专利名称：含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法
技术领域：
本发明涉及L-半胱氨酸等含硫氨基酸或其关联物质的制造方法，具体涉及适于含硫氨基酸或其关联物质的制造的细菌、以及使用该细菌的含硫氨基酸或其关联物质的制造方法。含硫氨基酸及其关联物质可用于医药品、化妆品以及食品领域。
背景技术：
L-半胱氨酸通常通过从例如毛发、角和羽毛等含有角蛋白质的物质中提取而获得，或者使用微生物酶转化前体DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸通过而获得。此外，还计划使用新型酶通过固定化酶方法大规模生产L-半胱氨酸。此外，还尝试通过使用微生物的发酵来生产L-半胱氨酸。作为具有生产L-半胱氨酸能力的微生物，已知有例如胞内丝氨酸乙酰转移酶活性增加的棒状杆菌型细菌(专利文献I)。还已知一种通过并入削弱了 L-半胱氨酸反馈抑制的突变型丝氨酸乙酰转移酶增加L-半胱氨酸生产能力的技术(专利文献2 4)。此外，作为通过抑制起分解L-半胱氨酸作用的系统来提高L-半胱氨酸生产能力的微生物，已知削弱或缺失了胱硫醚-β-裂合酶(专利文献2)、色氨酸酶(专利文献5)或O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B (专利文献6)的活性的棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属(Escherichia)细菌。此外，已知编码YdeD蛋白的ydeD基因参与了 L-半胱氨酸途径代谢产物的分泌(非专利文献I)。此外，还已知通过增加mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex 基因、bmr 基因或 qacA 基因( 专利文献 7),或 emrAB、emrKY、yo jIH、acrEF、bcr 或 cusA基因的表达来提高L-半胱氨酸生产能力(专利文献8)的技术，这些基因座/基因编码适于从细胞分泌细胞毒性物质的蛋白质。
此外，作为L-半胱氨酸生产菌，还已知cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子的活性增加的大肠杆菌(Escherichia coli)(专利文献9)。此外，还已知削弱了丝氨酸反馈抑制的编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA，并且提出通过将该突变型serA用于通过大肠杆菌进行的L-半胱氨酸生产(专利文献10和 11)。此外，甲硫氨酸在工业上主要是通过化学合成以DL体的形式制造。在必需L体的情况下，通过将DL体乙酰基化为N-乙酰基-DL-甲硫氨酸，再采用酶法仅将L体脱乙酰基化来制造。而且，也尝试了通过使用微生物的发酵方法来进行L-甲硫氨酸的生产。作为L-甲硫氨酸生产菌，已知有:L-甲硫氨酸生物合成系统的阻遏物缺损、细胞内的高丝氨酸转琥珀酰基酶活性增强、且细胞内的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性弱化、显示L-苏氨酸营养缺陷性、细胞内的胱硫醚Y -合酶活性以及天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性增强的大肠杆菌(专利文献12)等。yeeE基因作为编码推定涉及跨膜的蛋白质(putative transport systempermease protein)的基因在数据库EcoCyc (非专利文献2)中登录。此外，使用膜蛋白质预测程序 SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)进行解析，预测YeeE为9次跨膜型膜蛋白质。因而，推定其为某种转运子，但其实际功能不明，也未知其与含硫氨基酸生产的关系。此外，有报告称，yeeE基因在下述条件时上调:镉(非专利文献3)、锌(非专利文献4)、C0释放剂C0RM-2 (非专利文献5)、RpoE依赖性地在稳定期早期(非专利文献6)、以及人体温37°C的温度条件(非专利文献7)。此外，有报告称，其因乙酸(非专利文献8)、熊果酸(非专利文献9)，或者在IHF(-)株中(非专利文献10)下调。然而，上述均是仅仅作为在微阵列实验中表达有变化的众多基因中的一个而列举，并未提示与含硫氨基酸生产的关系。现有技术文献专利文献专利文献1:特开2002-233384号公报专利文献2:特开平11-155571号公报专利文献3:美国专利申请公开第20050112731号专利文献4:美国专利第6218168号专利文献5:特开2003-169668号公报专利文献6:特开2005-245311号公报专利文献7:美国专利第5972663号专利文献8:特开2005-287333号公报专利文献9:国际公开小册子第01/27307号专利文献10:美国专利第5856148号专利文献11:美国专利申请公开第20050009162号专利文献12:美国专利第7611873号非专利文献非专利文献I:Dassler et al.，Mol.Microbiol.36，1101-1112 (2000)非专利文献2:BioCyc Home Page, Escherichia coli K_12substr.MG1655Gene:yeeE[平成 22 年 7 月 13 日检索]、互联网〈http://biocyc.0rg/ECOLI/NEff-1MAGE *type=GENE&object=EG11895>非专利文献3:Kerstin et al.，J.Bacteriol.，Aug2008 ； 190:5439-5454非专利文献4:Kaneyoshi et al.，J.Bacteriol.，Sep2005 ； 187:6333-6340非专利文献5:Ligia S.Nobre et al., Microbiology, Mar2009 ; 155:813-824非专利文献6:Md.Shahinur Kabir et al., Microbiology, Aug2005 ； 151:2721-2735.
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非专利文献10 =Stuart M.Arfin et al.，J.Biol.Chem.，S印2000 ；275:29672发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题是开发提高细菌的生产含硫氨基酸的能力的新技术，提供含硫氨基酸生产菌、以及使用该细菌的含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物的制造方法。解决问题的方法本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现:通过对细菌进行修饰而增强yeeE基因编码的蛋白质的活性，能够提高生产含硫氨基酸的能力，从而完成了本发明。即，本发明如下。(I)具有生产含硫氨基酸的能力、且经过修饰而增强了 yeeE基因编码的蛋白质的活性的属于肠杆菌科的细菌。(2)所述细菌，其中，通过增大yeeE基因的表达量、或增大yeeE基因的翻译量，增强所述蛋白质的活性。(3)所述细菌，其中，通过提高yeeE基因的拷贝数、或修饰该基因的表达调控序列，增大yeeE基因的表达量。(4)所述细菌，其中，所述蛋白质是下述㈧或⑶所述的蛋白质。(A)由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(B)具有在SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列中，包含I个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且增强在细胞内的活性时生产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质。(5)所述细菌，其中，所述yeeE基因是下述(a)或(b)所述的DNA。(a)由SEQ ID NO: 13所示的碱基序列组成的DNA、或(b)能够在严格条件下与SEQ ID NO:13所示的碱基序列的互补碱基序列或能够由该喊基序列制备的探针杂交，且编码增强在细胞内的活性时生广含硫氣基酸的能力提闻的蛋白质的DNA。(6)而且，所述细菌，具有下述性质中的至少任意一个。i)经过修饰而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性。ii)经过修饰而提高了 ydeD基因的表达。iii)经过修饰而提高了 3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。(7)所述细菌，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。(8)所述细菌，其中，所述细菌是大肠杆菌。(9)所述细菌,其中,所述细菌是泛菌属细菌。(10)所述细菌，其中，所述细菌是Pantoea ananatis。(11)含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物的制造方法，其中，将所述细菌在培养基中进行培养，并从该培养基收集含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物。(12)所述方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸。(13)所述方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸，所述关联物质是胱氨酸或噻唑烷衍生物。发明效果
根据本发明，能够提高细菌的生产含硫氨基酸的能力。此外，根据本发明，高效率地制造含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物。
[图1]显示野生型nlpD启动子(Pnlp:SEQ ID NO:15)、以及突变型nlpD启动子(Pnlp8:SEQ ID NO:16)与yeaS基因的连接位点的序列的图。发明的
具体实施例方式〈1>本发明的细菌本发明的细菌是具有生产含硫氨基酸的能力，且经过修饰使得增强了 yeeE基因编码的蛋白质的活性的属于肠杆菌科的细菌。作为含硫氨基酸，可以列举出L-半胱氨酸以及L-甲硫氨酸，优选L-半胱氨酸。此夕卜，本发明的细菌可以具有L-半胱氨酸以及L-甲硫氨酸这两者的生产能力。此外，在本发明中，含硫氨基酸是指:游离体的含硫氨基酸或其盐、或它们的混合物。作为盐,可以列举出例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。这里，生产含硫氨基酸的能力是指:当在培养基中培养本发明的细菌时，在培养基中或者菌体内生成含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物，并且蓄积达到可以从培养基中或者菌体回收的水平的能力。此外，具有生产含硫氨基酸的能力的细菌是指:与野生株或者亲本株相比可以生产更多量的含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物并使其在培养基中蓄积的细菌，优选可以生产并在培养基中蓄积0.05g/L以上，更优选为0.lg/L，特别优选为0.2g/L以上的量的含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物的细菌。在含硫氨基酸为L-半胱氨酸的情况下，有时细菌产生的L-半胱氨酸在培养基中通过二硫键部分转化为L-胱氨酸。此外，有时L-半胱氨酸通过和培养基中含有的硫代硫酸反应生成 S-磺酸半胱氨酸(Szczepkowski T.ff.，Nature, vol.182(1958))。进一步,细菌的细胞内生成的L-半胱氨酸有时还和细胞中存在的酮或醛，例如与丙酮酸缩合，以硫代半酮缩醇(hemithioketal)为中间体生成噻唑烧(thiazolidine)衍生物(参考日本专利第2992010号)。这些噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇有时作为平衡混合物存在。此外，L-半胱氨酸可以用作Y -谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸等的生物合成起始物质。因此，通过使用除了具有L-半胱氨酸生产能力之外、还具有产生这些化合物的能力的细菌，能够制造这些化合物。在本发明中，L-半胱氨酸生产能力不限于在培养基中或菌体内仅蓄积L-半胱氨酸的能力，包括在培养基中蓄积L-半胱氨酸、L-胱氨酸、如所述的L-半胱氨酸的衍生物 (例如S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、硫代半酮缩醇)、或经由如所述的L-半胱氨酸生产的其他化合物(例如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸)、或它们的混合物的能力。此外，在本发明中，L-胱氨酸、如所述的L-半胱氨酸的衍生物、以及经由如所述的L-半胱氨酸生产的其他化合物统称为L-半胱氨酸的关联物质。L-甲硫氨酸是以L-半胱氨酸作为起始物质之一生物合成的含硫氨基酸。此外，L-甲硫氨酸可用作S-腺苷甲硫氨酸等的生物合成起始物质。因此，在含硫氨基酸为L-甲硫氨酸的情况下，通过使用除了 L-甲硫氨酸生产能力之外、还具有生产S-腺苷甲硫氨酸等的能力的细菌，能够制造S-腺苷甲硫氨酸等。在本发明中，L-甲硫氨酸生产能力不限于在培养基中或菌体内仅蓄积L-甲硫氨酸的能力，包括在培养基中蓄积L-甲硫氨酸、或经由L-甲硫氨酸生产的其他化合物(例如S-腺苷甲硫氨酸)、或它们的混合物的能力。在本发明中，如所述的经由L-甲硫氨酸生产的其他化合物称为L-甲硫氨酸的关联物质。在本发明中，生产含硫氨基酸的能力是指:在培养基中蓄积L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的关联物质、L-甲硫氨酸、或L-甲硫氨酸的关联物质、或它们的混合物的能力。此外，在本发明中，L-半胱氨酸的关联物质与L-甲硫氨酸的关联物质也统称为含硫氨基酸的关联物质。作为具有生产含硫氨基酸的能力的细菌，可以是天然具有生产含硫氨基酸的能力，也可以对诸如下述的细菌采用突变法、重组DNA技术进行修饰而使其具有生产含硫氨基酸的能力。对本发明中使用的细菌没有特殊限制，只要是属于如埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属(Morganella)等的肠杆菌科，并且具有生产L-氨基酸的能力的细菌即可。具体地，可以使用按照NCBI (美国国家生物技术信息中心，National Center for BiotechnologyInformation)数据库中使用的分类归入肠杆菌科的细菌(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi id=91347)。作为用于修饰的属于肠杆菌科的亲本株，期望使用埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、或克雷伯氏菌属细菌。尽管对于埃希氏菌属细菌没有特别限制，但是具体而言，可以使用Neidhardt等的著作(Backmann, B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutant derivativesof Escherichia coli K-12, p.2460-2488.Tablel.1n F.D.Neidhardt(ed.), Escherichiacoli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, AmericanSociety for Microbiology Press, Washington, D.C.)中记载的细菌。在这些细菌中，例如可使用大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例包括源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌W3110(ATCC27325)和大 肠杆菌 MG1655 (ATCC47076)等。这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852P.0.Boxl549, Manassas, VA20108,United States of America)获得。即，对每种菌株都给予了登录号，并且可以使用这些登录号订购菌株(参考http://WWW.atcc.0rg/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了各菌株的登录号。肠杆菌属细菌的实例可以包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。作为肠杆菌属的代表性株,可以列举出成团肠杆菌ATCC12287株。此外，具体地，可以使用欧洲专利申请公开952221号说明书中示例的菌株。作为泛菌属细菌，可以列举出例如Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、梓樣泛菌(Pantoea citrea)。Pantoea ananatis 的具体实例包括Pantoea ananatis AJ13355 株、SC17 株。SC17株是以作为低PH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株从静网县磐田市的土壤中分离出来的菌株AJ13355(FERM BP-6614)为起始，作为粘液质低生产突变株选择出来的菌株(美国专利第6，596，517号)。Pantoea ananatis AJ13355株于平成10年2月19日在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名称:产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址:邮政编码305-8566茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)保藏，保藏号FERM P-16644，并于平成11年I月11日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERMBP-6614。此外，Pantoea ananatis SC17株于平成21年2月4日在产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码305-8566茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)保藏，保藏号FERM BP-11091。而且,Pantoea ananatis AJ13355株在分离时被鉴定为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans),并当作成团肠杆菌AJ13355进行了保藏。但是,近年来，基于16S rRNA碱基序列分析等,其被重新分类为Pantoea ananatis。作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora),作为克雷伯氏菌属细菌,可以列举出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。而且，特别是，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为Y-变形细菌(Y -Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(JGenAppl Microbiol1997Dec ;43(6)355-361, International Journal of SystematicBacteriology, Oct.1997, pl061_1067)。近年来，依据DNA-DNA杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)或分散泛菌(Pantoeadispersa)等(International Journal of Systematic Bacteriology, Julyl989 ；39(3).p.337-345)。此外，属于欧文氏菌属的细菌中，有些被重新分类为菠萝泛菌(Pantoeaananas)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(参照 International Journal of SystematicBacteriology, Janl993 ；43 (I), p.162-173)。在本发明中，只要分类为肠杆菌科即可,可以属于肠杆菌属、泛菌属或欧文氏菌属等。以下，针对赋予属于肠杆菌科的细菌生产含硫氨基酸的能力的方法、或增强这些细菌的生产含硫氨基酸的能力的方法进行说明。为了向细菌赋予生产含硫氨基酸的能力，可以使用在棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等的选育中常规使用的方法，这些方法包括获取营养缺陷型突变株、类似物抗性菌株或代谢调节突变株，或创建含硫氨基酸生物合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见《7 ^ 7酸発酵》，(株)学会出版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这里，在含硫氨基酸生产菌的选育中，可以赋予上述性质例如营养缺陷性、类似物抗性和代谢调节突变中的一种、两种或者三种以上。此外，表达被增强的含硫氨基酸生产菌生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另外，可以将例如营养缺陷性、类似物抗性和代谢调节突变等性质的赋予与生物合成系统酶的增强组合进行。具有生产含硫氨基酸的能力的营养缺陷突变体菌株、含硫氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变株可如下获得:对亲本菌株或野生型菌株施以常规诱变处理，例如暴露于X-射线或紫外线照射或用诱变剂例如N-甲基-N’ -硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等处理；其后，从所得的突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有生产含硫氨基酸的能力的菌株。以下，针对赋予属于肠杆菌科的细菌生产含硫氨基酸的能力的方法、或增强这些细菌的生广含硫氣基酸的能力的方法、以及具有生广含硫氣基酸的能力的细菌进行具体不例。L-半胱氨酸生产能力的赋予或增强 、以及L-半胱氨酸生产菌
通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶，或，与生成如L-丝氨酸等作为该途径的底物的化合物相关的酶，例如，3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸乙酰转移酶等的活性，可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。3-磷酸甘油酸脱氢酶受到丝氨酸的反馈抑制，通过使细菌携带有编码该反馈抑制被削弱或消除了的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因，可以增强该酶的酶活性。此外，丝氨酸乙酰转移酶受到L-半胱氨酸的反馈抑制。因此，通过使细菌携带有编码该反馈抑制被削弱或消除了的丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE基因，可以增强该酶的酶活性。此外，L-半胱氨酸生产能力还可以通过提高编码YdeD蛋白的ydeD基因(Dabler等，Mol.Microbiol.，36，1101-1112 (2000))、或者编码 YfiK 蛋白的 yfiK 基因(特开
2004-49237)、或者编码YeaS蛋白的yeaS基因(欧洲专利申请公开第1016710号说明书)的表达而增强。L-半胱氨酸生产菌优选具有下述性质中的至少任意一个。i)经过修饰而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性。ii)经过修饰而提·高了 ydeD基因的表达。iii)经过修饰而提高了 3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。此外，通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性，也可以提高L-半胱氨酸的生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的蛋白质群由cysPTWAM基因簇编码(特开
2005-137369号公报，EP1528108 号说明书)。L-半胱氨酸生产菌的实例可以列举出但不限于:用编码反馈抑制抗性的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多种cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15菌株(美国专利第6，218，168号)，具有编码适于分泌细胞毒性物质的蛋白质的过表达基因的大肠杆菌W3110菌株(美国专利第5,972,663号)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(日本特开平11-155571号公报)，和由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控因子活性增加的大肠杆菌W3110菌株(W001/27307)等属于埃希氏菌属的菌株；以及，具有含ydeD基因、突变型cysE基因和突变型serA5基因的质粒pACYC_DES的大肠杆菌(日本特开 2005-137369 号公报(US20050124049 (Al) ,EP1528108 (Al)))等。pACYC-DES为通过将上述三种基因插入PACYC184所得到的质粒，每个基因的表达通过PompA启动子调控。作为具有大肠杆菌的半胱氨酸脱巯基酶活性的蛋白质，已知胱硫醚裂合酶(metC产物，日本特开平11-155571号公报，Chandra等，Biochemistry,21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 产物，日本特开 2003-169668 号公报，Austin Newton等，J.Biol.Chem.，240 (1965) 1211-1218))、0_乙酰丝氨酸硫化氢解酶B (cysM基因产物，H本特开2005-245311号公报)和maH基因产物(日本特开2005-245311)。通过降低这些蛋白质的活性提高L-半胱氨酸生产能力。在本发明中，L-半胱氨酸生产菌优选具有对反馈抑制有抗性的突变型SAT。作为衍生自大肠杆菌的且对反馈抑制有抗性的突变型SAT，具体已知用谷氨酸残基取代第256位的甲硫氨酸的突变型SAT (日本特开平11-155571号公报)、用异亮氨酸残基取代第256位的甲硫氛酸残基的突变型 SAT(Denk, D.and Boeck, A.，J.general Microbiol., 133,515-525 (1987))、在第97位氨基酸残基至第273位氨基酸残基的区域具有突变或者缺失从第227位的氨基酸残基开始的C端区域的突变型SAT(国际专利公开W097/15673，美国专利6，218，168)、对应于野生型SAT第89至96位的氨基酸序列含有一个或多个突变并且对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的突变型SAT(美国专利公开申请20050112731 (Al))、SAT第95和96位的Val残基和Asp残基分别用Arg残基和Pro残基取代的突变型SAT (突变型基因的名称:cysE5，W02005/007841)、在第167位的苏氨酸残基用丙氨酸残基取代的突变(美国专利公开6，218，168，美国专利公开申请20050112731 (Al))，等等。SAT基因不限于大肠杆菌的基因，而是可以使用编码具有SAT活性的蛋白质的任何基因。例如，已知对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的拟南芥(Arabidopsisthaliana)的SAT同工酶，也可以使用编码该同工酶的基因(FEMS Microbiol.Lett.，179，453-459(1999))。通过在细菌中导入编码SAT的基因、特别是编码反馈抑制抗性的突变型SAT的基因并使之表达，能够赋予或增强L-半胱氨酸生产能力。此外，通过提高编码SAT等蛋白质的基因的拷贝数，能够提高这些蛋白质的活性。以L-半胱氨酸作为起始物质生物合成的Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、以及高半胱氨酸等化合物的生产能力，也可以通过增强目的化合物的生物合成途径的酶活性，或者降低从该生物合成途径分支出来的途径的酶或分解目的化合物的酶的活性来赋予或增强。例如，Y-谷氨酰半胱氨酸生产能力可以通过Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的增强和/或谷胱甘肽合成酶活性的降低来增强。此外，谷胱甘肽生产能力可以通过Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性的增强来赋予或增强。此外，通过使用对谷胱甘肽的反馈抑制有抗性的突变型Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶，也可以增强Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽的生产能力。关于谷胱甘肽的生产，在Li等的综述(Yin Li,GongyuanWei, Jian Chen.Appl Microbiol Biotechnol (2004)66:233-242)中有详细记载。胱硫醚、高半胱 氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途径的中间体，为了增强这些物质的生产能力，部分利用后述的增强L-甲硫氨酸的生产能力的方法是有效的。作为增强胱硫醚生产能力的具体的方法，已知有使用甲硫氨酸营养缺陷性突变株的方法(特愿2003-010654)、在发酵培养基中添加半胱氨酸(或其生物合成原料)和/或高丝氨酸(或其生物合成原料)的方法(特开2005-168422)。高半胱氨酸以胱硫醚作为前体，因而为了增强高半胱氨酸生产能力，增强胱硫醚生产能力的上述方法也是有效的。L-甲硫氨酸生产能力的赋予或增强、以及L-甲硫氨酸生产菌生产L-甲硫氨酸的能力可以通过赋予L-苏氨酸营养缺陷性或正亮氨酸抗性而赋予或提高(日本特开2000-139471号)。在大肠杆菌中，L-苏氨酸的生物合成中涉及的酶的基因作为苏氨酸操纵子(thrABC)存在，并且丧失了 L-高丝氨酸生物和下述化合物合成能力的L-苏氨酸营养缺陷型菌株可以通过例如缺失thrBC部分而获得。在正亮氨酸抗性菌株中，削弱了 S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，并且赋予或提高了生产L-甲硫氨酸的能力。在大肠杆菌中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因编码的。生产L-甲硫氨酸的能力还可以通过缺失甲硫氨酸阻抑物或通过提高L-甲硫氨酸生物合成中涉及的酶如高丝氨酸转琥珀酰基酶、胱硫醚Y-合成酶和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II的活性而赋予或提高(特开2000-139471)。在大肠杆菌中，甲硫氨酸阻抑物是由metj基因编码的，高丝氨酸转琥珀酰基酶是由metA基因编码的，胱硫醚Y -合成酶是由metB基因编码的，天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II是由metL基因编码的。此外，通过使用对L-甲硫氨酸的反馈抑制有抗性的突变型高丝氨酸转琥珀酰基酶，还可以赋予或提高生产L-甲硫氨酸的能力(特开2000-139471号、US20090029424)。由于经由L-半胱氨酸作为中间体生物合成L-甲硫氨酸，生产L-甲硫氨酸的能力还可以通过提高生产L-半胱氨酸的能力得以提高(特开2000-139471号，US20080311632)。因此，对于赋予或提高生产L-甲硫氨酸的能力，赋予或增强生产L-半胱氨酸的能力也是有效的。L-甲硫氨酸生产菌和用于构建它们的亲本株的具体实例包括如下的大肠杆菌，如AJ11539(NRRL B-12399),AJl1540(NRRL B-12400),AJl1541(NRRL B-12401),AJl1542(NRRLB-12402)(英国专利2075055)，对作为L-甲硫氨酸类似物的正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125，俄罗斯专利 2209248)，和 73 菌株(VKPM B-8126，俄罗斯专利 2215782)。此外，作为L-甲硫氨酸生产菌或用于构建该菌的亲本株，也可以使用源自大肠杆菌W3110的AJ13425(FERM P-16808，特开 2000-139471 号(US7611873))。AJ13425 是一种 L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻抑物，削弱了胞内S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，且提高了胞内高丝氨酸转琥珀酰基酶活性、胱硫醚Y-合成酶活性和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性。AJ13425已 于平成10年5月14日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现名:产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址:邮政编码305-8566茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6，日本)，并给予保藏号FERM P-16808。此外，以L-甲硫氨酸作为起始物质生物合成的S-腺苷甲硫氨酸等化合物的生产能力，也可以通过增强目的化合物的生物合成途径的酶活性，或者降低从该生物合成途径分支出来的途径的酶或分解目的化合物的酶的活性来赋予或增强。例如，S-腺苷甲硫氨酸生产能力可以通过强化甲硫氨酸腺苷转移酶(EP0647712、EP1457569)、强化分泌因子MdfA(US7410789)来赋予或增强。yeeE基因编码的蛋白质的活性的增强本发明的细菌可以通过对诸如上述的具有生产含硫氨基酸的能力的属于肠杆菌科的细菌进行修饰而增强yeeE基因编码的蛋白质(以下，也记作“YeeE”或“YeeE蛋白质”)的活性来获得。而且，也可以在进行修饰而增强YeeE蛋白质的活性后，再赋予或增强生产含硫氨基酸的能力。“yeeE基因编码的蛋白质的活性增强”是指:yeeE基因编码的YeeE蛋白质的活性相对于野生株或亲本株等非修饰株增强。蛋白质的活性与非修饰株相比增强即可，没有特殊限制，与非修饰株相比优选增强1.5倍以上、更优选2倍以上、更优选3倍以上。此外，“yeeE基因编码的蛋白质的活性增强”不仅包括在原本具有YeeE蛋白质的活性的菌株中增强YeeE蛋白质的活性，也包括在原本不存在YeeE蛋白质的活性的菌株中赋予YeeE蛋白质的活性。S卩，例如，Pantoea ananatis不具有yeeE基因，也包括在Pantoea ananatis中赋予YeeE蛋白质的活性。增强YeeE蛋白质的活性这样的修饰可以通过例如增强yeeE基因的表达来实现。用于增强yeeE基因的表达的修饰可以通过例如，利用基因重组技术，提高细胞中的基因的拷贝数来进行。例如，可以将含yeeE基因的DNA片段与在宿主细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体连接，制作重组DNA，并将其导入细菌，进行转化。作为所述载体，可以列举出可在宿主细菌的细胞内自主复制的载体。作为可在大肠杆菌细胞内自主复制的载体，可以列举出 pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184 (pHSG、pACYC 可从TAKARA Bio 公司获得)、RSFlO 10、pBR322、pMW219 (pMW219 可从 NIPPON GENE 公司获得)、pSTV29(可从TAKARA Bio公司获得)等。将重组DNA导入细菌，可以按照已经报告的转化法来进行。例如也可以应用，用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法，该方法已被报道用于大肠杆菌K-12 (MandeI, Eand Higa, A.，J.Mol.Biol.，53，159 (1970))，或者从处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方法，该方法已被报道用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson, G.A.and Young, F.E.，Gene，1，153 (1977))。或者，还可以应用将 DNA 受体菌的细胞制备成容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重组DNA导入DNA受体菌的方法，该方法已知用于枯草杆菌、放线菌类和酵母(Chang, S.and Choen, S.N.,Molec.Gen.Genet., 168, 111 (1979) ；Bibb, M.J., Ward, J.M.and Hopwood, 0.A., Nature,274, 398 (1978) ；Hinnen, A.，Hicks, J.B.and Fink, G.R.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 75,1929(1978))。另一方面，提高yeeE基因的拷贝数还可以通过使细菌的基因组DNA上存在多个拷贝的yeeE基因来实现。为了将多个拷贝的yeeE基因导入到细菌的基因组DNA上，可以利用基因组DNA上以多·拷贝存在的序列作为靶标，通过同源重组来进行。作为基因组DNA上以多拷贝存在的序列，可以利用重复DNA (repetitive DNA)、存在于转座元件端部的反向重复序列。此外，可以随机连接在基因组上存在的yeeE基因的近旁，也可以重复地插入到基因组上的非必要的基因上。这些基因导入可以使用温度敏感型载体、或者使用整合载体来实现。或者，还可以如特开平2-109985号公报所公开的那样，将yeeE基因装载在转座子中，使其发生转移，从而将多个拷贝导入基因组DNA中。基因转移到了基因组上的事实，可以通过以yeeE基因的一部分为探针进行Southren杂交来予以确认。而且，yeeE基因的表达的增强除了上述的基因拷贝数的扩增以外，还可以按照国际公开00/18935号小册子记载的方法，通过下述方法来实现:将基因组DNA上或质粒上的yeeE基因的各启动子等表达调控序列更换为强力的；使各基因的-35、-10区域接近共有序列；扩增使得yeeE基因的表达提高的调节子，或缺失或弱化使得yeeE基因的表达降低的调节子。作为强力的启动子，已知有例如，Iac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、tet启动子、Τ7启动=」φ 启动子等。此外，也可以使用大肠杆菌的苏氨酸操纵子的启动子。此外，还可以在yeeE基因的启动子区域、SD区域导入碱基取代等，将其修饰成更强力的。例如，也可以将SD区域的序列直接替换成φΙΟ启动子下游的SD区域的序列。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein 等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中。而且，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔、特别是起始密码子临近上游的序列中数个核苷酸的取代对mRNA的翻译效率有非常大的影响，可以对其进行修饰来提高翻译效率。yeeE基因的启动子等的表达调节区域也可以使用启动子检索载体、GENETYX等基因解析软件来确定。通过这些启动子取代或修饰可以强化yeeE基因的表达。表达调控序列的取代可以采用例如使用温度敏感型质粒的方法、Red驱动整合法(W02005/010175)。使yeeE基因的表达量增大的修饰也可以通过例如，将yeeE基因的表达正调节调控因子、负调控调控因子模块化来实现。例如，作为调控因子，可以列举出属于LysR家族等的，可以利用数据库EcoCyc (http://ecocyc.0rg/)等来发现。通过调控因子的模块化可见yeeE基因的转录量的增大、YeeE蛋白质的量的增大即可。yeeE基因的表达增强的事实可以通过确认yeeE基因的转录量增大、或确认YeeE蛋白质的量增大来确认。yeeE基因的转录量增大的确认可以通过将从该基因转录的mRNA的量与野生株、或者非修饰株相比较来进行。作为评价mRNA的量的方法,可以列举出Northern杂交、RT-PCR 等(Molecular cloning(Cold spring HarborLaboratory Press, Cold springHarbor(USA) ,2001))。mRNA的量优选与非修饰株相比，增大至例如1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。YeeE蛋白质的量增大的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹“Westernblotting”来进行(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold springHarbor (USA)，2001))。蛋白质的量优选与非修饰株相比，增大至例如1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。而且，对于上述的编码SAT等的基因，也可以采用同样的方法将重组DNA导入细菌，此外，可以提闻基因的拷贝数。 大肠杆菌K12MG1655株的yeeE基因相当于以GenBank登录号NC_000913 (VERSIONNC_000913.2G1:49175990)登录NCBI数据库的基因组序列中的2082491 2083549位的序列的互补序列。大肠杆菌K12MG1655株的yeeE基因与ECK2007、JW1995同义。此外，大肠杆菌 K12MG1655 株的 YeeE 蛋白质以 GenBank 登录号 NP_416517 (version NP_416517.1GI:16129954、locus_tag= “b2013”)登录。所述MG1655株的yeeE基因的碱基序列、以及编码该基因的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13以及14所示。由于yeeE基因的碱基序列会由于细菌所属的属、种或菌株而不同，所以接受使YeeE蛋白质的活性增强的修饰的yeeE基因可以为SEQ ID NO:13的碱基序列的变体。yeeE基因的变体可以通过使用BLAST (http://blast.genome, jp/)等参照SEQ ID NO:13的碱基序列进行检索。此外，yeeE基因的变体包括该基因的同源物，例如，可以使用例如微生物如属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌型细菌的染色体作为模板，基于例如SEQ ID N0:13的碱基序列制备的合成寡核苷酸通过PCR扩增的基因。作为大肠杆菌以外的细菌的yeeE基因同源物的例子，可以列举出以下的细菌的yeeE基因(表1)。表1中，同一性(%)是基于BLAST的大肠杆菌K12株的YeeE蛋白质(SEQID NO: 14)与各细菌的同源物之间的同一性。登录号是NCBI数据库的登录号。[表1]表权利要求
1.一种属于肠杆菌科的细菌，其具有生产含硫氨基酸的能力，且经过修饰而增强了yeeE基因编码的蛋白质的活性。
2.权利要求1所述的细菌，其中，所述蛋白质的活性是通过增大yeeE基因的表达量或者增大yeeE基因的翻译量而增强的。
3.权利要求2所述的细菌，其中，yeeE基因的表达量是通过提高yeeE基因的拷贝数或者对yeeE基因的表达调控序列进行修饰而增大的。
4.权利要求1 3中任一项所述的细菌，其中，所述蛋白质是下述㈧或⑶所述的蛋白质: (A)由SEQID NO:14所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (B)由在SEQID NO:14所示的氨基酸序列中包含I个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列组成、且在细胞内的活性增强时生产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质。
5.权利要求1 4中任一项所述的细菌，其中，所述yeeE基因是下述(a)或(b)所述的 DNA: (a)由SEQID NO: 13所不的喊基序列组成的DNA ； (b)能够在严格条件下与SEQID NO:13所示的碱基序列的互补碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针杂交、且编码在细胞内的活性增强时生产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质的DNA。
6.权利要求1 5中任一项所述``的细菌,其还具备下述性质中的至少任意一个: i)经过修饰而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性； ii)经过修饰而提高了ydeD基因的表达； iii)经过修饰而提高了3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
7.权利要求1 6中任一项所述的细菌，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。
8.权利要求7所述的细菌，其中，所述细菌是大肠杆菌。
9.权利要求1 6中任一项所述的细菌，其中，所述细菌是泛菌属细菌。
10.权利要求9所述的细菌,其中，所述细菌是Pantoeaananatis。
11.含硫氨基酸、含硫氨基酸的关联物质或它们的混合物的制造方法， 其中，在培养基中培养权利要求1 10中任一项所述的细菌，并从该培养基收集含硫氨基酸、含硫氨基酸的关联物质或它们的混合物。
12.权利要求11所述的方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸。
13.权利要求11所述的方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸，所述关联物质是胱氨酸或噻唑烷衍生物。
全文摘要
开发提高细菌的生产含硫氨基酸的能力的新技术，提供含硫氨基酸生产菌、以及使用该细菌的含硫氨基酸等化合物的制造方法。通过在培养基中培养具有生产含硫氨基酸的能力，且经过修饰而增强了yeeE基因编码的蛋白质、例如下述(A)或(B)所述的蛋白质的活性的属于肠杆菌科的细菌，并从该培养基收集含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物，来制造这些化合物。(A)由SEQ ID NO14所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(B)在SEQ ID NO14所示的氨基酸序列中，包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列由组成的、且增强在细胞内的活性时生产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质。
文档编号C12N15/09GK103119154SQ20118004424
公开日2013年5月22日 申请日期2011年9月13日 优先权日2010年9月14日
发明者野中源 申请人:味之素株式会社