分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶。对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。调控序列还可以是前肽编码序列,其编码位于多肽氨基端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的,并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(W095/33836)的基因获得前肽编码序列。当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基端时,将前肽序列置于紧接着(nextto)多肽的氨基端,并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基端。同样理想的是添加调节序列,其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物,包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中,可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中,可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中,这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因,和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下,编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体,所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸,启动子和转录和翻译终止信号。本文所述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体,所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是,可以通过在适当的用于表达编码序列的载体中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸构建体来表达本发明的多核苷酸序列。在制备表达载体的过程中,将编码序列置于载体中,从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA步骤,并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体,S卩,作为染色体外实体(entity)存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者,载体可以是一种当被引入宿主细胞中时,整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒,其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA),或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记,其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因,其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。本发明的载体优选含有元件,其允许载体整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入宿主细胞基因组,载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者,载体可以含有额外的核苷酸序列,用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件应优选含有足够数量的核酸,如100至10,000碱基对,优选400至10,000碱基对,并且最优选800至10,000碱基对,其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列,其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外,整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面,可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制,载体可以进一步包含复制起点,其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator),其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI(Gems等,1991,Gene98:61-67;Cullen等,1987,NucleicAcidsResearchl5:9163-9175;W000/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于W000/24883中的方法完成。可以将包含本发明的多核苷酸的多于一个拷贝的核酸构建体插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸的拷贝数的增加可通过如下方法获得将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组,或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸,其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝,且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等,1989,见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞,其包含本发明的分离的多核苷酸可操作地连接于编码序列和一个或多个(几个)调控序列。将包含本发明多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞,使构建体或载体如前所述作为染色体整合体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代,其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞亦可为例如真核生物,如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的方面,宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于AinsworthandBisby^sDictionaryofTheFungi,第8版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用),和所有有丝分裂抱子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。在一个更优选的方面,真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内抱霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽抱纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变,就本发明而言,将酵母定义为如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一个甚至更加优选的方面,酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉属细胞(Yarrowia)。在最优选的方面,酵母宿主细胞是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)细胞、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)细胞、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)细胞、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)细胞、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)细胞、卵形酵母细胞(Saccharomycesoviformis)细胞。在另一个最优选的方面,酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(KluyveromycesIactis)细胞。在另一个最优选的方面,酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(YarrowiaIipolytica)细胞。在另一个更优选的方面,真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文,所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长,而碳分解代谢是专性需氧的。相反,酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行,而碳分解代谢可以是发酵的。在一个甚至更优选的方面,丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟錯菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、德抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂糟菌属(Schizophyllum)、踩节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。在最优选的方面,丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(AspergiIIusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞。在另一个最优选方面,丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、库威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本科德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、异抱德抱(Fusariumheterosporum)、合欢木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、肤色德抱(Fusariumsarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圆德抱(Fusariumtorulosum)、拟丝抱德抱(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个最优选的方面,丝状真菌宿主细胞是黑剌烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟錯菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福射射脉菌(Phlebiaradiata)、剌序侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭抱霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(TrichodermaIongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene78:147-156和W096/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.1.编,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82_187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等,1983,JournalofBacteriologyl53:163;和Hinnen等,1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920。产生方法
技术领域
:本发明亦涉及产生感兴趣的多肽的方法,其包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养包含本发明的核酸构建体的重组宿主细胞;和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面,所述细胞为曲霉属、镰孢属或木霉属的细胞。在一个更优选的方面,所述细胞是黑曲霉、米曲霉、禾本科镰孢或里氏木霉的细胞。在一个最优选的方面,所述细胞是黑曲霉细胞。在本发明的产生方法中,在适于使用本领域公知的方法产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如,可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养,和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养,所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)。若该多肽分泌到营养培养基中,则该多肽能够从所述培养基中直接回收。若该多肽不分泌至培养基中,其可从细胞裂解液回收。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,酶测定法(enzymeassay)可用于确定如本文中所述的多肽的活性。所得多肽可使用本领域已知方法回收。例如,多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收,所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。使用本发明的多核苷酸产生的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽,所述方法包括但不限于层析(例如,离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如,制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见,例如,ProteinPurification,J._C.Janson和LarsRyden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。本发明进一步通过下述实施例描述,其不应视为对本发明的范围的限制。实施例材料和方法方法分子克隆技术描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989)Molecularcloning:alaboratorymanual(第2版)ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork。酶用于DNA操作的酶(例如限制性内切核酸酶,连接酶等)可从NewEnglandBiolabs,Inc.获得,并可根据生产商的指示使用。培养基和试剂用作缓冲液和底物的化学品为分析级的商品。Cove-N(tf)平板组成为342.3g的鹿糖,20ml的Cove盐溶液,3g的NaNO3,和30g的NobleAgar,加水至I升。Cove-N平板组成为30g的鹿糖,20ml的Cove盐溶液,3g的NaNO3,和30g的NobleAgar,加水至I升。COVE盐溶液组成为26gKCl,26gMgSO4·7H20,76gKH2PO4和50mlCove痕量金属,加水至I升。COVE的痕量金属溶液组成为O.04gNaB4O7·IOH2O,O.4g的CuSO4·5H20,1.2g的FeSO4·7Η20,1.Og的MnSO4·Η20,0·8g的中性淀粉酶IIMoO2·2Η20,和10.Og的ZnSO4·7Η20,加水至I升。Cove-N顶层琼脂糖(topagarose)组成为342.3g的鹿糖,20ml的COVE盐溶液,3g的NaNO3,和IOg的低熔点琼脂糖,加水至I升。淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液组成为6.8gZnCl2·7H20,2.5gCuSO4·5H20,0.24gNiCl2·6H20,13.9gFeSO4·7H20,13.5gMnSO4·H2O和3g柠檬酸,加水至I升。YPG组成为4g的酵母提取物,Ig的KH2PO4,0.5g的MgSO4·7H20和15g的葡萄糖(ρΗ6·0),加水至I升。STC缓冲液组成为O.8Μ的山梨糖醇,25mM的Tris(pH8),和25mM的CaCl2,加水至I升°STPC缓冲液组成为STC缓冲液中的40%PEG4000。MLC组成为40g葡萄糖,50g大豆粉,4g/朽1檬酸(pH5.O),加水至I升。MSS组成为70g蔗糖,IOOg大豆粉(ρΗ6·O),加水至I升。MU-1组成为260g的麦芽糊精,3g的MgSO4·7Η20,5g的KH2PO4,6g的K2SO4,淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液O.5ml和尿素2g(pH4.5),加水至I升。购买的材料(大肠杆菌,质粒和试剂盒)将大肠杆菌DH5_alpha(Toyobo)用于质粒构建和扩增。将商业性质粒/载体TOPOCloningKit(Invitrogen)和pBluescriptIISK-(Stratagene#212206)用于克隆PCR片段。扩增的质粒用()iagenPlasmidKit(Qiagen)回收。连接用DNALigationKit(Takara)或T4DNA连接酶(BoehringerMannheim)进行。聚合酶链式反应(PCR)用ExpandPCR系统(BoehringerMannheim)进行。将QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)用于从琼脂糖凝胶纯化PCR片段和提取DNA片段。菌株将构巢曲霉菌株NRRL1092用作木聚糖酶基因启动子和硝酸还原酶基因终止子的供体。表达宿主菌株黑曲霉QMJi016-14_l由Novozymes分离,且为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。QMJiO16-14-1经遗传修饰以破坏ku70、oah和pyrG的表达。表达宿主菌株黑曲霉NN059180(pyrG-)由Novozymes分离并为从土壤分离的黑曲霉NN049184的衍生物。NN059180经遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性的表达。黑曲霉NN059180中的中性蛋白酶I基因由大肠杆菌潮霉素B磷酸转移酶基因打断。米曲霉Bech2描述于W000/39322实施例1。描述于TO2006069289的米曲霉菌株#13-1由Novozymes分离。质粒表达盒质粒pJaL790(描述于专利公开W02005070962)表达盒质粒pHUda440(描述于专利公开W02006/069289)表达盒质粒pCBPhycutiprepro(描述于专利公开W02008/017646)pJaL574描述于W007045248中的实施例9黑曲霉的转化曲霉属菌种的转化可使用一般的用于酵母转化的方法实现。对于本发明的优选步骤如下所述。将黑曲霉宿主菌株接种至补充IOmM尿苷的IOOml的YPG培养基,并在32°C以80rpm温育16小时。收集沉淀,并用O.6MKCl洗涤,并重悬于含有20mg每ml的最终浓度的商业性β-葡聚糖酶产品(GLUCANEX,NovozymesA/S,BagSVSerd,Denmark)的20ml0.6MKCl。将悬液在32°C以80rpm温育直至形成原生质体,然后用STC缓冲液洗涤两次。将原生质体用血细胞计数器计数,并重悬,并调整于STC:STPC:DMS0为8:2:0.1溶液中至2.5xl07个原生质体/ml的终浓度。将大约4μg的质粒DNA添加至100μI的原生质体悬液,轻柔的混合,并在冰上温育30分钟。添加一ml的SPTC,并将原生质体悬液在37°C温育30分钟。在添加IOml的50°CCove-N顶层琼脂糖之后,将反应倾至Cove-N(tf)琼脂平板上,并将平板在32°C温育5日。PCR扩增5xPCR缓冲液(包含MgCl2)20μ2.5mMdNTP混合物10μ正向引物(100μΜ)Iμ反1%引物(ΙΟΟμΜ)IμExpandHighFidelity聚合物(Roche)Iμ模板DNAIμ蒸馏水至100μPCR条件94uC2分钟I个循环920CI分钟I55"C丨分钟[30+循环72eC1-2分钟J72eC7分钟I个循环用于葡糖淀粉酶产生的SF培养将选定的转化体的孢子接种于IOOml的MLC培养基并在30°C培养2日。将IOml的MLC接种至IOOml的MU-1培养基,并在30°C培养7日。上清通过离心获得。用于肌醇六磷酸酶产生的SF培养将选定的转化体的孢子接种于IOOml的MSS培养基并在30°C培养2日。将IOml的MSS接种至IOOml的MU-1培养基,并在32°C培养3日。上清通过离心获得。Southern杂交将选定的转化体的菌丝体从100mlYPG培养基中的过夜培养收获,用蒸馏水漂洗,干燥,并冻结于_80°C。将磨碎的菌丝体用蛋白酶K和RNaseA在65°C温育I小时。回收基因组DNA,即酚/CHC13提取两次,接着进行EtOH沉淀,并重悬于蒸馏水。非放射性探针使用PCRDIG探针合成试剂盒(RocheAppliedScience,IndianapolisIN)遵循生产商的指示合成。将DIG标记的探针使用QIAquickTMGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA)根据生产商的指示进行凝胶纯化。将五微克的基因组DNA用合适的限制性酶完全消化16小时(40μI总体积,4U酶/μIDNA),并在O.8%琼脂糖凝胶上运行。将DNA在凝胶中通过用O.2ΜHCl处理来片段化,变性(O.5ΜNaOH,1.5ΜNaCl),和中和(1ΜTris,ρΗ7.5;1.5ΜNaCl),以供后续在20ΧSSC中转移至HybondN+膜(Amersham)。将DNAUV交联于膜,并在42°C在20mlDIGEasyHyb(RocheDiagnosticsCorporation,Mannheim,Germany)中预杂交I小时。将变性的探针直接添加于DIGEasyHyb缓冲液,并进行在42°C的过夜杂交。在后杂交洗涤(在2XSSC中在室温进行两次,每次5分钟,和在0.1XSSC中在68°C进行两次,每次15分钟)之后,遵循生产商的指示进行使用DIG检测系统和CPD-Star(Roche)的化学发光检测。将DIG标记的DNAMolecularWeightMarkerII(Roche)用作标准物标记。肌醇六磷酸酶测定法IFYT-V是在下述标准条件下每分钟释放Iμmol无机磷酸的酶量。权利要求1.一种具有前导序列功能的分离的多核苷酸,其选自下组(a)多核苷酸,其包含核苷酸序列,所述核苷酸序列与SEQIDN0:1或2具有优选至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,且最优选至少95%序列同一'丨生;(b)多核苷酸,其与SEQIDNO:1或2的多核苷酸在优选至少中等-高严格条件,最优选至少高严格条件,且甚至最优选至少非常高严格条件下杂交;(c)SEQIDNO:1或2的包含一个或多个(几个)核苷酸的取代、缺失和/或插入的变体。2.权利要求1的多核苷酸,其包含或组成为SEQIDNO:1或2的核酸序列,或其具有前导序列功能的片段。3.权利要求1的多核苷酸,其具有SEQIDNO:1或2的核酸序列。4.一种核酸构建体,其包含至少一个第一核酸序列,所述第一核酸序列包含在第二核酸序列上游的启动子,所述第二核酸序列包含前述任一项权利要求的多核苷酸,所述多核苷酸可操作地连接于第三核酸序列,所述第三核酸序列编码感兴趣的多肽,并位于所述第二核酸序列的下游。5.权利要求4的核酸构建体,其中所述包含于第二核酸序列的前导序列对于所述启动子是外源的。6.权利要求4-5任一项的核酸构建体,其中所述启动子选自下组NA2,任何来源于淀粉酶基因(葡糖淀粉酶、中性淀粉酶、酸性淀粉酶)的启动子,任何来源于蛋白酶基因(pepA、pepB、pepC、pepD、pepE)的启动子,任何来源于氧化酶基因(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、单氧化酶(mono-oxidase))的启动子,任何来源于编码糖酵解酶(烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶)的基因的启动子,任何来源于核糖体蛋白(核糖体蛋白、组蛋白)的启动子,或任何来源于编码热激蛋白、乙酰CoA乙酰转移酶、翻译延伸因子、CipC-样抗生素响应蛋白(CipC-likeantibioticresponseprotein)、转化酶或外切菊粉酶(exo-1nulinase)的基因的启动子。7.权利要求4-6任一项的核酸构建体,其中所述前导序列组成为SEQIDNO:1或2。8.—种重组表达载体,其包含权利要求4-7任一项的核酸构建体。9.一种重组宿主细胞,其包含权利要求4-7任一项的核酸构建体。10.一种产生感兴趣的多肽的方法,其包括(a)在有助于所述多肽产生的条件下培养权利要求9的宿主细胞;和(b)回收所述多肽。11.权利要求10的方法,其中所述宿主细胞是丝状真菌。12.权利要求11的方法,其中所述丝状真菌选自下组枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、键抱属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨抱菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂裙菌属(Schizophyllum)、踩节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。13.权利要求12的方法,其中所述曲霉选自下组泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(AspergiIIusniger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)。14.权利要求13的方法,其中所述曲霉是黑曲霉。15.权利要求13的方法,其中所述曲霉是米曲霉。16.权利要求10-15任一项的方法,其中所述多肽是酶。17.权利要求16的方法,其中所述酶选自下组蛋白酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、肌醇六磷酸酶、氧化酶、氧还酶和果胶酶。全文摘要本发明涉及具有前导序列功能的分离的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞,以及使用所述多核苷酸产生多肽的方法。文档编号C12N15/00GK103068978SQ201180041006公开日2013年4月24日申请日期2011年6月23日优先权日2010年6月25日发明者宇田川裕晃,平理佳子,高木忍申请人:诺维信公司
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