TNF-α结合蛋白的制作方法

TNF-α结合蛋白的制作方法
【专利摘要】提供了结合TNF-α的TNF-α结合蛋白，包括嵌合抗体、CDR嫁接的抗体和人源化抗体。结合蛋白对于TNF-α具有高亲和力且中和TNF-α活性。结合蛋白可以是全长抗体或其TNF-α结合部分。还描述了结合蛋白的制备方法和使用方法。TNF-α结合蛋白可用于检测TNF-α和用于抑制TNF-α活性，包括在患有其中TNF-α活性是有害的疾病或病症的人受试者中。
【专利说明】TNF-a结合蛋白
[0001]本申请要求于2010年12月8日提交的美国临时申请号61/420，999的优先权。
[0002]领域
提供了 TNF-a结合蛋白以及其在预防和/或治疗急性或慢性免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣、多发性硬化和其他自身免疫性疾病)中的用途。
[0003]背景
本领域需要能够结合TNF-a的改良抗体。
[0004]概述
提供了能够结合TNF-a、以高亲和力结合TNF-a、以及结合并中和TNF-a的结合蛋白、CDR嫁接的抗体、人源化抗体及其片段的新家族。还提供了能够结合TNF-a的抗体及其抗原结合部分，所述 抗体及其抗原结合部分包含SEQ ID NO: 31-46中任一个的氨基酸序列。
[0005]详述
提供了结合TNF-a的TNF-a结合蛋白，例如抗体或其抗原-结合部分。各个方面涉及抗体和抗体片段、及其药物组合物、以及用于制备此种抗体及其片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。还涵盖了使用结合蛋白在体外或体内检测人TNF-a、抑制人TNF-a、并调节基因表达的方法。
[0006]除非本文另有定义，本文使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括其复数，且复数术语应包括其单数。除非另有说明，术语“或”包括“和/或”。术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。
[0007]细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白和核酸化学和核酸杂交、分析化学、合成有机化学、医学和药物化学、药物制备、配制和递送、以及患者治疗的方法和技术一般根据本领域众所周知的进行。这样的技术还描述于本文引用的参考文献中。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常已知的或如本文另有说明来进行。
[0008]术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，指氨基酸的聚合链。术语“多肽”涵盖天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的类似物。多肽可以是单体或聚合的。
[0009]术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”指不与组分结合的蛋白或多肽，所述组分在其天然状态下与其伴随，例如，基本上不含来自相同物种的其他蛋白或细胞组分，由来自不同物种的细胞表达，或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。
[0010]术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类诸如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。[0011]术语“人TNF-α ”(在本文中缩写为hTNF_ α )包括二聚体细胞因子蛋白。术语包括同源三聚体蛋白，所述同源三聚体蛋白包含三个17.5 kD TNF-α蛋白。同源三聚体蛋白被称为〃TNF-α蛋白〃。术语“TNF-α ”意在包括可以通过标准重组表达方法制备的重组人TNF- a (TNF- α )。人TNF- α的序列在表I中显示。
[0012]表1:人TNF-α的序列
【权利要求】
1.抗体或其抗原结合部分，其包含SEQID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ IDNO: 39,SEQ ID NO: 40,SEQ ID NO: 41,SEQ ID NO: 42,SEQ ID NO: 43,SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、或 SEQ ID NO: 46。
2.能够结合TNF-α的抗体或其抗原结合部分，其包含至少一个⑶R，所述⑶R包含:SEQ ID NO:31 的残基 31-35 (CDR-Hl)、SEQ ID NO:31 的残基 50-66 (CDR-H2)、SEQ ID NO:31的残基 99-113 (CDR-H3)、SEQ ID NO: 32 的残基 24-34 (CDR-Ll)、SEQ ID NO:32 的残基50-56 (CDR-L2)、或 SEQ ID NO: 32 的残基 89-97 (CDR-L3)。
3.根据权利要求2所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少3个CDRs。
4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其中所述至少3个⑶Rs包含下列可变结构域⑶R组:
(a)SEQ ID NO: 31 的残基 31-35 (CDR-Hl)、SEQ ID NO: 31 的残基 50-66 (CDR-H2)、和SEQ ID NO: 31 的残基 99-113 (CDR-H3);或
(b)SEQ ID NO: 32 的残基 24-34 (CDR-Ll)、SEQ ID NO: 32 的残基 50-56 (CDR-L2)、和SEQ ID NO:32 的残基 89-9 7(CDR-L3)。
5.根据权利要求4所述的结合蛋白，其包含至少2个可变结构域⑶R组。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含下列两者:
(a)SEQ ID NO: 31 的残基 31-35 (CDR-Hl)、SEQ ID NO: 31 的残基 50-66 (CDR-H2)、和SEQ ID NO:31 的残基 99-113 (CDR-H3);和
(b)SEQ ID NO: 32 的残基 24-34 (CDR-Ll)、SEQ ID NO: 32 的残基 50-56 (CDR-L2)、和SEQ ID NO:32 的残基 89-97(CDR-L3)。
7.根据权利要求6所述的结合蛋白，其进一步包含人受体构架。
8.根据权利要求7所述的结合蛋白，其中所述人受体构架包含SEQID N0S:10-19或SEQ ID NOS:20-30 的任一个。
9.根据权利要求7或8所述的结合蛋白，其中所述人受体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人受体构架的序列至少65%相同，并且包含至少70个与所述人受体构架相同的氨基酸残基。
10.根据权利要求8所述的结合蛋白，其中所述人受体构架在下列位置包含至少一个构架区氨基酸取代:接近CDR的残基、糖基化位点残基、稀有残基、能够与人TNF-α相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、Vernier区内的残基、和Chothia定义的可变重链⑶Rl和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中所述残基是1H、2H、67H、69H、71H、82H、85H、91H、和 2L、43L、44L、49L、71L、或 87L。
12.根据权利要求11所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含共有人受体。
13.根据权利要求1所述的结合蛋白，其包含 (a)可变重链多肽，其包含SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 37、SEQ IDNO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、和 SEQ ID NO: 42，以及 (b)可变轻链多肽，其包含SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 43、SEQ IDNO: 44、SEQ IDNO: 45、和SEQ IDNO: 46。
14.权利要求13的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含可变重链多肽和可变轻链多肽，所述可变重链多肽和可变轻链多肽包含下列各自的氨基酸序列:

15.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白是:免疫球蛋白分子、二硫键连接的Fv、单克隆抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR嫁接的抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、DVD-1g蛋白、Fab’、双特异性抗体、F (ab’)2或Fv。
16.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含人IgM恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgGl恒定结构域、人IgE恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、或人IgA恒定结构域。
17.权利要求1的结合蛋白，其进一步包含重链恒定区，所述重链恒定区具有SEQIDNO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
18.权利要求1的结合蛋白，其进一步包含轻链恒定区，所述轻链恒定区具有SEQIDNO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
19.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够中和人TNF-a。
20.权利要求1的结合蛋白，其中如通过表面等离振子共振测量的，所述结合蛋白对所述靶具有下列结合速率常数(Km):至少约lOVs—1 ;至少约lot1 s—1 ;至少约IO4M4s—1 ;至少约 IO5IVr1S-1 ;或至少约 IO6IT1S'
21.权利要求1的结合蛋白，其中如通过表面等离振子共振测量的，所述结合蛋白对所述靶具有下列解离速率常数(Ktjff):至多约KT35T1 ;至多约KT45T1 ;至多约KT55T1 ;或至多约KT6S'
22.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白对所述靶具有下列解离常数(KD):至多约1(T7 M ;至多约1(T8 M ;至多约1(T9 M ;至多约10, M ;至多约l(Tn M ;至多约1(T12 M ;或至多 1(T13 Mo
23.权利要求22的结合蛋白，其中所述结合蛋白对TNF-a具有下列解离常数(KD):约至多约1(T7 M ;至多约1(T8 M ;至多约1(T9 M ;至多约10, M ;至多约l(Tn M ;至多约1(T12 M ；或至多10_13 M0
24.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白进一步包含免疫粘附分子、显像剂、治疗剂或细胞毒性剂。
25.权利要求24的结合蛋白，其中所述显像剂是放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记或生物素。
26.权利要求25的结合蛋白，其中所述放射性标记是:3H、14C、35S、9°Y、99Tc、mIn、1251、1311、177Liu 166Ho 或 153Sm。
27.权利要求24的结合蛋白，其中所述治疗剂或细胞毒性剂是抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝分裂剂、蒽环霉素、毒素和细胞凋亡剂。
28.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白具有人糖基化模式。
29.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白是结晶结合蛋白。
30.分离的核酸，其编码权利要求1的结合蛋白氨基酸序列。
31.载体，其包含编码权利要求1的结合蛋白氨基酸序列的分离的核酸。
32.权利要求31的载体，其中所述载体是pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE、或 pBJ.32.宿主细胞，其包含权利要求31的载体.
33.权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞.
34.权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞.
35.权利要求34的宿主细胞，其中所述真核细胞是原生生物细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞或昆虫细胞.
36.权利要求35的宿主细胞，其中所述真核细胞是酿酒酵母、CHO细胞、COS细胞、或SF9细胞.
37.产生能够结合TNF-α的蛋白的方法，所述方法包括在足以产生能够结合TNF-α的结合蛋白的条件下，在培养基中培养权利要求32所述的宿主细胞的步骤.
38.根据权利要求37所述的方法产生的蛋白.
39.药物组合物，包含权利要求1或权利要求37的结合 蛋白、以及药学可接受的载体.
40.权利要求39的药物组合物，其进一步包含用于治疗其中TNF-α活性是有害的病症的至少一种另外的试剂.
41.权利要求40的药物组合物，其中所述另外的试剂是:治疗剂；显像剂；细胞毒性剂；血管生成抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506 ;可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂；麻醉药；非类固醇消炎药(NSAID);止痛剂；麻醉剂；镇静剂；局部麻醉剂；神经肌肉阻断剂；抗微生物剂；抗牛皮癣剂；皮质类固醇；促蛋白合成类固醇；促红细胞生成素；免疫接种；免疫球蛋白；免疫抑制剂；生长激素；激素替代药物；放射性药物；抗抑郁药；抗精神病药；刺激剂；哮喘药物；β激动剂；吸入类固醇；口服类固醇?’肾上腺素或其类似物；细胞因子；或细胞因子拮抗剂.
42.用于治疗哺乳动物的方法，所述方法包括给所述哺乳动物施用有效量的权利要求39的组合物的步骤.
43.用于降低人TNF-α活性的方法，所述方法包括将人TNF-α与权利要求1的结合蛋白接触，从而降低人TNF- α活性.
44.用于在患有其中TNF-α活性是有害的病症的人受试者中降低人TNF-a活性的方法，包括给所述人受试者施用权利要求1的结合蛋白，从而降低所述人受试者中的人TNF-a活性.
45.用于治疗受试者中其中TNF-a活性是有害的疾病或病症的方法，其通过给所述受试者施用权利要求1的结合蛋白，从而实现治疗.46.权利要求45的方法，其中所述病症是自身免疫性和/或炎性病症.
46.权利要求46的方法，其中所述病症是克罗恩病、斑块状银屑病、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、骨关节炎、幼年特发性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性糖尿病、变态反应、和自身免疫性葡萄膜炎.
47.权利要求46的方法，其中所述病症是呼吸病症；哮喘；过敏性和非过敏性哮喘；由于感染导致的哮喘；由于呼吸道合胞病毒(RSV)感染导致的哮喘；慢性阻塞性肺疾病(COPD);涉及气道炎症的状况；嗜伊红粒细胞增多；纤维化和过量粘液产生；囊性纤维化；肺纤维化；特应性病症；特应性皮炎；荨麻疹；湿疹；过敏性鼻炎；过敏性肠胃炎；皮肤的炎症和/或自身免疫性状况；胃肠器官的炎症和/或自身免疫性状况；炎性肠病(IBD);溃疡性结肠炎；克罗恩病；肝脏的炎症和/或自身免疫性状况；肝硬化；肝纤维化；乙型肝炎和/或丙型肝炎引起的肝纤维化；硬皮病；肿瘤或癌症；肝细胞癌；成胶质细胞瘤；淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；病毒感染；细菌感染；寄生虫感染；HTLV-1感染；保护性I型免疫应答的表达抑制、和在接种过程中保护性I型免疫应答的表达抑制.
48.治疗患有其中TNF-a是有害的病症的患者的方法，其包括在第二种试剂施用之前、同时或之后，施用权利要求1的结合蛋白，其中所述第二种试剂是能够结合人IL-12的抗体或其片段；PGE2 ；LPA ；NGF ；CGRP ；SubP ;RAGE ;组胺；组胺受体阻断剂；缓激肽；IL-1a ；IL-1^ ;VEGF;PLGF;氨甲蝶呤；皮质类固醇、糖皮质激素受体调节剂；环孢菌素、雷帕霉素、FK506、或非类固醇消炎药.
49.治疗患有其中TNF-a是有害的病症的患者的方法，所述方法包括在第二种试剂施用之前、同时或之后，施用权利要求1的结合蛋白的步骤，其中所述第二种试剂选自TNF拮抗剂；TNF受体的可溶性片段；ENBREL? ；TNF酶拮抗剂；TNF转换酶(TACE)抑制剂；毒蕈碱性受体拮抗剂；TGF-0拮抗剂；干扰素Y ；perfenidone ;化疗剂,氨甲蝶呤；来氟洛米；西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物CC1-779 ；C0X2或cPLA2抑制剂；NSAIDs ;免疫调节剂；p38抑制剂；TPL-2，MK-2和NFkB抑制剂；布地萘德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6_巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1b抗体；抗IL-6抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1 ^、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-22、 IL-23、 IL-24、 IL-25、 IL-26、 IL-27、 IL-28、 IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、EMAP-11、GM-CSF、FGF 或 PDGF 的抗体或激动剂；CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90 或其配体的抗体；FK506 ;雷帕霉素；霉酚酸酷；布洛分；强的松龙；憐酸~酷酶抑制剂；腺昔激动剂；抗凝剂；补体抑制剂；肾上腺素能药；IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂；IL-1 P转换酶抑制剂；TNFa转换酶抑制剂汀细胞信号传递抑制剂；金属蛋白酶抑制剂；6_巯基嘌呤；血管紧张素转换酶抑制剂；可溶性细胞因子受体;可溶性p55 TNF受体;可溶性p75 TNF受体;sIL_lRI ;sIL_lRII ;sIL_6R ;抗炎细胞因子；和TGFb.
50.权利要求40-48的方法，其中所述给所述受试者施用是通过至少肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、大剂量、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、或经皮.
51.在样品中检测人TNF-α的方法，其包括: (i)将样品与如权利要求1中所述的TNF-a结合蛋白或其TNF-a结合部分接触； 和 (?)检测所述TNF-a结合蛋白或其结合部分与所述样品中的TNF-a之间复合物的形成，其中，相对于对照样品或所述样品中的相对TNF- a中的复合物的形成，所述样品中的复合物形成统计学显著性变化.
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述样品是全血、血浆、血清、尿、唾液、或组织活检.
53.在人受试者中检测人TNF-a的方法，其包括: (i)在允许TNF-a结合蛋白或其TNF-a结合部分与人TNF-a结合的条件下，给测试受试者或对照受试者施用如权利要求1中所述的TNF-a结合蛋白或其TNF-a结合部分；和 (?)检测所述结合蛋白或其结合部分与TNF-a之间复合物的形成，其中，相对于所述对照受试者或相对于在较早时间点在所述测试受试者中的复合物形成，所述测试受试者中的复合物形成中的统计学显著性变化指示存在TNF-a。
【文档编号】C12P21/06GK103459609SQ201180065330
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2011年12月8日 优先权日:2010年12月8日
【发明者】C.谢, C.古德罗, T.哈于尔, A.梅勒, S.波斯 申请人:Abbvie 公司