专利名称：细胞培养用温度应答性基材及其制造方法
技术领域：
本发明涉及在生物学、医学等领域中有用的细胞培养基材。本申请是主张以2010年8月31日提出的日本专利申请(特愿2010-208506号)为基础的优先权的申请。
背景技术：
现在，动物细胞培养技术显著进步，将动物细胞作为对象的研究开发也在各种各样的领域中广泛实施。成为对象的动物细胞的使用方法，也不仅仅是将开发当初的细胞本身进行制品化，或者将其产生物进行制品化，现在通过分析细胞或其表层蛋白质来设计有用的药品，在体外增殖患者本人的细胞，或者提高该细胞的功能后，返回患者的体内进行治疗的方法也正在实施。现在，培养动物细胞的技术，受到很多研究者的关注。但是，包含人细胞的动物细胞很多有附着依存性。即，要在体外培养动物细胞时，必须将它们一次附着于成为立脚点的任何基材上。基于这样的背景，比以前多的研究者们进行了对于细胞更优选的基材表面的设计及规划。但是，这些技术都仅仅是与细胞培养时有关系的技术。附着依存性的培养细胞附着于某种基材时，自身产生粘着性蛋白质。因此剥离该细胞时，通过以往技术，例如，通过酶处理等必须破坏其粘着性蛋白质。其结果，存在着细胞在培养中产生的各种细胞固有的细胞表层蛋白也同时被破坏这样的缺点，尽管这样，现实的情况是完全没有解决的方法，特别是没有进行研究。基于这样的背景，在特开平2-211865号公报(专利文献I)中公开了一种新的细胞培养方法，即在以对于水的上限或下限临界溶解温度为0 80°C的高分子被覆基材表面的细胞培养支持体上，在上限临界溶解温度以下或下限临界溶解温度以上培养细胞，其后通过使其温度达到上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，没有酶处理而使培养细胞剥离。另外，在特开平05 -192138号公报(专利文献2)中公开了，利用特开平2-211865号公报(专利文献I)中公开的的温度应答性细胞培养基材并在上限临界溶解温度以下或者下限临界溶解温度以上来培养皮肤细胞，其后通过使其温度达到上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，以低损伤使得培养皮肤细胞剥离。进而，在特愿2007-105311号公报(专利文献3)中公开了一种培养细胞的表层蛋白质修复方法，该方法使用了特开平
2-211865号公报(专利文献I)中公开的温度应答性细胞培养基材。通过利用这样的温度应答性细胞培养基材，相对于以往的培养技术正谋求各种各样新的发展。但是，以往技术，将化学上惰性的工程塑料的表面使用如电子射线等的高能量进行被覆加工，因此如电子射线照射装置那样庞大的装置是必要的，因此，存在基材的价格也必然变高这样的问题。为了解决这样的问题，目前为止已开发了几个技术。已知例如，Soft Matter, 5,2937-2946 (2009)(非专利文献 l)、Interface, 4，1151-1157 (2007)(非专利文献 2)中所记载的那样，合成具有特定的分子结构的聚合物，向基材表面进行被覆的方法。但是，任一种技术，都没有能够达到可与以往的细胞培养用基材同等地培养细胞，与使用上述电子射线制作的细胞培养用温度应答性基材同等地仅使细胞进行温度变化来使其剥离，或在培养细胞成为融合的状态时作为细胞片使其剥离的技术水平。现有技术文献专利文献专利文献1:特开平2-211865号公报专利文献2:特开平05-192138号公报专利文献3:特愿2007-105311号公报非专利文献非专利文献I:Soft Matter, 5，2937-2946 (2009)非专利文献2:1nterface，4，1151-1157 (2007)
发明内容
发明要解决的课题本发明是为了解决如上述以往技术的问题而完成。即，本发明的目的在于，提供根据与以往技术完全不同的想法制作的新的细胞培养用温度应答性基材及其制造方法。解决课题的方法
本发明者为了解决上述课题，从各种角度进行研讨，进行研究开发。其结果，令人惊奇地是本发明者发现，将具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构的嵌段共聚物在基材表面作为温度应答性聚合物成分以0.8 3.0y g/cm2的比例进行被覆，可效率良好地培养细胞，而且仅改变基材面的温度即可效率良好地剥离培养细胞或细胞片。这些认识，是本发明者着眼于具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构的嵌段共聚物所具有的立体规则性、以及基材表面上的形态，并基于深入研究的结果。进而，可知这样的细胞培养用基材与以往技术的温度应答性细胞培养用基材相比具有高性能。本发明是根据该认识而完成。通过本发明，提供一种细胞培养用温度应答性基材，在基材表面被覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构，在基材表面作为温度应答性聚合物部分以0.8 3.0y g/cm2的比例进行被覆。另外，本发明的细胞培养用应答性基材，虽没有限定，但作为优选方式包含下述的方式。在本发明的一方式中，在基材表面上作为水不溶性聚合物部分以0.09 7.0ii g/cm2的比例进行被覆。在本发明的一方式中，基材表面具有相分离结构。在本发明的一方式中，嵌段共聚物内的温度应答性聚合物的含量为30 90wt%。在本发明的一方式中，嵌段共聚物内的温度应答性聚合物的平均分子量为3000以上。另外，如图2表示的那样，重均分子量(Mw)与数均分子量(Mn)的比接近1，因此为了得到本发明的效果，可采用任意的平均分子量。在本发明的一方式中，温度应答性聚合物，包含聚N-取代丙烯酰胺衍生物、聚N-取代甲基丙烯酰胺衍生物、它们的共聚物、聚乙烯基甲基醚的任一个或两个以上。在本发明的一方式中，温度应答性聚合物为聚N-异丙基丙烯酰胺。在本发明的一方式中，其特征是基材为单独的板状、或2种以上组合的形态。另外，通过本发明，提供细胞培养用温度应答性基材的制造方法，其特征在于，将具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构的嵌段共聚物溶解或分散于有机溶剂中，通过旋转涂布将该嵌段共聚物溶液均匀地涂布于基材表面，并使其干燥。另夕卜，本发明的细胞培养用应答性基材的制造方法，虽没有限定，但作为优选方式包含下述的方式。在本发明的一方式中，嵌段共聚物是通过可逆的加成断裂链转移(RAFT)聚合得到的。在本发明的一方式中，溶解嵌段共聚物的溶剂为乙腈与N，N-二甲基甲酰胺的混合液。在本发明的一方式中，乙腈与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂的混合比例按照体积比计为5:1。发明效果通过使用本发明的细胞培养用温度应答性基材，可效率良好地培养细胞，而且仅通过改变基材面的温度即可效率良好地剥离培养细胞或细胞片。另外，通过本发明，可简便地制作这样的功能性表面。
图1:是表示实施例1的嵌段共聚物的合成经路的图。图2:是表示实施例1中得到的嵌段共聚物的特性的图。图3:是表示实施例1中得到的温度应答性表面的特性的图。通过ATR/FT-1R测定来评价温度应答性聚合物修饰量与被覆膜的稳定性。图4:是表示实施例1中得到的温度应答性表面的特性的图。通过PIPAAm固定量与静的接触角测定(水中气泡法)来评价表面润湿性。图5:是表示实施例1中得到的各修饰量的温度应答性表面与细胞举动的关系的图。图6:是表示实施例1中得到的各修饰量的温度应答性表面与细胞举动的关系的照片。其表示在TCPS (A)上、以及TCPS上分别用将B79-1P120以0.lw/v% (B),0.3w/v%(C)、及0.5w/v% (D)进行被覆的温度应答性表面上，于37°C播种细胞后，72小时的粘着细胞的显微镜照片。其后，将温度降低至20°C，进而分别以(E) (H)表示培养2小时后的细胞的形态。细胞的播种:5.0X IO3细胞/cm2。图7:是表示PIPAAm分子链长与细胞举动的关系的图。图8:是表示嵌段共聚物的链长与细胞举动的关系的图。图9:是表示在实施例1中得到的温度应答性表面上培养细胞进行研究的结果的图。图10:是表示实施例1乃至3中得到的温度应答性表面与细胞片形成的关系的图。
具体实施例方式
本发明是在基材表面以0.8 3.0 ii g/cm2的比例被覆有具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构的嵌段共聚物的细胞培养用温度应答性基材。被覆在基材表面的嵌段共聚物的水不溶性聚合物部分具有如下效果，即在细胞培养中、以及即使在根据温度变化使培养细胞或细胞片剥离时，也不从基材表面游离。通常，所谓“嵌段共聚物”，表示以至少2种组成完全不同的链段的聚合物，如本领域技术人员所理解的那样，例如可举出，二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、无规嵌段共聚物、星状分枝嵌段共聚物或超支化嵌段共聚物。本发明中所使用的嵌段共聚物，典型地具有水不溶性聚合物链段(A)和温度应答性聚合物链段(B)，可以是以下的结构:包含2个嵌段链段的A-B结构；包含3个嵌段链段的A-B-A或B-A-B ;及包含多个嵌段的-(A-B)n-(在这里，n为2以上的整数)的任一种。另外，本发明的细胞培养用温度应答性基材中可使用的嵌段共聚物，对照上述的结构，优选A-B结构。在本说明书中，具有A-B结构的嵌段共聚物，例如，包含作为水不溶性聚合物链段(A)的聚甲基丙烯酸正丁酯(PBMA)的链段和作为温度应答性聚合物链段(B)的聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)的链段时，嵌段共聚物，使用各聚合物的单体单元的数(例如，BMA为79个，IPAAm为120个)，有时标记为“B79-1P120”等(参照实施例1)。本说明书中使用的所谓“水不溶性聚合物”，只要是不溶于水的物质则没有特别限定，例如可举出，聚丙烯酸正丁酯、聚丙烯酸叔丁酯等的聚丙烯酸烷基酯；聚甲基丙烯酸正丁酯、聚甲基丙烯酸叔丁酯、聚甲基丙烯酸甲酯等的聚甲基丙烯酸烷基酯；聚苯乙烯等。本说明书中使用的所谓“温度应答性聚合物”，表示具有下限临界溶解温度(LCST)的聚合物和/或具有上限临界溶解温度(UCST)聚合物，可以是它们的均聚物、共聚物、或者混合物的任一种。作为这样的聚合物,例如可举出特公平06-104061号公报中记载的聚合物。具体地说，例如，通过以下的单体的均聚或共聚来得到。作为可使用的单体，可举出例如，(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或N，N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或乙烯基醚衍生物、聚乙烯醇部分乙酸化物。在为共聚物时，可以使用这些单体中的任意的2种以上。进而，也可使用与上述单体以外的单体类的共聚物、聚合物相互的接枝或共聚物、或聚合物和/或共聚物的混合物。另外，根据需要，在不损害聚合物本来性质的范围内也可以进行交联。
通常，由于被分离的物质为生物体物质，所以必须选择在5°C 50°C的范围内适于分离作为对象的生物体物质的温度应答性聚合物。本发明中可使用的温度应答性聚合物，可以是聚N-取代丙烯酰胺衍生物、聚N-取代聚甲基丙烯酰胺衍生物、它们的共聚物、聚乙烯基甲基醚的任一个、或2以上的组合。更具体地说，作为温度应答性聚合物，可举出，聚N-正丙基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度21°C)、聚N-正丙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度27V)、聚N-异丙基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度32°C)、聚N-异丙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度43°C)、聚N-环丙基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度45V )、聚N-乙氧基乙基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度约35°C)、聚N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度约45°C)、聚N-四氢糠基丙烯酰胺(同约28V)、聚N-四氢糠基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度约35V)、聚N、N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度56V)、聚N、N_ 二乙基丙烯酰胺(均聚物的下限临界溶解温度32°C)等。优选为聚N-异丙基丙烯酰胺。本发明中使用的温度应答性聚合物，作为上述嵌段共聚物内的含量可在30 90wt%的范围好，优选在40 85wt%的范围，进一步优选在45 60wt%的范围。少于30wt%时，即使改变温度也难以剥离该聚合物上的培养细胞，操作效率显著变差因而不优选。相反多于90wt%时，细胞难以附着于该区域，难以使细胞充分附着，作为本发明的细胞培养基材不优选，另外，本嵌段共聚物的水不溶性聚合物部分变少且容易从基材表面游离因而不优选。本发明中使用的温度应答性聚合物，作为平均分子量可为3000以上，优选5000以上，进一步优选10000以上，最优选12000以上。分子量少于3000时，即使改变温度也难以剥离该聚合物上的培养细胞，操作效率显著变差因而不优选。另外，按照本发明，在本发明中使用的温度应答性聚合物的分子量，只要是上述下限值，不限制分子量的上限值，也可效率良好地进行培养细胞的剥离。作为一方式，温度应答性聚合物的平均分子量的上限值可以是35000，优选30000，更优选25000。本发明的细胞培养用温度应答性基材，是作为上述嵌段共聚物中的温度应答性聚合物以0.8 3.0il g/cm2的范围被覆的基材，优选为0.9 2.0 y g/cm2，进一步优选为1.3 1.8 ii g/cm2。少于0.8 ii g/cm2的被覆量时，即使改变温度也难以剥离该嵌段共聚物上的培养细胞，操作效率显著变差因而不优选。相反多于3.0y g/cm2时，细胞难以附着该区域，难以使细胞充分附着，作为本发明的细胞培养基材不优选。另外，被覆量的测定可根据常法，例如可利用FT-1R-ATR法、元素分析法、ESCA等，可使用任一种方法。本发明的细胞培养用温度应答性基材，其特征在于，将具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段分别以规定的比例结合的结构的嵌段共聚物被覆于基材表面。在这里，所谓“水不溶性聚合物”的比例，如上所述，温度应答性聚合物超过90wt%时，S卩，水不溶性聚合物少于10wt%时，嵌段共聚物容易从基材表面游离，因此嵌段共聚物的水不溶性聚合物的比例只要是10wt%以上即可。另外，制造本发明的细胞片时，由于主要构成嵌段共聚物的温度应答性聚合物的被覆量变得重要，因此嵌段共聚物中的水不溶性聚合物含量，只要进行适当调整使得上述期望的范围量的温度应答性聚合物可被覆于培养基材上即可。更具体地说，本发明的细胞培养用温度应答性基材，作为上述嵌段共聚物中水不溶性聚合物分可以以0.09 7.0 ii g/cm2的范围进行被覆,优选0.14 4.5 ii g/cm2,进一步优选
0.2 3.0 u g/cm2。如上所述，本发明的嵌段共聚物，是水不溶性聚合物链段与对于水具有亲和性的温度应答性聚合物链段结合的物质。因此，在基材表面被覆本嵌段共聚物，并使其干燥时，可期待在基材表面形成微细的片层结构、海岛结构、圆筒结构、共连续结构等的相分离结构。相分离结构的形态、尺寸等没有特别限定，细胞附着于基材表面时，在基材表面具有相分离结构时可能抑制细胞的变性，因而是适合的。通常，在嵌段共聚物的制造中，多使用可逆的加成断裂链转移(RAFT)聚合法、原子转移自由基聚合(ATRP)法、阴离子聚合法或活性自由基聚合法。在本发明中，嵌段共聚物的制造法，并不限定于上述聚合法及其他的聚合法，但优选使用RAFT聚合法。使用RAFT聚合法制造嵌段共聚物时，作为RAFT剂结构的一部分的二硫代酯系官能基，残存于生成的嵌段共聚物的末端。这是RAFT聚合法中特征性的现象，聚合反应终止后，进而可由其末端使聚合反应开始。此时，存在于温度应答性聚合物的末端的二硫代酯系官能基，通过添加2-乙醇胺等，容易被置换为硫醇基。该反应没有必要在特别的条件下进行，可简便且短时间进行。其结果，可得到具有反应性高的硫醇基的聚合物链，因此可使具有马来酰亚胺基、硫醇基等官能基的功能性分子选择性而且有效地修饰聚合物链末端。因此，在本发明的细胞培养用温度应答性基材表面可赋予新的功能性。另外，对于官能基的种类没有特别限定，例如可举出羟基、羧基、氨基、羰基、醛基、磺酸基等。另外，在上述制造的聚合物链末端也可以固定化促进细胞粘着的肽或蛋白质。与此关联，例如，聚N-异丙基丙烯酰胺的下限临界溶解温度(LCST)依存于末端官能基的亲水性 疏水性而变化，因此如本发明这样的对于聚合物链末端的官能基导入，作为从其他的观点控制基材表面的温度应答性的新的方法被期待。如上所述，本发明的嵌段共聚物，通过RAFT聚合法来得到，即，在RAFT剂共存下进行自由基聚合，使温度应答性聚合物生长的方法。此时使用的引发剂没有特别限定，例如可举出2, 2’-偶氮二异丁臆、2, 2’-偶氮二(4-甲氧基-2,4-二甲基戍臆)(V_70)、2, 2’-偶氮二 [ (2-羧基乙基)-2-(甲基丙脒)](V-057)等。在本发明中，可通过该引发剂使聚合物链生长。另外，作为使用的RAFT剂没有特别限定，可举出二硫代苯甲酸苄酯、二硫代苯甲酸枯基酷、二硫代苯甲酸2_氛基丙基酷、1_苯基乙基苯基二硫代乙酸酷、枯基苯基二硫代乙酸酯、1-吡咯二硫代羧酸苄酯、1-吡咯二硫代羧酸枯基酯等。对于本发明中聚合时使用的溶剂特别没有限定，优选苯、1，4_ 二噁烷、二甲基甲酰胺(DMF)等。虽然对于该溶剂没有任何限定，但是可根据聚合反应中使用的单体、RAFT剂及聚合引发剂的种类来适宜选择。本发明，是使用I，4- 二噁烷等的溶剂，在RAFT剂共存下，通过使用了引发剂的表面引发型自由基聚合法，从单体开始使得在0 80°C的温度范围内水和力变化的聚合物进行生长的方法。其他聚合时的引发剂浓度、RAFT剂浓度、反应温度、反应时间等没有特别限定，可根据目的变更。进而反应液的状态可以静置也可以搅拌。本发明中使用的RAFT法，可不使用金属离子等来进行反应，因此容易精制反应后的生成物，反应工序本身通过简便的操作就可顺利完成。本发明的细胞培养用温度应答性基材，典型地，通过将这样操作得到的嵌段共聚物溶解或分散于溶剂中，将该共聚物均匀地被覆在基材表面来得到。此时，使用的溶剂，只要适当选择可将该嵌段共聚物溶解或分散、且尽量不溶解基材表面的溶剂即可，没有特别限定。例如可举出，N，N-二甲基丙烯酰胺、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、1，4_ 二噁烷、二甲基亚砜、甲基乙基酮、N，N-二甲基乙酰胺、氯仿、二氯甲烷、或者乙腈、N，N-二甲基甲酰胺等。并用多种溶剂时其混合比没有特别限定，例如，乙腈与N，N- 二甲基甲酰胺的混合液的情况，按照体积比计，优选乙腈为5且N，N- 二甲基甲酰胺为I的比例、乙腈为4且N，N- 二甲基甲酰胺为I的比例、或乙腈为6且N，N-二甲基甲酰胺为I的比例。也有以下方法，即，作为溶剂利用水，根据需要添加乳化剂将嵌段共聚物溶解、乳化、分散的方法，通过该方法，由于嵌段共聚物的组成有时不能在水中变得均匀，其结果，不能将嵌段共聚物均匀、且平滑地被覆在基材表面，在培养细胞的过程中细胞不能均匀地附着于基材表面，不能均匀地增殖，作为被覆基材的方法不优选。另外，利用水作为溶剂将嵌段共聚物被覆于基材表面时，涂布后，在直至干燥所花费的时间方面也不优选。本发明中，必须将上述嵌段共聚物溶液均匀地涂布于基材表面。其方法没有特别限定，可举出利用旋转涂布的方法、将基材静置于水平的台上的方法等。涂布后，通过除去溶剂，得到作为本发明的细胞培养用温度应答性基材。另外，溶剂的除去方法没有特别限定，可以列举在室温/大气中花费时间慢慢使溶剂蒸发的方法、在室温/溶剂饱和环境下花费时间慢慢使溶剂蒸发的方法、进行加热使溶剂蒸发的方法、进行减压使溶剂蒸发的方法等，但是在漂亮地制作最终的细胞培养用温度应答性基材的表面方面，前二者的方法好，特别优选在室温/溶剂饱和环境下花费时间慢慢使溶剂蒸发的方法。作为进行被覆的细胞培养基材，不仅是通常细胞培养中使用的玻璃、改质玻璃，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯等，通常有可能赋予形态的材料，并没有限定，例如可使用上述以外的高分子化合物、陶瓷、金属类等。细胞培养基材的形状，并不限定于陪替氏培养皿等的细胞培养皿，可以是盘(板状)、纤维(糸状)、(多孔质)粒子(粒状)、管状、薄膜状的基材、或将它们2种以上组合的基材。另外，也可以是具有通常细胞培养等中使用的容器的形状(烧瓶等)。本发明中使用的细胞培养基材的形状，优选板状的单独、或组合2种以上的基材形状。另外，在上述通常使用的细胞培养基材上被覆嵌段共聚物时，优选细胞培养基材的表面为疏水性。因此，使用玻璃基板等的其表面为亲水性的细胞培养基材时，优选预先进行疏水化处理。疏水化处理，特别没有限定，可以是使用硅烷耦合剂(例如，己基三乙氧基硅烷)的处理。对于本发明中得到的细胞培养用温度应答性基材表面可使用的细胞，其由来没有限定，进而其得到地、制作方法也没有特别限定。本发明中使用的细胞，可举出例如，动物、昆虫、植物等的细胞、细菌类。典型地作为动物细胞的由来，优选人、猴、狗、猫、兔、大鼠、裸鼠、小鼠、土拨鼠、猪、绵羊、中国仓鼠、牛、狨猴、非洲绿猴等。另外，本发明中使用的培养基，只要是动物细胞用的培养基则 特别没有限定，例如可举出无血清培养基、含血清培养基等。这样的培养基，可进一步添加视黄酸、抗坏血酸等的分化诱导物质。细胞在基材表面的的播种密度可适当变更，其播种密度可根据常法来决定。另外，使用本发明的细胞培养用温度应答性基材，则可以通过简单地使培养基材的温度达到在培养基材上的被覆聚合物的上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下无酶处理而剥离培养细胞或细胞片。上述的剥离，可以在培养液中进行，也可以在其他的等张液中进行，可以配合目的进行。为了更快、更高效率地剥离细胞，进而进行回收的目的，可单独或并用以下方法:将基材轻轻地敲、或者摇晃的方法，或使用吸液管搅拌培养基的方法等。通过利用本发明的细胞培养用温度应答性基材，可效率良好地培养由各组织得到的细胞。利用该培养方法，则仅改变温度即可无损伤、且效率良好地剥离培养细胞或细胞片。以往，这样的操作需要功夫和操作者的技术，如果是本发明则没有这个必要，可以进行细胞的大量处理。按照本发明，显示这样的培养基材表面，可利用活性自由基聚合法来制作得到。特别是通过RAFT聚合法(活性自由基聚合法的I种)，可简便、精密地设计培养基材表面，进而可在分子链末端简便地导入官能基，因此本发明的细胞培养用温度应答性基材及制造其的方法，是非常有用的细胞培养技术。实施例以下，根据实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。实施例1:温度应答性表面的制备和特性在本实施例中，制备温度应答性嵌段共聚物，所述温度应答性嵌段共聚物包含作为温度应答性聚合物的聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)的链段和作为水不溶性聚合物的聚甲基丙烯酸正丁酯(PBMA)的链段，在基材表面进行旋转涂布。对于制作的温度应答性嵌段共聚物被覆表面，进行聚合物的表面导入量或表面润湿性等的物性评价、以及研究由于温度变化弓I起的对于基材表面的细胞粘着性的不同。( I)温度应答性嵌段共聚物的制备具体地说，将通过RAFT聚合合成的作为水不溶性聚合物的PBMA作为大分子RAFT齐[J，制备PBMA-b-PIPAAm嵌段共聚物(图1)。另外，将通过RAFT聚合控制分子量所合成的PBMA及PBMA-b-PIPAAm的分析值示于图2。另夕卜，在本说明书中，例如，将BMA与IPAAm的单体单元的比为70:24的PBMA-b-PIPAAm嵌段共聚物表示为“B79-1P24”。(2)温度应答性嵌段共聚物的特性通过核磁共振分光法(1H-NMR)或凝胶渗透色谱法(GPC)评价得到的聚合物。将PBMA-b-PIPAAm以0.1w/v%、0.3w/v%或0.5w/v%的各浓度溶解于乙臆/N, N- 二甲基甲酰胺混合溶剂(5/1以v/v计)中。另外作为对照，同样地制备PBMA溶液(0.5w/v%)及PIPPAm (0.5w/v%)。接着，将聚合物溶液旋转涂布于细胞培养用聚苯乙烯(TCPS)基材表面(3000rpm, 30sec),在室温下干燥一晚后,用水洗漆基材表面,在室温下减压干燥6小时,制备温度应答性表面。另外，没有用聚合物溶液被覆的TCPS及UpCeII (登记商标)(七>'>一卜''社制，日本)也作为对照使用。为了研究水中的聚合物被覆的稳定性，水中在37°C静置24小时后，在4°C的水中振荡6小时，进行减压干燥。最初，通过全反射型傅立叶变换型红外分光(ATR/FT-1R)法来决定该基材的表面聚合物量，比较研究处理前后的聚合物量的不同(参照图3)。接着，通过利用水中气泡法的静的接触角测定法，对于20°C及37°C的润湿性进行评价。对于PBMA-b-PIPAAm被覆基材的表 面稳定性使用ATR/FT-1R研究的结果，在处理(在水中37°C下静置24小时，接着在4°C水中振荡6小时)前后PIPAAm修饰量几乎没有观察到变化。由此可知，在以水中的LCST (PIPAAm时为32°C )为界的温度变化下嵌段共聚物处于稳定地被覆于基材上的状态(图3)。该结果，考虑是因为作为水不溶性聚合物链的PBMA，与作为细胞培养基材使用的聚苯乙烯基材通过疏水性相互作用而稳定地物理吸附。另外对于聚合物被覆基材PIPAAm链的在LCST的温度附近的表面润湿性的不同进行评价时，与PBMA被覆基材同样，对于PBMA-b-PIPAAm被覆基材未发现变化(图4)。考虑这是因为与如以往的温度应答性细胞培养基材表面那样的基材表面整体被作为温度应答性链的PIPAAm被覆的状态不同，在PBMA-b-PIPAAm被覆基材中，PBMA链与PIPAAm链发生相分离且在基材表面上形成各自的区域，因此在追踪大的环境变化的表面润湿性测定中没有观察到显著的变化。另外，根据在包含PBMA链和PIPAAm链的嵌段共聚物中PIPAAm链所占的比例(参照图2)推测形成相分离结构。实施例2:接枝量与细胞举动的研究根据实施例1的记载，制备将TCPS被覆各种浓度的B79-1P120的基材，在该制作的基材上以1.0X IO4细胞/cm2浓度播种来源于牛颈动脉的血管内皮细胞(BAEC)，对于聚合物被覆基材表面上的37°C的细胞的粘着性及通过20°C的低温处理的细胞的脱去举动进行评价。图5中的黑圆点表示没有被覆聚合物的TCPS基材，黑菱形及白菱形表示TCPS上分别以0.3及0.5w/v%被覆B79-1P120的基材上的细胞举动的变化。图5表示，在各基材上播种BAEC细胞，培养72小时后，使培养温度由37°C至20°C变化时的细胞粘着率(% )的变化。更具体地说，通过在37°C的培养细胞粘着率上升，细胞培养用的TCPS中粘接率高，另夕卜，以0.3w/v%被覆B79-1P120的基材高。另一方面，以0.5w/v%被覆B79-1P120的基材中细胞粘着率低。实际测定TCPS所被覆的PIPAAm的量时，浓度为0.3w/v%时其为1.44 u g/cm2,0.5w/v%时其为1.81 u g/cm2，可以说PIPAAm的被覆量变多时细胞粘着率有减少的倾向。接着，由37°C至20°C进行温度变化时的细胞粘着率的变化，在使用PIPAAm的被覆量为1.44 u g/cm2的基材时显著显现。在TCPS中，伴随温度变化细胞粘着率几乎没有发现变化。另一方面，在PIPAAm的被覆量为1.81 u g/cm2的基材中，由37°C至20°C进行温度变化时，发现细胞迅速剥离的现象，37°C时的细胞粘着率低，被认为对于培养细胞是不优选条件。进而，将观察通过上述各种基材上培养的BAEC细胞的温度变化引起的脱着的结果示于照片。在以0.3w/v%浓度的B79-1P120被覆的基材上在37°C培养3天时，确认细胞的粘着及伸展(图6)。接着，将细胞粘着的基材在20°C进行2小时低温处理的结果，可知细胞从基材表面自发地脱去。另一方面，在PBMA被覆基材上进行同样的操作，观察细胞的粘着及伸展，未观察到低温处理引起的细胞的脱去(未表示数据)。由以上的结果认为，在基材表面导入的PIPAAm链通过LCST以下的低温处理进行水和，由此基材表面的特性变化，粘着的细胞自发地剥离。实施例3:嵌段共聚物引起的细胞举动变化的详细分析(I)PIPAAm分子链长与细胞举动的关系使嵌段共聚物中的BMA的单体单元数(重复单元数)为恒定，根据实施例1的制造法来制备使IPAAm的单体单元变化的嵌段共聚物。与实施例1同样，使TCPS被覆嵌段共聚物，考察伴随温度变化的BAEC细胞的粘着率的变化(图7)。与上述实施例2同样，伴随PIPAAm的被覆量的减少，细胞粘着率增加。另外，对于通过温度变化引起的细胞的脱着，可知在PIPAAm的被覆量低的基材(1.18 u g/cm2)中，与被覆量更高的基材(1.44、1.60、1.63 ii g/cm2)相比缓慢脱去，在被覆量高的基材(1.44、1.60、1.63 u g/cm2等)中，温度变化后，迅速脱去。(2)嵌段共聚物链长与细胞举动的关系制备链长不同的3种嵌段共聚物(B36-1P52、B79-1P120及B142-1P231)。与实施例2同样，制备将这些的嵌段共聚物被覆于TCPS的基材，其后，通过细胞粘着率来评价播种于各基材的BAEC细胞的粘着、接着评价通过温度变化引起的细胞的脱着举动的变化(图8)。使用的3种嵌段共聚物，它们的链长显著不同，TCPS上被覆的PIPAAm的量几乎没有差另IJ。另外，对于播种于各基材的细胞的粘着及脱着，未发现由于各基材的嵌段共聚物的链长引起的显著的不同。由此可以说，在通过温度变化引起的细胞的粘着及脱去的控制中，对于基材表面的PIPAAm的修饰量是重要的一个要因。(3)通过嵌段共聚物的细胞片的形成图9表示，在以PBMA-b-PIPAAm嵌段共聚物(0.3w/v%浓度的B79-1P120)被覆的基材上形成的细胞片，和通过温度 变化弓I起的细胞片的剥离后的照片。在被覆PBMA-b-PIPAAm嵌段共聚物(0.3w/v%浓度B79-1P120)的基材上于37°C培养BAEC细胞，进行培养直至形成融合后，在20°C进行保温，在维持邻接的细胞相互的细胞间结合的状态下，形成细胞片。在图10中，制备链长、单体单元及接枝量不同的各种嵌段共聚物，研究在以各嵌段共聚物被覆的基材上的细胞直至形成融合需要的时间(Period for confluent)及向20°C变化后作为细胞片直至剥离需要的时间(Cell sheet harvest at20°C )。其结果可知，PIPAAm的被覆量高(例如，1.45 u g/cm2以上)时，细胞直至形成融合需要7天以上的时间。另一方面，可知PIPAAm的被覆量低于0.8ii g/cm2时,细胞不能顺利剥离,不能形成细胞片。由以上的结果可以确信，通过使用被覆了 PBMA-b-PIPAAm的基材表面，可效率良好地实现细胞培养，以及根据温度变化的剥离培养细胞或细胞片。比较例1:利用水系溶剂的温度应答性表面的制作尝试将实施例2中使用的B79-1P120以0.lw/v%的浓度分散于水中。其结果，本聚合物没有在水中分散、不进行乳化不能得到均匀的溶液。将得到的溶液被覆TCPS基材表面，在可目视程度上可看出器材表面变得不均匀，不是本发明优选的形态。产业上的可利用性通过利用本发明的温度应答性细胞培养基材，可效率良好地培养由各组织得到的细胞。利用该培养方法，仅改变温度即可无 损伤、且效率良好地剥离培养细胞或细胞片。
权利要求
1.一种细胞培养用温度应答性基材，在基材表面被覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构，在基材表面作为温度应答性聚合物部分以0.8 3.0 i! g/cm2的比例进行被覆。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，在基材表面作为水不溶性聚合物部分以0.09 7.0 ii g/cm2的比例进行被覆。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，基材表面具有相分离结构。
4.根据权利要求1 3的任一项所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，嵌段共聚物内的温度应答性聚合物含量为30 90wt%。
5.根据权利要求1 4的任一项所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，嵌段共聚物内的温度应答性聚合物的平均分子量为3000以上。
6.根据权利要求1 5的任一项所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，温度应答性聚合物包含聚N-取代丙烯酰胺衍生物、聚N-取代甲基丙烯酰胺衍生物、它们的共聚物、聚乙烯基甲基醚的任一个或两个以上。
7.根据权利要求1 6的任一项所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，温度应答性聚合物为聚N-异丙基丙烯酰胺。
8.根据权利要求1 7的任一项所述的细胞培养用温度应答性基材，其中，基材为单独的板状、或2种以上组合的形态。
9.一种细胞培养用温度应答性基材的制造方法，其特征在于，将具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段 结合的结构的嵌段共聚物溶解或分散于有机溶剂中，通过旋转涂布将该嵌段共聚物溶液均匀地涂布于基材表面，并使其干燥。
10.根据权利要求9所述的细胞培养用温度应答性基材的制造方法，其中，嵌段共聚物是通过可逆的加成断裂链转移(RAFT)聚合得到的。
11.根据权利要求9或10所述的细胞培养用温度应答性基材的制造方法，其中，溶解嵌段共聚物的溶剂为乙腈与N，N- 二甲基甲酰胺的混合液。
12.根据权利要求11所述的细胞培养用温度应答性基材的制造方法，其中，乙腈与N，N-二甲基甲酰胺的混合溶剂的混合比例按照体积比计为5:1。
全文摘要
本发明的目的是简便地制作细胞培养用温度应答性表面，所述表面可效率良好地培养细胞，而且仅通过改变基材面的温度即可效率良好地剥离培养细胞或细胞片。本发明的细胞培养用温度应答性基材，在基材表面被覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物具有水不溶性聚合物链段与温度应答性聚合物链段结合的结构，在基材表面作为温度应答性聚合物以0.8～3.0μg/cm2的比例进行被覆。
文档编号C12M3/04GK103080295SQ20118004216
公开日2013年5月1日 申请日期2011年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者中山正道, 冈野光夫 申请人:学校法人东京女子医科大学