专利名称：藻类细胞的制备方法以及化学物质的毒性评价用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及藻类细胞的制备方法以及化学物质的毒性评价用试剂盒。
背景技术：
在使用藻类的评价化学物质的毒性的情况下，必须以用液体培养或用琼脂培养基等进行维持的细胞为基础实施原代培养(primary culture)以及继代培养(subculture)并制备藻类细胞，并将被检物质添加到制备好的藻类细胞中来进行试验。但是，维持藻类细胞或者每个试验中进行继代培养都很麻烦而不便。为了消除这种麻烦，可以利用冷冻了的藻类细胞(非专利文献I以及2等)。通过就在试验之前解冻已冷冻了的藻类细胞并利用解冻了的藻类细胞，从而可以不对藻类细胞实施继代培养而能够迅速地提供给试·验。现有技术文献专利文献专利文献1:国际公开第2005/062027号非专利文献非专利文献1:桑野和可，2002年《藻类的冷冻保存》；堀辉三 大野正夫 堀口健雄编“21世纪初的藻学的现状”；日本藻类学会，山形，108 111页非专利文献2:森史等，“国立环境研究所微生物系统保存设施之蓝藻和绿藻的冷冻保存”，Microbiol.Cult.Coll.，2002 年 6 月，45-55 页非专利文献3 J.G.Day等，“藻类的超低温保存”，分子生物学方法，38卷，冷冻保存与冷冻干燥实验指南，81-89页
发明内容
发明所要解决的技术问题作为冷冻的藻类细胞，通常使用稳定期的细胞。这是因为能够减少解冻而制备成具有生存能力的细胞的时间，而且脂质等细胞内物质作为细胞保护剂进行工作(非专利文献3)。在使用藻类的评价化学物质的毒性的方法中，作为较经济合作与发展组织(OECD)测试指南TG201所规定的抑制生长试验更迅速并且更简便的方法，本发明人已经开发了利用藻类的延迟发光的方法(专利文献I)。然而，本发明人发现:如果冷冻稳定期的藻类细胞并解冻来进行培养的话，则与冷冻前的细胞相比较生长会变得不良。细胞的生长会影响到利用延迟发光的毒性评价，所以如果使用稳定期的藻类细胞作为冷冻的藻类细胞的话，则会产生不能够进行与使用冷冻前的藻类细胞的情况相同等的毒性评价的问题。因此，有必要制备解冻后的生长良好的藻类的冷冻细胞。解决技术问题的手段本发明人为了解决上述技术问题反复作了悉心研究，发现:通过使用对数生长期(logarithmic growth phase)的细胞作为冷冻的藻类细胞,解冻后的藻类细胞能够顺利地进行繁殖，以至于完成了本发明。S卩，本发明提供一种用于利用延迟发光进行的化学物质的毒性评价的藻类细胞的制备方法，其中包括使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序。如果使对数生长期的藻类细胞冷冻，则解冻后的藻类细胞的生长将变得良好，并且能够获得与冷冻前同等强度的延迟发光的发光量。优选相对于冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.以上的粒径。另外，优选冷冻的藻类细胞的粒径分布曲线显示双峰分布。通过使用像这样的藻类细胞，解冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好，对于延迟发光来说也将变得容易获得与冷冻前同等的强度的发光量。另外，优选在使用以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作为冷冻的藻类细胞的情况下，相对于所冷冻的藻类细胞总数，55%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。另外，优选在使用以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻的情况下，相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。在使用以株号NIES-35被保存的绿藻的情况下，通过使用如以上所述的粒径分布的藻类细胞，解冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好。另外，优选在使用以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)中的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作为冷冻的藻类细胞的情况下，相对于冷冻的藻类细胞的总数，46%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。另外，优选在使用以ATCC编号22662被保存于美国典 型培养物保藏中心的绿藻的情况下，相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。在使用以ATCC编号22662被保存的绿藻的情况下，通过使用如以上所述的粒径分布的藻类细胞，解冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好。另外，本发明的方法优选在使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序之前，进一步包括:在培养液中培养对数生长期的藻类细胞的工序，离心分离含有该藻类细胞的培养液的工序，以及从藻类细胞中完全除去由离心分离分离出的培养上清液的工序。通过从藻类细胞中完全除去培养上清液，从而减少冷冻、解冻对延迟发光图形的影响，并且容易获得与冷冻前的细胞同等的延迟发光图形。再有，本发明的方法优选包括在-80°C以下的温度下维持被冷冻的所述对数生长期的藻类细胞的工序。通过在_80°C以下的温度下进行维持，从而就能够防止冷冻中的细胞发生损伤，并且冷冻后的藻类细胞的生长将变得更为良好。另外，本发明是提供一种包含被冷冻的对数生长期的细胞的利用延迟发光的化学物质毒性评价用的试剂盒。通过使用这样的试剂盒，从而就能够简易而且迅速地进行利用延迟发光的化学物质的毒性评价。优选相对于所述被冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.5 y m以上的粒径，另外，优选藻类细胞的粒径分布曲线显示双峰分布。
另外，优选包含于上述毒性评价试剂盒中的被冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相对于被冷冻的藻类细胞总数，55%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径，优选相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。另外，优选包含于上述毒性评价试剂盒中的被冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata),相对于被冷冻的藻类细胞的总数，46%以上的藻类细胞具有显示双峰分布的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径，优选相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，显示双峰分布的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。另外，包含于上述毒性评价试剂盒中的被冷冻的藻类细胞优选由包括以下工序的方法进行制备:在培养液中培养对数生长期的藻类细胞的工序，离心分离含有该藻类细胞的培养液的工序，从藻类细胞中完全除去由离心分离分离出的培养上清液的工序，以及冷冻余下的藻类细胞的工序。另外，包含于上述毒性评价试剂盒中的藻类细胞优选在-80°C以下的温度下被维持。发明的效果根据本发明的藻类细胞的制备方法，因为冷冻以及解冻之后的藻类细胞的繁殖良好，所以在进行利用延迟发光的化学物质的毒性评价的时候，能够与冷冻前的藻类细胞同样地进行使用。再有，根据本发明的利用延迟发光的化学物质的毒性评价用试剂盒，能够简易而且迅速地进行化学物质的毒性评价。
图1是表示对数生长期的绿藻细胞(实施例1)的冷冻以及解冻后的生长曲线的图。图2是表示稳定期的绿藻细胞(比较例I)的冷冻以及解冻后的生长曲线的图。图3是表示对数生长期的冷冻和解冻了的绿藻细胞(实施例1)以及没有冷冻的绿藻细胞的延迟发光的发光图形的图。图4是表示对数生长期的冷冻和解冻了的绿藻细胞(实施例2)以及没有冷冻的绿藻细胞的延迟发光的发光图形的图。图5是表示NIES-35株的细胞(A)的粒径分布曲线的图。图6是表示NIES-35株的细胞(B)的粒径分布曲线的图。图7是表示NIES-35株的细胞(C)的粒径分布曲线的图。图8是表示NIES-35株的细胞(D)的粒径分布曲线的图。图9是表示培养了 NIES-35株的细胞(A) (D)的活细胞之后的各个的颗粒数的图。图10是表示培养了 NIES-35株的细胞(A) (D)的活细胞之后的各个的延迟发光的发光量的图。图11是表示ATCC-22662株的细胞(H)的粒径分布曲线的图。
图12是表示ATCC-22662株的细胞(I)的粒径分布曲线的图。图13是表示ATCC-22662株的细胞(J)的粒径分布曲线的图。图14是表示ATCC-22662株的细胞(K)的粒径分布曲线的图。图15是表示ATCC-22662株的细胞(L)的粒径分布曲线的图。图16是表示ATCC-22662株的细胞(M)的粒径分布曲线的图。图17是表示培养了 ATCC-22662株的细胞(H) (M)的活细胞之后的各个的颗粒数的图。图18是表示培养了 ATCC-22662株的细胞(H) (M)的活细胞之后的各个的延迟发光的发光量的图。图19是表示冷冻和解冻的绿藻(比较例2)以及没有冷冻的绿藻的颗粒数的图。图20是表示冷冻和解冻的绿藻(比较例2)以及没有冷冻的绿藻的菌落存活率的图。图21是表示冷冻和解冻的绿藻(比较例2)以及没有冷冻的绿藻的延迟发光的发光图形的图。图22是表示冷冻和解冻 的绿藻(比较例2)以及没有冷冻的绿藻的发光量(累计值)的图。图23是表示冷冻和解冻的绿藻(实施例5)以及没有冷冻的绿藻的延迟发光的发光图形的图。图24是表示冷冻和解冻的绿藻(实施例5)以及没有冷冻的绿藻的发光量(累计值)的图。图25是说明使用了比较例2所涉及的藻类的评价化学物质的毒性的方法的流程图。图26是说明使用了实施例5所涉及的藻类的评价化学物质的毒性的方法的流程图。
具体实施例方式以下适当参照附图并就 用于实施本发明的方式进行详细的说明。在本发明的制备方法中包括使对数生长期的藻类细胞冷冻。更为具体地来说，将藻类细胞培养至对数生长期，并回收培养的藻类细胞，冷冻保存所回收的藻类细胞。被冷冻保存的藻类细胞被解冻并被用于利用延迟发光的化学物质的毒性评价中。在本说明书中，所谓“对数生长期”，是指藻类细胞每一定时间分裂而增殖并且细胞数相对于时间成对数增殖的时期。另外，所谓“稳定期”，是指分裂率和死亡率基本达到平衡并且细胞数基本成为一定的时期。作为能够使用于本发明的藻类细胞，例如可以使用绿藻(PseudokirchnerielIasubcapitata (原名 Selenastrum capricornutum)、Desmodesmus subspicatus (原名 Scenedesmus subspicatus))、 蓝藻(Anabaena flos-aquae、 SynechococcusIeopoliensis)、娃藻(Navicula pelliculosa)等藻类的细胞。作为一个例子，绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)可以使用以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所(National Institute for Environmental Studies)的绿藻(以下根据情况会称其为“NIES-35株”)、或者、以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)的绿藻(以下根据情况会称其为“ATCC-22662株”)。被保存于这些机构的株在个体之间性质的差异小且稳定，所以优选。对于将藻类细胞培养至对数生长期来说，可以使用标准的方法。例如，在使用绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)作为藻类细胞的情况下，可以通过在温度为25±0.5°C以及照明度为50 55iimol -m^2 -s^1的条件下使用C (75)培养基以及OECD培养基等培养液，将稳定期的细胞制备成初始细胞密度I X IO4细胞/毫升并培养70 73小时，从而获得对数生长期的细胞。可以通过使用颗粒测量装置(CDA-500)在一定期间内对所获得的细胞实施3次以上细胞数测量，并将细胞数相对于培养时间进行对数表示来制作生长曲线，通过该生长曲线基本成为直线可以确认是对数生长期的细胞。可以以细胞的粒径作为指标来判断所培养的对数生长期的藻类细胞之中作为用于本发明的方法的细胞群而优选的细胞群。在本发明的方法中，优选使细胞的粒径大的细胞冷冻。具体是，在将所冷冻的藻类细胞的数量作为100%的时候，即相对于所冷冻的藻类细胞的总数，具有4.5 以上大小的粒径的藻类细胞的数量优选为50%以上，进一步优选为53%以上，更加优选为57%以上。还有，在本说明书中，所谓藻类细胞的“粒径”，是指由电感应区方式的粒度分布测定装置计算出的藻类细胞的直径。另外，所冷冻的藻类细胞的粒径分布曲线优选显示双峰分布。所谓双峰分布是指呈现2个大峰的双相性分布。像这样的对于冷冻来说优选的细胞可以根据由细胞数测量而获得的数据来确认。对于如以上所述使用双峰的粒径分布的藻类细胞来说，被认为具有以下所述那样的意义。进行冷冻的时候的细胞的状态会较大地影响到解冻后的细胞生长。为了使从冷冻保存状态解冻了的细胞迅速地进行对数生长，优选所冷冻的细胞群为被分成两个细胞群、即细胞分裂前的大细胞群和刚刚细胞分裂后的小细胞群的状态。即，被分成两个群体是表示细胞分裂正处于活跃的状态。再有，可以将谷值的粒径作为指标来判断在显示双峰的粒径分布的藻类细胞中更优选的细胞群。还有，在本说明 书中所谓“谷值的粒径”，是指双峰分布的粒径分布曲线上的2个峰之间的细胞数变成极小的粒径。谷值的粒径优选不过分大。所谓谷值大，则表示粒径尺寸小的细胞群的比例大，即，表示细胞群的细胞生长发生降低的状态。作为其原因，例如可以列举:生物质生产所必需的营养盐、光能以及二氧化碳等伴随着细胞的增加而不足、消耗等。在细胞生长发生降低的状态下进行冷冻也会有细胞在解冻后难以立即进行对数生长的倾向。因此，优选谷值的粒径不要过大。具体是谷值的粒径优选为大约4 5pm。使用NIES-35株作为藻类细胞的情况也优选粒径分布曲线显示双峰分布。再有，在将所冷冻的藻类细胞的数量作为100%的时候，即相对于所冷冻的藻类细胞的总数，具有双峰的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径的细胞数量优选为55%以上，更加优选76%以上。另外，在使用NIES-35株作为藻类细胞的情况下，在将粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之总和作为100%的时候，即相对于该总和，双峰的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数优选为50%以上，更加优选为72%以上。还有，在本说明书中，所谓“峰处的细胞数”,是指在将峰的粒径作为Pum的时候的具有P±0.02 ii m大小的粒径的细胞的数量。另外，在使用NIES-35株的情况下，谷值优选为小于4.52 u m，进一步优选为
4.40 u m以下,更加优选为4.12 ii m以下。
使用ATCC-22662株作为藻类细胞的情况下，也是优选粒径分布曲线显示双峰分布。再有，在将所冷冻的藻类细胞的数量作为100%的时候，即相对于所冷冻的藻类细胞的总数，具有双峰的粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径的细胞数量优选为46%以上，更加优选为48%以上。另外，在使用ATCC-22662株作为藻类细胞的情况下，在将粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之总和作为100%的时候，即相对于该总和，双峰的粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数优选为37%以上，更加优选为41%以上。另外，在使用ATCC-22662株的情况下，谷值优选为小于4.87 u m,更加优选为4.78 y m以下。还有，使用NIES-35株作为藻类细胞的情况和使用ATCC-22662株作为藻类细胞的情况都可以用上述说明以外的各种各样的方法来判断是否是对于用于本发明的方法来说优选的细胞群。例如，在粒径分布曲线显示双峰分布的情况下，可以将大于谷值粒径的细胞作为“大细胞”并将小于谷值的细胞作为“小细胞”，从而分成两个群体，用“大细胞”和“小细胞”来比较将规定粒径与在该规定粒径下的细胞数累积而得到的值(粒径X细胞数)的每一个群体的积分值(以下称之为“·特征值”)，判断是否为优选的细胞群。还有，所谓“在规定粒径下的细胞数”，是指在将规定粒径作为Qum的时候的具有Q±0.02 ii m大小的粒径的细胞的数量。在将“大细胞”与“小细胞”的特征值的总和作为100%的时候，即相对于该总和，“大细胞”的特征值在NIES-35株的情况下优选为64%以上，在ATCC-22662株的情况下优选为53%以上。另外，同样，可以在粒径分布曲线显示双峰分布的情况下，将大于谷值粒径的细胞作为“大细胞”并将小于谷值的细胞作为“小细胞”，从而分成两个群体，用“大细胞”和“小细胞”来比较峰处的粒径与在该峰处的细胞数的累积值(峰粒径X细胞数，以下称之为“特征量代表值”)，判断是否为优选的细胞群。在将“大细胞”与“小细胞”的特征量代表值比的总和作为100%的时候，即相对于该总和，“大细胞”的特征量代表值比在NIES-35株的情况下优选为61%以上，在ATCC-22662株的情况下优选为43%以上。另外，根据所使用的藻类细胞的表面积或者藻类细胞的体积也可以判断对于本发明的方法来说是否为优选的细胞群。例如，在藻类细胞的表面积为已知的情况下，根据
权利要求
1.一种藻类细胞的制备方法，其特征在于: 用于利用延迟发光来评价化学物质的毒性， 包括使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于: 相对于所述冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.5 y m以上的粒径。
3.按权利要求1或者2所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细 胞的粒径分布曲线显示双峰分布。
4.按权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述所冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于所述冷冻的藻类细胞的总数，55%以上的藻类细胞具有所述粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。
5.按权利要求3或者4所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，所述粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。
6.按权利要求3所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于所述冷冻的藻类细胞总数，46%以上的藻类细胞具有所述粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。
7.按权利要求3或者6所述的方法，其特征在于: 所述冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，所述粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。
8.按权利要求1 7中的任意一项所述的方法，其特征在于: 在使所述对数生长期的藻类细胞冷冻的工序之前，进一步包括: 在培养液中培养所述对数生长期的藻类细胞的工序， 离心分离含有所述藻类细胞的所述培养液的工序，以及 从所述藻类细胞中完全除去由所述离心分离所分离出的培养上清液的工序。
9.按权利要求1 8中的任意一项所述的方法，其特征在于: 进一步包括在_80°C以下的温度下维持被冷冻的所述对数生长期的藻类细胞的工序。
10.一种试剂盒，其特征在于: 是用于利用延迟发光来评价化学物质的毒性的试剂盒，其中包含被冷冻的对数生长期的藻类细胞。
11.按权利要求10所述的试剂盒，其特征在于: 相对于所述被冷冻的藻类细胞的总数，50%以上的藻类细胞具有4.5 i! m以上的粒径。
12.按权利要求10或者11所述的试剂盒，其特征在于: 所述被冷冻的藻类细胞的粒径分布曲线显示双峰分布。
13.按权利要求12所述的试剂盒，其特征在于: 所述被冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata)， 相对于所述被冷冻的藻类细胞的总数，55%以上的藻类细胞具有所述粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。
14.按权利要求12或者13所述的试剂盒，其特征在于: 所述被冷冻的藻类细胞是以株号NIES-35被保存于日本国立环境研究所的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，所述粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为50%以上。
15.按权利要求12所述的试剂盒，其特征在于: 所述被冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于所述被冷冻的藻类细胞的总数，46%以上的藻类细胞具有所述粒径分布曲线上的谷值粒径以上大小的粒径。
16.按权利要求12或者15所述的试剂盒，其特征在于: 所述被冷冻的藻类细胞是以ATCC编号22662被保存于美国典型培养物保藏中心的绿藻(Pseudokirchneriella subcapitata), 相对于粒径小的峰处的细胞数与粒径大的峰处的细胞数之和，所述粒径分布曲线的粒径大的峰处的细胞数为37%以上。
17.按权利要求10 16中的任意一项所述的试剂盒,其特征在于: 所述被冷冻的藻类细胞由包括以下所述工序的方法进行制备: 在培养液中培养对数生长期的藻类细胞的工序， 离心分离含有所述藻类细胞的所述培养液的工序， 从所述藻类细胞中完全除去由所述离心分离所分离出的培养上清液的工序，以及 冷冻余下的所述藻类细胞的工序。
18.按权利要求10 17中的任意一项所述的试剂盒,其特征在于: 所述藻类细胞被维持在_80°C以下的温度下。
全文摘要
本发明提供了一种藻类细胞的制备方法，用于利用延迟发光来评价化学物质的毒性，其中包括使对数生长期的藻类细胞冷冻的工序。
文档编号C12R1/89GK103097544SQ201180043478
公开日2013年5月8日 申请日期2011年7月14日 优先权日2010年9月8日
发明者数村公子, 竹内彩乃, 胜又政和 申请人:浜松光子学株式会社