专利名称：用于玉米的激活标签化平台和所得的带标签的群体和植物的制作方法
技术领域：
本公开涉及植物分子生物学和遗传工程学领域，并且具体地涉及用于玉米的激活标签化化平台和从其所得的带标签的群体和植物。
背景技术：
分析基因功能的常规方法涉及敲除基因表达和相应的基因功能，或过表达基因并寻找有关的表型。常规的诱变技术的结果经常是鉴定出缺失功能的突变体和干扰天然基因的有关基因突变。然而，真核生物基因组在基因组内含有相当大数目的功能性基因，它们具有冗余的编码序列和调节区。另外，这类方法往往不导致功能缺失导致早期致死性的基因的鉴定。这两类都有可能能够通过导致获得功能的方法来鉴定。功能获得型(gain-of-function)突变体可以缘于编码序列中的各种导致所得蛋白质的组成型活化的突变，或通过改变基因表达水平或样式的突变而得到。后一类型的突变可以是就表达水平而言启动子功能改变的结果，例如组成型对可诱导启动子，启动子或其它调节元件的组织或发育阶段特异性，或增强的天然启动子活性。
激活标签化(activation tagging)是这样一种方法,通过该方法基因在全基因组规模上被随机且强烈上调，其后可以筛选并选择特定表型。激活标签化是将转录增强子随机插入到整个基因组中，从而增加连接于增强子插入位点的基因的转录活性和/或下调或抑制其中插入增强子的转录单元(编码序列和调节序列)的功能性转录本的生成。转录增强子可以插入到基因附近，将其转录上调，由此创建改变的表型。品系被视为“带标签的”(tagged)，因为在任何单个品系中均可以测定增强子整合的位点并且可以通过遗传分析将增强子的存在与突变表型关联。激活标签化已经在多种植物中被用来活化基因。有人在烟草细胞中使用激活T -DNA标签构建体来激活基因，从而允许细胞在缺乏植物生长激素的情况下生长(Walden 等，Plant Mol.Biol.26:1521-1528，1994)。随后发表了一系列文章，包括关于从侧翼于T-DNA标签的植物基因组序列分离的、且推定牵涉植物生长激素应答的基因的报道。(参见例如 Miklashevichs 等,Plant J.12:489-498，1997; Harling 等,EMBOJ.16:5855-5866，1997; Walden等，EMBO J.13:4729-4736，1994和 Schell 等，Trends PlantSc1.3:130，1998,其论述对一组相关研究的调查)。在一项在拟南芥(Arabidopsis)中的类似研究中，通过质粒拯救从植物基因组DNA分离出单一的基因，鉴定并发现其含有基因CKI1，其牵涉植物中的细胞分裂素应答并且当重新引入拟南芥中时确认了其表型。(Kakimoto, Science274:982-5, 1996)。在较新的一项报告中，激活T-DNA标签并筛选植物的早期开花表型导致了 FT 基因的分离(Kardailsky 等，Science286:1962-1965，1999)。
激活标签化技术的变型包括使用土壤杆菌(Agrobacterium)基因5启动子(pg5),其仅在增殖细胞中有活性并且必须插入到植物基因的紧邻方能影响其表达，同时使用例如最初记载于 Koncz 等，Proc Natl Acad Sci USA86 (21): 8467-8471，1989 中的 nos 启动子/hpt选择盒(pCVHPT)。激活标签化的另一种形式利用经修饰的Ds转座子，其携带CaMV35S 启动子和 nos::hpt 选择盒(Wilson 等，Plant Cell8:659-671，1996)。将经过修饰的Ds元件插入到二元载体表达构建体中的抗生素抗性盒。一旦引入到拟南芥中，转座的Ds元件(经由存在的35S启动子)能够上调邻近的植物基因，其导致线性的功能获得型突变(Schaffer 等，Cell93:1219-1229，1998;Wilson 等，Plant Cell8:659-671，1996)。已经开发了可用于筛选成百上千种植物的形态学表型的激活标签化载体(Weigel等，PlantPhysiology, 122:1003-1013，2000)。
发明概述本文中披露了玉米中的激活标签化平台，其使用转座子技术，使得位于数个基因组位置上、且含有增强子的转座子能够以近饱和的插入水平在玉米基因组中移动。该平台可以用于发现影响有价值性状的基因。在一个实施方案中，玉米激活标签化DNA构建体包含转座酶的编码序列；可检测的报道物编码区，其包含可操作地连接于第一高水平的组成型启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二高水平的组成型启动子的编码花色素苷调节基因Cl的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到可检测的报道物编码区中，使得B-Peru和Cl基因仅在可转座盒切离的情况下在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷，所述可转座盒包含成对的转座酶DNA底物，它们之间置有:转录增强元件；和任选的可操作地连接于转录增强子元件的编码可选择标志的基因。在另一个实施方案中，玉米激活标签化DNA构建体包含玉米Spm转座酶的编码序列；报道物编码区，其包含可操作地连接于第一球蛋白I启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二球蛋白I启动子的编码花色素苷调节基因Cl的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到报道物编码区中，使其破坏B-Peru基因、Cl基因或B-Peru和Cl基因两者的表达，可转座的盒包含玉米5’和3’Spm末端反向重复(TIR)，在它们之间置有SCBV4X转录增强子；以及任选地，可操作地连接于该转录增强子的编码可选择标志的序列，其中Spm介导的可转座的T-DNA盒的切离恢复受破坏的B-Peru和/或Cl基因的表达。还披露了生成带标签的玉米植物群体的方法，所述方法包括用任何公开的玉米激活标签化DNA构建体来转化玉米植物细胞或组织。进一步提供了通过所披露的方法生成的带标签的玉米植物群体。此外，提供了可从带标签的玉米植物群体获得的植物细胞、颗粒(kernel)、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括Fl杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。还提供了生成带标签的玉米植物的方法，所述方法包括用任何公开的玉米激活标签化DNA构建体转化玉米植物细胞或组织。在一些实施方案中，所述方法还包括通过测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较来鉴定带标签的玉米植物。此外，提供了可从带标签的玉米植物获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括Fl杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。从下列随所附图而进展的详细描述，本公开的前述内容和其它特征将变得更加明白。附图简述
图1显示了 pEPS3004的示意图，其为Spm-ZeaTAG载体的一个例子。图2A和2B例示了在B104中B-Peru和Cl基因产物两者都是合成并累积花色素苷色素所需要的。玉米B104授粉后13天(DAP)，用Ub1:B-Peru:Nos和Ub1:Cl:Nos质粒DNA—起(图2A)或球蛋白:Cl:NOS-球蛋白:B-Peru:Nos单独的质粒DNA(图2B)经生物射弹(biolistically)转化的胚显示出花色素苷累积。在每一个小图上方示出了相应的经工程化改造的表达盒。图3A例示了对B104玉米中Spm依赖性的dSpm切离的生化和分子分析。图3A是用LBA4404-pEPS3004质粒转化的B104胚授粉13天后(DAP)的图。箭头指示花色素苷累积。图3B是展现基因组PCR分析的结果的一对琼脂糖凝胶，显示空的供体位点(EDS)。第I道，从用LBA4404-pEPS3004转化的B104胚的合并的紫色组织分离的基因组DNA。第2道，从用LBA4404-pEPS6002 (⑶S构建体)转化的B104胚分离的基因组DNA。第3道，从用共培养缓冲液转化的B104胚分离的基因组DNA。M，IOObp梯。最上的小图显示了使用侧翼于PEPS3004的dSpm单元的引物进行的PCR。底下的小图显示了内源的GAPDH基因组PCR。图3C提供了对EDS序列分析得到的序列。将EDS特异性的PCR产物克隆到TOPO载体中并转化到大肠杆菌(E.coli)中。从47个菌落制备质粒DNA并测序。点和带圈的字母分别指示EDS位点中 的碱基对缺失和转变；该序列也列在表2中。EDS，空供体位点；FDS，满供体位点。图4是展现出pEPS3004的ZeaTAG元件的配子转座的玉米穗的图。配子转座生成了紫色玉米粒，这是糊粉形成前转座的结果。图5是一系列玉米穗的图，展示了含有ZeaTAG元件的植物的Tl种子表型。所有的黄色颗粒表明无转座，黄色和紫色颗粒表明早期配子转座(与图4的图相同)，黄色颗粒和具有紫色部分的黄色颗粒表明体细胞转座，且紫色粒颗表明体细胞转座和晚期配子转座。在本图中，深色是紫色，浅色是黄色。序列表如37C.F.R.1.822中定义的，对核苷酸碱基使用标准字母缩写且对氨基酸使用三字母码来显示本公开或序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列。仅显示了每种核酸序列的一条链，但理解通过对所展示链的任何提述也纳入了互补链。核酸序列以标准的5’ -3’方向呈现，蛋白质序列以标准的氨基(N)末端至羧基(C)末端方向呈现。SEQ ID NO:1是pEPS3004 —部分的核酸序列，含有以下元件:
权利要求
1.一种玉米激活标签化DNA构建体，包含: 转座酶的编码序列； 可检测的报道物编码区，其包含: 可操作地连接于第一高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和 可操作地连接于第二高水平组成型启动子的编码花色素苷调节基因Cl的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入所述可检测的报道物编码区中，使得所述B-Peru和Cl基因仅在所述可转座盒切离时才在含有所述玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷，所述可转座盒包含: 成对的转座酶DNA底物，它们之间布置有: 转录增强子元件；以及任选地 可操作地连接于所述转录增强子元件的编码可选择标志的序列。
2.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述成对的转座酶DNA底物是玉米Spm可转座元件的5’和3’末端反向重复(TIR)，且所述转座酶是玉米Spm。
3.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述转录增强子元件包含至少2个拷贝的甘鹿杆状病毒(SCBV)增强子。
4.权利要求3的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述转录增强子元件包含4个拷贝的SCBV增强子。
5.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述第一或第二高水平组成型启动子是组织特异性的启动子。
6.权利要求5的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述第一或第二高水平组成型组织特异性启动子是球蛋白I启动子。
7.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述可选择标志是AADl。
8.权利要求1的玉米激活标签化DNA构建体，其中所述构建体具有如由SEQID NO:1所示的核酸序列。
9.一种玉米激活标签化DNA构建体，包含: 玉米Spm转座酶的编码序列； 报道物编码区，其包含: 可操作地连接于第一球蛋白I启动子的编码花色素苷调节基因B-Peru的序列；和可操作地连接于第二球蛋白I启动子的编码花色素苷调节基因Cl的序列；和非自主型可转座的T-DNA盒，其插入到所述报道物编码区中，使得其破坏所述B-Peru基因、Cl基因或B-Peru和Cl基因两者的表达，所述可转座盒包含: 玉米5’和3’ Spm末端反向重复(TIR)，它们之间布置有: 4个拷贝的甘蔗杆状病毒(SCBV)转录增强子；和任选地 可操作地连接于所述转录增强子的编码可选择的标志的序列； 其中Spm介导的所述可转座的T-DNA盒的切离恢复所述受破坏的B-Peru和/或Cl基因的表达。
10.生成带标签的玉米植物群体体的方法，所述方法包括用权利要求1-9中任一项的构建体来转化玉米植物细胞或组织。
11.权利要求10的方法，其进一步包括鉴定带标签的玉米植物群体。
12.权利要求11的方法，其中鉴定带标签的玉米植物群体包括测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较。
13.权利要求11的方法，其中鉴定带标签的玉米植物群体包括在所述带标签的玉米植物群体中鉴定配子转座、体细胞转座或其组合。
14.权利要求13的方法，其进一步包括基于表型从带标签的群体鉴定带标签的玉米植物。
15.通过权利要求10-13中任一项的方法生成的带标签的玉米植物群体。
16.可以从权利要求15的带标签的玉米植物群体获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用 于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括Fl杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
17.生成带标签的玉米植物的方法，所述方法包括用权利要求1-9中任一项的构建体来转化玉米植物细胞或组织。
18.权利要求17的方法，其进一步包括通过测量经转化的玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量并将其与对照玉米植物细胞或组织中的花色素苷含量进行比较来鉴定出带标签的玉米植物。
19.可以从权利要求17或18的带标签的玉米植物获得的植物细胞、颗粒、叶、根、芽、花、种子、插条和其它可用于有性或无性繁殖的繁殖材料、包括Fl杂交种的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物和植物产物。
全文摘要
本文中公开了用于玉米的激活标签化构建体、所得带标签的群体和植物。在一个实例中，激活标签化DNA构建体包含转座酶的编码序列、可检测的报道物(如花色素苷调节基因B-Peru和C1)、和非自主型可转座的T-DNA盒。例如，将可转座的T-DNA盒插入到可检测的报道物编码区，从而使得B-Peru和C1基因仅在该可转座盒切离时才在含有玉米激活标签化DNA构建体的细胞中表达花色素苷。生成带标签的玉米植物群体的方法包括用所公开的构建体转化玉米植物细胞或组织。
文档编号C12N15/82GK103221543SQ201180052771
公开日2013年7月24日 申请日期2011年8月29日 优先权日2010年8月30日
发明者J.P.戴维斯, X.L.刘, V.S.蕾迪, W.M.安利, D.R.瓦格纳 申请人:陶氏益农公司