经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌的制作方法
【专利摘要】本发明的一个方面涉及生物质材料的木糖部分向燃料和化学品的工业生物转化。本发明的另一个方面涉及生物质材料的木聚糖部分向燃料和化学品的工业生物转化。在一个实施方案中，本发明涉及细菌热纤梭菌，一种在联合生物加工配置中具有作为生物催化剂的巨大潜能的高纤维素分解性生物体。在一些实施方案中，本发明是赋予热纤梭菌发酵木糖的能力的遗传修饰和利用该修饰产生的菌株。在一些实施方案中，遗传修饰由来自解糖热厌氧杆菌(T.saccharolyticum)的操纵子中包含的两个基因组成。所述基因表达具有木糖异构酶(XI)和木酮糖激酶(XK)活性的蛋白质。在其它实施方案中，本发明涉及能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞。
【专利说明】经工程化以发酵木糖的遗传修饰的热纤梭菌
[0001]发明背景发明领域
[0002]能量转换、利用和获取是我们时代的许多巨大挑战(包括与持续性、环境质量、安全性和贫困相关的挑战)的起因。需要新兴技术的新型应用来应对这些挑战。生物技术，最强大的新兴技术之一，可产生重要的新能量转换方法。生物质及其衍生物是用于能量至对人类有用的形式的生物转化的来源。
[0003]生物质是来自活的或最近活的生物体的生物材料例如木材、废物、(氢)气体和醇燃料。生物质是基于碳、氢和氧的。还可发现氮和少量其它原子，包括碱金属、碱土金属和重金属。金属通常见于功能性分子例如卟啉中，其包括包含镁的叶绿素。植物特别地将水和二氧化碳组合成糖构建块。所需的能量通过基于叶绿素的光合作用从光产生。平均起来，0.1至1%的可获得的光被作为化学能贮存在植物中。糖构建块是陆生植物、木质素、半纤维素和纤维素中发现的所有主要部分的起始点。生物质被公认为用于产生可再生燃料和化学品的原料的有前景的来源。
[0004]阻碍从生物质原料广泛产生能量的主要障碍是普遍缺乏用于克服此类材料至有用产物的转化的低成本技术。生物质包含可被转化成乙醇或其它产物例如乙酸盐、丙酮酸盐、乳酸和乙酸的碳水化合物部分(例如，纤维素和半纤维素)以及戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)。为了转化这些部分，最终必须将纤维素、半纤维素、木糖和阿拉伯糖转化或水解成单糖；历史上已证明水解是有问题 的。
[0005]生物介导的过程有希望用于能量转化。涉及酶促或微生物水解的生物质处理方案通常包括4个生物介导的转化；(I)糖解酶(纤维素酶或半纤维素酶)的产生；(2)存在于预处理的生物质中的碳水化合物组分至糖的水解；(3)己糖(例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的发酵；和⑷戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)的发酵。这4个转化以单个步骤在称为联合生物加工(CBP)的过程配置中进行，所述过程配置与其它集成度不太高的配置区别在于其不包括用于纤维酶和/或半纤维素酶产生的专用处理步骤。
[0006]CBP提供了比特征在于专门的纤维素酶生产的方法成本更低且效率更高的潜力。有益之处部分来源于避免了与生产纤维素酶相关的资金成本、底料和其它原材料和设施。此外，使用CBP，数个因素支持实现较高速率的水解，因此减小了反应器的体积和资金投入，包括酶-微生物协同作用，以及使用噬热生物体和/或复合的纤维素酶系统。此外，纤维素粘附性的分解纤维素的微生物可能相对于非粘附性的微生物(例如污染物)成功地竞争纤维素水解的产物，这会增加基于微生物纤维素利用的工业方法的稳定性。通过以下两个策略在开发能够进行CBP的微生物方面取得了进展:对天然存在的分解纤维素的微生物进行工程化改造以改善与产物相关的特征，例如产率和效价；以及对表现出高产物产率和效价的不分解纤维素的生物体进行工程化改造以表达异源纤维素酶和半纤维素酶系统以能够利用纤维素和半纤维素。
[0007]满足乙醇产生的需要的一个方法是转化生物质、例如材料例如农业废物、玉米壳、玉米芯、纤维素物质等中发现的糖以产生乙醇或其它产物。在生物质转化中，将微生物用作生物催化剂来将纤维素物质转化成可使用的终产物例如乙醇。大规模工业应用中的高效生物质转化需要能够耐受高浓度的糖和乙醇并且能够同时发酵超过一种糖的微生物。
[0008]木糖极其丰富地存在于生物质原料中。其可构成多至40%的木质纤维素材料(Ladisch等人，Biotechnol Bioeng, 25:1-2，1983)。通过发酵,木糖可被转化成可用作液体燃料或化学原料的乙醇。通过酶促发酵或作为发酵的副产品，木糖还可被转化成木糖醇，其是有前景的具有减少龋齿的性质的天然甜味剂。木糖醇还可被糖尿病患者使用。
[0009]尽管许多细菌具有发酵简单己糖、戊糖的能力，但木糖和阿拉伯糖是其中在生物质中最难代谢的糖。一些细菌可将戊糖发酵成乙醇和其它副产品，具有改善的从戊糖产生乙醇的能力的细菌已经进行了遗传工程化。参见，例如，Xiao等人，Appl.Environ.Microbiol.,77:7886-7895,2011。然而，此类细菌对低pH和高浓度的乙醇敏感，它们在发酵中的用途与副产品形成相关，并且产生的乙醇水平仍然太低。由于至少这些原因，在大规模乙醇生产中使用此类细菌在经济上是不可行的。因此，本领域需要能够将戊糖发酵成乙醇的纤维素分解性生物体。
[0010]生物体例如解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium saccharoIyticum)天然地能够通过木糖异构酶途径利用木糖。在木糖异构酶途径中，木糖异构酶(XI)将木糖转化成木酮糖。随后木酮糖被利用ATP的激酶木酮糖激酶O(K)磷酸化成木酮糖-5-磷酸，其为戊糖磷酸途径的中间产物。因此，产生木糖发酵纤维素分解性生物体(所述生物体可用作CBP生物体)的一个方法是把将木糖发酵成乙醇所需的来自木糖异构酶途径的基因克隆进入纤维素分解性生物体，以便纤维素分解性生物体可产生代谢木糖所需要的酶。
[0011]热纤梭菌(Clostridium-thermocellum)是有很大潜能在联合生物加工配置中作为生物催化剂的高度分解纤维素的生物体。热纤梭菌作为CBP生物体的经济潜力受到其不能发酵木糖的能力的限制。目前不存在已知的能够发酵木糖的热纤梭菌菌株(无论是工程化的还是未工程化的)。因此，能够发酵木糖的热纤梭菌菌株将具有作为CBP生物体的极大工业适用性。
[0012]虽然已对热纤梭菌的基因组完全测序，并且已将许多热纤梭菌基因克隆进入其它细菌，但仍未建立用于将外来基因引入该微生物的可靠方法。此类方法的缺乏已成为对目的在于增加基础理解和应用能力的热纤梭菌的研究的重大障碍。由于使得热纤梭菌能够发酵木糖所需的多个且极其可能的基因组修饰，以及转化该生物体的困难和不可预测性，目前不能产生适用于从生物质工业化产生乙醇和其它产物的热纤梭菌菌株。因此，迄今为止，不存在已鉴定的具有发酵木糖的能力的热纤梭菌菌株。因此，在本领域需要开发一个或多个能够发酵木糖的热纤梭菌菌株，所述热纤梭菌菌株可在联合生物加工配置中用作生物催化剂。
[0013]本发明第一次提供了包含赋予热纤梭菌发酵木糖的能力的遗传修饰的热纤梭菌菌株。
[0014]发明概述
[0015]在一个实施方案中，本发明涉及能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞。
[0016]在另一个实施方案中，本发明涉及包含异源多核苷酸的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸具有与SEQ ID NO: 1-2的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一性的核苷酸序列；或SEQ ID NO:3-4的氨基酸序列。
[0017]本发明的另一个方面涉及发酵液，其包含:(a)能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和(b)培养基，其中所述培养基包含木糖，并且其中所述培养基能够支持所述宿主细胞的生长。
[0018]在另一个方面，本发明涉及包含能够发酵木糖的本发明的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种其它宿主细胞的共培养物。
[0019]在另一个实施方案中，本发明涉及发酵木糖的方法，包括温育反应混合物，所述反应混合物包含:(a)生物质，其中生物质包含木糖，和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木糖。
[0020]在另一个实施方案中，本发明涉及产生一种或多种木糖发酵产物的方法，包括:温育反应混合物，所述反应混合物包含:(a)生物质，其中生物质包含木糖，和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木糖以产生一种或多种木糖发酵产物。
[0021]在另一个实施方案中，本发明涉及能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞。
[0022]本发明的另一个方面涉及发酵液，所述发酵液包含:(a)能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和(b)培养基，其中培养基包含木聚糖，并且其中培养基能够支持所述宿主细胞的生长。
[0023]在另一个实施方案中，本发明涉及包含能够发酵木聚糖的本发明的重组热纤梭菌和至少一种其它宿主细胞的共培养物。
[0024]在另一个实施方案中，本发明涉及发酵木聚糖的方法，包括:温育反应混合物，所述反应混合物包含包括:(a) 生物质，其中生物质包含木聚糖；和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木聚糖。
[0025]在另一个实施方案中，本发明涉及产生一种或多种木聚糖发酵产物的方法，包括:温育反应混合物，所述反应混合物包含:(a)生物质，其中所述生物质包含木聚糖；和(b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞能够发酵木聚糖以产生一种或多种木聚糖发酵产物。
[0026]附图概述
[0027]图1描述了木糖异构酶/木酮糖激酶在LDH基因座上的整合。
[0028]图2描述了质粒pMU1793，其被设计和构建来将XI/XK操纵子整合在包含次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因的缺失的热纤梭菌的染色体中。
[0029]图3描述了 XI/XK操纵子在乳酸脱氢酶(LDH)基因座上的无缝整合的诊断性PCR确认的图像。野生型对照基因组DNA用于产生在泳道14中观察到的扩增子，观察到预期的
2.9KB条带。整合的XI/XK操纵子应当以4966bp (在泳道2_5和8中观察到的大小)运行。
[0030]图4描述了在利用热纤梭菌菌株T2(Aldh::XI/XK)接种的培养基中在156小时时的木糖浓度的终点分析。
[0031]图5描述了 T2菌株的终产物HPLC分析。
[0032]图6显示在48小时时在T3培养物中观察到的孢子形成的证据。
[0033]图7显示了 T3培养物在72小时时的显微镜检查。
[0034]图8描述了 T6培养物在10和20g/l木糖上的生长的终点分析。
[0035]图9显示了 T6培养物在10g/l微晶粉末纤维素(avicel)上的生长。
[0036]图10显示了 M2236培养物在包含木糖作为唯一糖源的CM3培养基上的生长。木糖被M2236菌株消耗并且M2236菌株产生乙醇，而M1570菌株不能将大量木糖转化成乙醇。
[0037]发明详述
[0038]本说明书公开了一个或多个整合本发明的特征的实施方案。公开的实施方案仅举例说明本发明。本发明的范围不限于公开的实施方案。本发明由其所附带的权利要求界定。
[0039]在下列说明中，为了解释目的，显示了具体的数字、材料和配置以提供完全彻底地理解本发明。然而，对于本领域技术人员来说很显然的是可在这些具体的详细内容不存在的情况下实施本发明。在一些情况下，可省略或简化公知的特征以使本发明明了。
[0040]描述的实施方案和以及本说明书中提及的〃 一个实施方案"、"一个不例性实施方案"等，表示描述的实施方案可包括具体的特征、结构或特性，但每一个实施方案可以不一定包括该具体的特征、结构或特性。此外，此类短语不一定是指同一个实施方案。此外，当结合实施方案描述具体特征、结构或特性时，应理解，结合其它实施方案(无论是否明确地描述过)实现这样的特征、结构或特性在本领域技术人员员的知识范围内。
[0041]本文中“一个/ 一种(a) ”或“一个/ 一种(an) ”的描述可指单数项或复数项。应理解，在本文中无论何处利用词语“包含”描述实施方案，也提供了以“由……组成的”和/或“基本上由……组成的”的术语描述的另外的类似实施方案。
[0042]定义
[0043]术语〃异源的〃，当用于指多核苷酸、基因、多肽或酶时，是指通常不是在宿主生物体中发现的多核苷酸、基因、多肽或酶。〃异源的〃还包括从来源生物体取出并且随后以与对应的天然基因不同的形式(例如，不在该生物体基因组的其天然位置中)引入来源生物体的天然编码区或其部分。可通过例如基因转移将异源多核苷酸或基因引入宿主生物体。异源基因可包括作为嵌合基因(包含被引入天然宿主的非天然调控区)的一部分的天然编码区。外来基因可包含插入非天然生物体或嵌合基因的天然基因。异源多核苷酸、基因、多肽或酶可来源于任何来源，例如真核生物、原核生物、病毒或合成的多核苷酸片段。如本文中所用，术语"异源的"是指来源于除内源来源外的来源的载体、质粒或宿主细胞的元件。因此，例如，异源序列可以是来源于来自相同宿主，来自宿主细胞的不同菌株或来自不同分类群(例如，不同界、门、纲、目、科、属或种或这些分类之一内的任何亚组)的生物体的不同基因或质粒的序列。术语〃异源的〃在本文中也与术语〃外源的〃同义地使用。
[0044]"启动子"意指帮助特定基因转录的DNA的区域。启动子通常位于它们调控的基因附近，在相同的链上和上游(朝向有义链的5’区域)。术语"启动子"或"替代启动子"意欲包括可转录地控制其在天然状态不转录地控制的目标基因的多核苷酸。在某些实施方案中，替代启动子的转录控制导致目标基因表达的增加。在某些实施方案中，将替代启动子置于目标基因的5’。替代启动子可用于替代天然启动子或除了天然启动子外还可使用替代启动子。替代启动子相对于其中使用其的宿主细胞是内源的，或其可以是被引入宿主细胞的异源多核苷酸序列，例如相对于其中使用其的宿主细胞是外源的。
[0045]如本文中所用，术语〃终止子〃或〃转录终止子〃是在基因组DNA上标记基因或操纵子转录结束的遗传序列的部分。
[0046]如本文中所用，术语〃操纵子〃是指包含一簇在单个调控信号或启动子的控制之下基因的基因组材料的功能单位。所述基因被一起转录成mRNA链，并且在细胞质中被一起翻译或经历反式剪接以产生单独翻译的单顺反子mRNA，即各自编码单个基因产物的mRNA的几条链。这样的结果是操纵子中包含的基因可一起表达或根本不表达。最初操纵子被认为仅存在于原核生物中，但自1990年代早期在真核生物中发现首个操纵子以来，已出现更多的证据表明它们比先前假定的更常见。操纵子主要存在于原核生物中，但也存在于一些真核生物中，包括黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫。
[0047]〃嗜热〃或〃耐热〃细菌是其最适生长温度高于约45°C的细菌。嗜热细菌为生物技术方法提供了许多有利方面，所述生物技术方法中有许多在高温下运行得更快和更高效。更高的温育温度增加扩散速率和非气态目标化合物的可溶性，并且倾向于阻止非嗜热微生物污染。在高温下进行的细胞培养还消除或极大减少了冷却成本。
[0048]〃嗜温〃意指在约20_45°C的温度下旺盛生长的生物体。
[0049]术语〃基因〃或〃多核苷酸〃或〃多核苷酸序列〃意欲包括核酸分子，例如多核苷酸，其包括编码多肽的开放阅读框，并且还可包括非编码调控序列和内含子。此外，该术语意欲包括映射至功能基因座的一个或多个基因。此外，该术语意欲包括用于选择目的的特定基因。基因对于宿主细胞可以是内源的或可被重组地引入宿主细胞，例如作为游离地维持的质粒或稳定地整合进入基因组的质粒(或其片段)。除了质粒形式以外，基因可以例如以线性DNA的形式存在。在某些实施方案中，基因或多核苷酸参与乙酸盐至不带电荷的溶剂、包括但不限于丙酮、异丙醇、乙酸乙酯或乙醇的生物转化的至少一个步骤。因此，该术语意欲包括编码多肽例如醋酸盐激酶(ACK)、磷酸乙酰转移酶(PTA)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)、醛脱氢酶(ADH)和/或醇脱氢酶(ADH)、乙酰-CoA转移酶(ACS)、乙醛脱氢酶、乙醛/醇脱氢酶、甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)、乙酰-CoA合成酶、硫解酶、CoA转移酶、乙酰乙酸脱羧酶、D-木糖途径中的酶例如木糖异构酶和木酮糖激酶，L-阿拉伯糖途径中的酶例如L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸4差向异构酶的任何基因。术语基因还意欲包括所有拷贝的特定基因，例如细胞中编码特定基因产物的所有DNA序列。
[0050]术语〃表达〃意欲包括基因至少在mRNA产生的水平上的表达。
[0051]术语〃表达产物〃意欲包括表达的基因的所得的产物，例如多肽。
[0052]术语〃纤维素分解活性〃意欲包括水解寡己糖或多己糖的糖苷键的能力。纤维素分解活性还可包括使纤维素和半纤维素解聚合或脱支的能力。
[0053]术语〃木聚糖分解活性〃意欲包括水解寡戊糖和多戊糖中的糖苷键的能力。
[0054]如本文中所用，术语〃乳酸脱氢酶〃或"LDH"意欲包括能够将丙酮酸盐转化成乳酸盐的酶。应理解，LDH还可催化羟基丁酸盐的氧化。LDH包括对应于酶委员会编号1.1.1.27的那些酶。
[0055]如本文中所用，术语〃醇脱氢酶〃或〃ADH〃意欲包括能够将乙醛转化成醇例如乙醇的酶。ADH还包括能够将丙酮转化成异丙醇的酶。ADH包括对应于酶委员会编号1.1.1.1的那些酶。
[0056]如本文中所用，术语〃磷酸乙酰转移酶〃或〃PTA〃意欲包括能够通过从5-磷酸核糖基1-焦磷酸转移5-磷酸核糖基，将次黄嘌呤转化成肌苷一磷酸和将鸟嘌呤转化成鸟苷一磷酸的酶。该酶在通过嘌呤补救途径产生嘌呤核苷酸中起着中心作用。HPT包括对应于酶委员会编号2.4.2.8的那些酶。
[0057]如本文中所用，术语〃次黄嘌呤转磷酸核糖基酶〃或〃HPT〃意欲包括能够将乙酰-磷酸转化成乙酰-CoA的酶。PTA包括对应于酶委员会编号2.3.1.8的那些酶。[0058]"木糖代谢酶"可以是参与木糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、转酮醇酶和转醛醇酶蛋白。参见例如 Gu 等人，BMC Genomics, 11:255-268，2010。
[0059]〃木酮糖激酶〃 (XK)意指催化化学反应:ATP+D_木酮糖# ADP+D-木酮糖5_磷酸的酶。因此，该酶的两种底物为ATP和D-木酮糖，而其两种产物为ADP和D-木酮糖5-磷酸。该酶属于转移酶的家族，特别是以醇基团作为受体的转移含磷基团的那些转移酶(磷酸转移酶)。该酶种类的系统名为ATP:D-木酮糖5-磷酸转移酶。常用的其它名称包括木酮糖激酶(磷酸化)和D-木酮糖激酶。该酶参与戊糖和葡糖醛酸的互变。XK包括对应于酶委员会编号2.7.1.17的那些酶。
[0060]〃木糖异构酶"(XI)意指催化化学反应:D_木糖# D-木酮糖的酶。该酶属于异构酶的家族，特别是使醛糖与酮糖互变的那些分子内氧化还原酶。该酶种类的系统名为D-木糖醛糖酮糖异构酶。 常用的其它名称包括D-木糖异构酶、D-木糖酮异构酶和D-木糖酮醇-异构酶。该酶参与戊糖与葡糖醛酸互变以及果糖和甘露糖代谢。该酶在工业上用于在高果糖玉米糖浆的制造中将葡萄糖转化成果糖。其有时被称为"葡萄糖异构酶〃。XI包括对应于酶委员会编号5.3.1.5的那些酶。
[0061]如本文中所用，术语〃木糖转运蛋白质〃或〃木糖转运蛋白〃意欲包括参与木糖横穿生物膜的运动(从而促进宿主生物体利用木糖)的膜蛋白。参见，例如Gu等人，BMCGenomics, 11:255-268, 2010。如本文中所用，术语〃木糖转运蛋白基因〃意欲包括编码木糖转运蛋白质的基因。
[0062]本发明的某些实施方案在微生物内提供了某些基因或特定多核苷酸序列的“灭活”或“缺失”，基因或特定多核苷酸序列的“灭活”或“缺失”可被理解为包括“遗传修饰”或“转化”，以便所述微生物的所得菌株可被理解为“遗传修饰的”或“转化的”。在某些实施方案中，微生物的菌株可来源于细菌、真菌或酵母。
[0063]本发明的某些实施方案在嗜热或嗜温微生物内提供了某些基因或特定多核苷酸序列的“插入”(例如，添加、整合、引入或导入)，基因或特定多核苷酸序列的插入可被理解为包括“遗传修饰”或“转化”，以便所述嗜热或嗜温微生物的所得菌株可被理解为“遗传修饰的”或“转化的”。在某些实施方案中，微生物的菌株可来源于细菌、真菌或酵母。
[0064]术语〃CBP生物体〃意欲包括本发明的微生物，例如具有适合于CBP的性质的微生物。
[0065]术语〃发酵(fermenting) 〃和〃发酵(fermentation) 〃意欲包括籍以从碳水化合物产生乙醇(特别地作为发酵的产物)的酶促过程(例如，细胞或无细胞，例如，裂解物或纯化的多肽混合物)。
[0066]如本文中所用，术语发酵的〃不期望的终产物〃意欲包括除乙醇和二氧化碳外的发酵产物。不期望的终产物可包括但不限于醋酸盐、乳酸盐、丙酮酸盐和甘油醛。
[0067]如本文中所用，〃选择〃或〃选择法〃或〃选择方案〃是指用于对给定的菌株施加压力(或攻击)以适合新的条件的方法。选择法有利于原始菌株的零星发生的“变体”，其中变体经历一些遗传或表观遗传改变，所述改变赋予适合于实施方案的培养条件的生长有利方面。
[0068]在本发明的一个方面，插入基因或特定多核苷酸序列以激活它们编码的活性例如酶的表达。在某些实施方案中，可将编码乙醇的代谢产生中的酶，例如代谢戊糖和/或己糖的酶的基因添加至嗜温或嗜热生物体。在本发明的某些实施方案中，酶可赋予代谢戊糖的能力以及参与例如D-木糖途径和/或L-阿拉伯糖途径。在本发明的某些实施方案中，可将编码将醋酸盐转化成不带电荷的溶剂(包括但不限于丙酮、异丙醇、乙酸乙酯或乙醇)的酶的基因添加至嗜温或嗜热生物体。
[0069]在本发明的一个方面，可部分、大体上或完全地缺失、沉默、灭活或下调基因或特定多核苷酸序列，以使它们编码的活性例如酶的表达失活。缺失提供了最大稳定性，因为不存在使突变回复以恢复功能的机会。或者，可通过插入破坏基因的功能和/或表达的核酸序列(例如，Pi转导或本领域已知的其它方法)，部分、大体上或完全地缺失、沉默、灭活或下调基因。术语〃消除(eliminate) 〃、〃消除(elimination) 〃和〃敲除〃可与术语〃缺失〃、〃部分缺失〃、〃大体上缺失〃或〃完全缺失〃互换使用。在某些实施方案中，可通过定点同源重组以敲除特定基因来工程化目标微生物的菌株。在其它实施方案中，可将RNAi或反义DNA (asDNA)用于部分、大体上或完全沉默、灭活或下调特定目标基因。
[0070]在某些实施方案中，本文中描述的被靶向缺失或灭活的基因对于微生物的天然菌株可以是内源的，从而可被理解为称为"天然基因"或"内源基因〃。如果生物体未曾被遗传工程化或未曾另外地通过人工以有意改变生物体的基因和/或表型构造的方式进行操作，则该生物体以“天然状态”存在。例如，野生型生物体可被认为以天然状态存在。在其它实施方案中，被靶向缺失或灭活的基因对于生物体可以是非天然的。
[0071]类似地，本文中描述的本发明的酶对于微生物的天然菌株可以是内源的，从而可被理解为称为“天然的”或“内源的”。
[0072]如本文中所用，术语〃表达〃是指来源于本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还可指mRNA至多肽的翻译。
[0073]术语〃木质纤维素 〃是指由木质素和纤维素组成的材料。
[0074]"糖解酶"可以是参与碳水化合物降解、代谢和/或水解的任何酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解和淀粉分解辅助酶(accessory enzyme)、菊糖酶、左聚糖酶和戊糖水解酶。
[0075]"戊糖利用酶"可以是参与戊糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木聚糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯糖异构酶、核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和/或木糖转醛醇酶。
[0076]〃纤维素分解酶〃可以是参与纤维素降解、代谢和/或水解的任何酶。术语〃纤维素酶"是指主要由真菌、细菌和原生动物产生的、催化纤维素的溶纤作用(即水解)的一类酶。然而，还存在由其它类型的生物体例如植物和动物产生的纤维素酶。已知几种在结构和机理上不同的不同类型的纤维素酶。该组酶的EC编号是EC3.2.1.4。存在基于催化的反应的类型的一般类型的纤维素酶:内切纤维素酶断裂内部键以破坏纤维素的晶体结构并且暴露单个纤维素多糖链；外切纤维素酶从由内切纤维素酶产生的暴露的链的末端切割2-4个单位，从而产生四糖或二糖例如纤维二糖。存在两个主要类型的外切纤维素酶(或纤维二糖水解酶，缩写为CBH)-从纤维素的还原末端向前作用的一个类型，和从纤维素的非还原末端向前作用的一个类型；纤维二糖酶或β -葡糖苷酶将外切纤维素酶产物水解成单个单糖；通过自由基反应使纤维素解聚的氧化纤维素酶，例如纤维二糖脱氢酶(受体)；使用磷酸盐而非水使纤维素解聚的纤维素磷酸化酶。在最熟悉的纤维素酶活性的案例中，酶复合物将纤维素断裂成β-葡萄糖。"纤维素酶"可以是参与纤维素降解、代谢和/或水解的任何酶,包括内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶、纤维糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、内切木聚糖酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、swollenin、葡糖醒酸基酯酶、棒曲霉素和阿魏酸酯酶蛋白。
[0077]〃淀粉分解酶〃可以是参与淀粉酶降解、代谢和/或水解的任何酶。术语〃淀粉酶〃是指将淀粉断裂成糖的酶。淀粉酶存在于人唾液中，在唾液中其开始降解的化学过程。包含大量淀粉但少量糖的食物例如大米和马铃薯，当咀嚼它们时味道有点甜，因为淀粉酶将其淀粉的一些淀粉在嘴里转化成糖。胰脏也使淀粉酶(α-淀粉酶)将饮食淀粉水解成二糖和三糖，所述二糖和三糖被其它酶转化成葡萄糖以给身体提供能量。植物和一些细菌也产生淀粉酶。所有淀粉酶都是糖苷水解酶并且作用于α-1,4-糖苷键。一些淀粉酶，例如Y-淀粉酶(葡糖淀粉 酶)，还作用于α -1, 6-糖苷键。淀粉酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1)、β -淀粉酶(EC3.2.1.2)和Y -淀粉酶(EC3.2.1.3)。淀粉酶可以是参与淀粉酶降解、代谢和/或水解的任何酶，包括α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶和α -葡糖苷酶。α -淀粉酶是钙金属酶，在钙不存在的情况下不能发挥作用。通过在沿着淀粉链的随机位置上作用，α -淀粉酶分解长链碳水化合物，最终从直链淀粉产生麦芽三糖和麦芽糖或从支链淀粉产生麦芽糖、葡萄糖和“极限糊精”。因为其可作用于底物的任何位置，因此α-淀粉酶倾向于比β_淀粉酶更快速地作用。在动物中，其是主要的消化酶并且其最适PH为约6.7-7.0。淀粉酶的另一种形式β_淀粉酶也可由细菌、真菌和植物合成。通过从非还原末端作用，β-淀粉酶催化第二 α-1，4糖甘键水解，一次切除两个葡萄糖单位(麦芽糖)。许多微生物产生降解细胞外淀粉的淀粉酶。除了切割直链淀粉和支链淀粉的非还原末端上的最后一个α (1-4)糖苷键，从而产生葡萄糖外，Y-淀粉酶还切割α (1-6)糖苷键。另一种淀粉分解酶是支链淀粉酶。支链淀粉酶是一个特殊类型的葡聚糖酶，是一种淀粉分解性的外酶，其降解支链淀粉。支链淀粉被当作通过α-1，6-糖苷链连接的麦芽三糖单位的链。支链淀粉酶(EC3.2.1.41)也被称为支链淀粉-6-葡聚糖水解酶(脱支酶)。另一种淀粉分解酶，异支链淀粉酶，将支链淀粉水解成异葡糖基麦芽糖(6-α-麦芽糖基葡萄糖)。异支链淀粉酶(EC3.2.1.57)也被称为支链淀粉4-葡聚糖水解酶。〃淀粉酶〃可以是参与淀粉酶降解、代谢和/或水解的任何酶，包括α-淀粉酶、β_淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。
[0078]术语〃木聚糖〃包括众多种在植物细胞壁和一些藻类中发现的高度复杂的多糖。木聚糖是从木糖的单位产生的多糖。
[0079]术语〃木聚糖酶〃是给予一类将线性多糖β -1, 4-木聚糖降解成木糖，从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的酶的名称。这样，其在以植物资源旺盛生长的微生物中起着主要作用(哺乳动物，相反地，不产生木聚糖酶)。此外，木聚糖酶存在于真菌中以将植物物质降解成可用的营养物。木聚糖酶包括对应于酶委员会编号3.2.1.8的那些酶。"木糖代谢酶"可以是参与木糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和木糖转醛醇酶蛋白。
[0080]"戊糖水解酶"可以是参与戊糖降解、代谢和/或水解的任何酶，包括木聚糖酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿拉伯糖异构酶、核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和/或木糖转醛醇酶。
[0081]生物质
[0082]生物质可包括本领域已知的或本文中描述的任何类型的生物质。术语〃木质纤维材料"、"木质纤维底物"和"纤维质生物质"意指包含纤维素、半纤维素、木质素或其组合的任何类型的生物质,例如但不限于木质生物质、牧草、草本能源作物、非木质植物生物质、农业废物和/或农业残渣、林业残渣和/或林业废物、造纸污泥和/或废纸污泥、废水处理污泥、城市固体废物、来自湿法及干法破碎玉米乙醇植物的玉米纤维和糖加工残渣。术语〃半纤维素质"、"半纤维素质部分"和"半纤维素质级分"意指木质纤维材料的非木质素、非纤维素组成部分，例如但不限于半纤维素(即，包含木糖葡聚糖、木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖)、果胶(例如，同型聚半乳糖醛酸、鼠李聚糖半乳糖醛酸I和II及木糖聚半乳糖醛酸)和蛋白聚糖(例如，阿拉伯半乳聚糖-蛋白、伸展蛋白和富含脯氨酸的蛋白质)。生物质还包括淀粉以及己糖和戊糖。
[0083]在非限定性实例中，木质纤维材料可包括但不限于木质生物质，例如再循环木浆纤维、锯屑、硬木材、软木材及其组合；草，例如柳枝稷、大米草、黑麦草、利甘草、芒草或其组合；糖加工残渣例如但不限于甘蔗渣；农业废物例如但不限于稻草、稻壳、大麦秸、玉米芯、谷类稻杆、小麦稻，油菜稻杆、燕麦稻杆、燕麦壳和玉米纤维；稻杆例如但不限于大豆稻杆，玉米稻杆；肉质植物(succulent),例如但不限于龙舌兰；和林业废物例如但不限于再循环木浆纤维、锯屑、硬木材(例如，白杨木、橡木、枫木、桦木、柳树)、软木材或其任意组合。木质纤维材料可包含一种纤维；或者，木质纤维材料可包含源自不同木质纤维材料的纤维的混合物。其它木质纤维材料是 农业废物例如谷类秸杆，包括小麦秸杆、大麦秸杆、油菜秸杆和燕麦秸杆；玉米纤维；秸杆例如玉米秸杆和大豆秸杆；草，例如柳枝稷、草芦、大米草和细叶芒；或其组合。
[0084]纸污泥也是用于乳酸盐或醋酸盐产生的活性的原料。纸污泥是从打浆和造纸产生的固体残渣，并且通常从初沉池中的处理废水中取出。
[0085]联合生物加工
[0086]联合生物加工(CBP)是用于纤维质生物质的加工策略，包括将如下4个生物介导的事件合并入单个过程步骤中:酶产生、水解、己糖发酵和戊糖发酵。实施此策略需要开发利用纤维素、半纤维素和其它生物质组分例如己糖和戊糖，同时还以足够高的产率和浓度产生目标产物的微生物。CBP的可行性得到动力学和生物能量分析支持。参见van Walsum和 Lynd (1998)Biotech.Bioeng.58:316。
[0087]醋酸
[0088]在两个通过磷酸转乙酰酶(PTA)和醋酸盐激酶(ACK)催化的反应步骤中从乙酰-CoA产生醋酸盐。由这些酶介导的反应示于下面:
[0089]PTA 反应:乙酰-CoA+ 磷酸=CoA+ 乙酰磷酸(EC2.3.1.8)
[0090]ACK 反应:ADP+ 乙酰磷酸=ATP+ 醋酸(EC2.7.2.1)[0091]热纤梭菌在标准发酵条件下产生醋酸并且具有良好注释的编码PTA和ACK的基因。
[0092]丙酮酸
[0093]丙酮酸是重要的代谢中间化合物。例如，在好氧条件下，丙酮酸可被氧化成乙酰辅酶A(乙酰-CoA)，随后乙酰辅酶A进入三羧酸循环(TCA)，该循环继而产生合成的前体、CO2和还原的辅因子。随后通过一系列酶促步骤将氢等同物提供给氧来氧化辅因子，从而导致水和ATP的形成。该能量生成过程称为氧化磷酸化。
[0094]木糖代谢
[0095]木糖是可被多种生物体代谢为有用的产物的五碳单糖。存在两个主要的木糖代谢途径，每一个途径在它们利用的特征酶中是独特的。一个途径称为〃木糖还原酶-木糖醇脱氢酶"或XR-XDH途径。木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)是用于该木糖降解法中的两个主要的酶。由XYLl基因编码的XR负责木糖至木糖醇的还原，并且得到辅因子NADH或NADPH的帮助。木糖醇 随后被通过XYL2基因表达的XDH氧化成木酮糖，并且专门地利用辅因子NAD+来实现。由于该途径中需要的不同辅因子以及它们可得以使用的程度的原因，不平衡可导致木糖醇副产品的过度生产以及期望的产物的产生不足。已在实验室中测试了XR和XDH酶水平的不同表达以试图最优化木糖代谢途径的效率。
[0096]木糖代谢的另一途径称为〃木糖异构酶〃 (XI)途径。酶XI负责将木糖直接转化成木酮糖，并且不通过木糖醇中间产物进行。两个途径都产生木酮糖，虽然使用的酶不同。在木酮糖产生后，XR-XDH和XI途径都通过木酮糖激酶(XK)(基因XKSl编码)继续进行，以进一步将木酮糖修饰成木酮糖-5-P，随后其进入戊糖磷酸途径以进行进一步分解代谢。
[0097]除了上述两个主要途径外，木糖还可通过两个氧化途径(称为Weimberg途径和Dahms途径)来进行分解代谢，所述两个途径在原核微生物中是共有的。Weimberg途径是这样的氧化途径:其中D-木糖被D-木糖脱氢酶氧化成D-xylono-内酯，随后内酯酶将所述内酯水解成D-木糖酸。木糖酸脱水酶分离出水分子，从而产生2-酮3-脱氧-木糖酸。第二脱水酶形成2-酮戍二酸半醒,其随后被氧化成2-酮戍二酸。Dahms途径的起始与Weimberg途径一样，但2-酮-3脱氧-木糖酸被醛缩酶分裂成丙酮酸和乙醇醛。
[0098]关于在木糖代谢过程中通过戊糖磷酸途径的流动的研究已显示限制该步骤的速度可有益于至乙醇的发酵的效率。可提高乙醇产量的对该流动的修饰包括a)降低磷酸葡糖异构酶活性，b)使GNDl基因缺失，和c)使ZWFl基因缺失(J印psson等人，Appl EnvironMicrobiol.68:1604-1609, 2002)。由于戊糖磷酸途径在代谢过程中产生额外的NADPH，因此限制该步骤将帮助修正NAD(P)H与NAD+辅因子之间的已明显的不平衡并且减少木糖醇副产物。比较两个木糖代谢途径的另一个实验显示XI途径最能够代谢木糖以产生最大的乙醇产率，而XR-XDH途径达到快得多的乙醇生产速率(Karhumaa等人，Microb CellFact.2007Feb5;6:5)。也参见国际公布号W02006/009434，将其通过引用整体并入本文。
[0099]宿主细胞
[0100]用于本发明的宿主细胞包括任何原核或真核细胞；例如，选自细菌、藻类和酵母细胞的微生物。其中适合用于本发明的宿主细胞是微生物例如，梭菌属(Clostridium)的微生物。
[0101]在一些实施方案中，宿主细胞是微生物。在一个实施方案中，微生物是耐热或嗜热微生物。
[0102]在一个实施方案中，宿主细胞可包含抗生素标记或可以不包含抗生素标记。在另一个实施方案中，宿主细胞是选自梭菌属的细菌和具有与梭菌属种类的特征相似的特征的其它细菌。
[0103]纤维素分解和木聚糖分解性微生物
[0104]在文献中报导为具有纤维素分解性和木聚糖分解性的几种微生物已通过多种方式表征，包括它们在微晶纤维素和桦木木聚糖以及多种其它糖上的生长的能力。此外，还可通过其它方式、包括但不限于它们使纤维素和半纤维素解聚和脱支的能力，来表征此类微生物。在一个实施方案中，目标纤维素分解性生物体是热纤梭菌。
[0105]表I概述了热纤梭菌在Avicel?.上的生长
[0106]
【权利要求】
1.一种能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞。
2.权利要求1的重组热纤梭菌宿主细胞，其包含一种或多种编码一种或多种能够代谢木糖的酶的异源多核苷酸。
3.权利要求1或2的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主包含编码木糖异构酶的异源多核苷酸。
4.权利要求1-3的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主包含编码木酮糖激酶的异源多核苷酸。
5.权利要求2-4的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞,其中所述一种或多种异源多核苷酸来源于解糖热厌氧杆菌。
6.权利要求2-5的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含乳酸脱氢酶启动子和终止子。
7.包含一种或多种异源多核苷酸的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 1-2的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一性的核苷酸序列。
8.权利要求7的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸包含与SEQID NO: 1-2的核苷酸序列之任一项具有至少95%的同一'丨生的核苷酸序列。
9.权利要求8的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述多核苷酸包含与SEQID NO: 1-2的核苷酸序列之任一项相同的核苷酸序列。
10.权利要求2-9的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸被表达。
11.权利要求10的重组热纤梭菌宿主细胞，其中一种或多种异源多核苷酸的表达赋予重组宿主细胞发酵木糖的能力。
12.权利要求2-11的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸被稳定地整合进入宿主细胞的基因组。
13.权利要求2-12的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其包含至少两个拷贝的整合进入宿主细胞的基因组的异源多核苷酸。
14.权利要求2-13的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在特定的位点被整合进入宿主细胞的基因组。
15.权利要求2-14的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中异源多核苷酸的至少一个的整合发生在宿主细胞的基因组的特定基因的位点。
16.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中特定基因是宿主细胞的乳酸脱氢酶基因。
17.权利要求2-11的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在宿主细胞中存在于染色体外质粒中。
18.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于异源多核苷酸的整合而被破坏。
19.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于异源多核苷酸的整合而缺失。
20.权利要求18的重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞不能产生被破坏的基因的蛋白质产物。
21.权利要求19的重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞不能产生缺失基因的蛋白质产物。
22.权利要求2-21的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种编码一种或多种酶的异源多核苷酸包含在操纵子中。
23.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中将一种或多种异源多核苷酸的起始密码子与特定基因的启动子在读框内整合在宿主细胞的基因组中。
24.权利要求15的重组热纤梭菌宿主细胞，其中将一种或多种异源多核苷酸的终止密码子与特定基因的终止子在读框内整合在宿主细胞的基因组中。
25.权利要求2-11的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸随机整合进入宿主细胞的基因组。
26.权利要求7的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸编码包含与SEQIDNO:3-4的氨基酸序列之任一项具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。
27.权利要求8的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸编码包含与SEQIDNO:3-4的氨基酸序列之任一项具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。
28.权利要求9的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸编码包含与SEQIDNO:3-4的氨基酸序列之任一项相同的氨基酸序列的多肽。
29.权利要求1-28的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含对于宿主细胞是内源的一个或多个基因的缺失。
30.权利要求29的重组热纤梭菌宿主细胞，其中一个或多个对于宿主细胞是内源的基因的缺失包括次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPT)基因。
31.权利要求1-30的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木糖发酵成乙醇。
32.权利要求1-30的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木糖发酵成乙酸。
33.权利要求1-30的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木糖发酵成丙酮酸。
34.权利要求1-33的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含PTA基因的缺失。
35.权利要求34的重组热纤梭菌宿主细胞，其中宿主细胞将木糖发酵成乙醇作为终产物并且不产生不期望的终产物。
36.一种发酵液，其包含: (a)能够发酵木糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和 (b)培养基，其中所述培养基包含木糖，并且其中所述培养基能够支持所述宿主细胞的生长。
37.权利要求36的发酵液，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求1-35的任一项的宿主细胞。
38.一种共培养物，其包含权利要求1-35的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种其它宿主细胞。
39.权利要求38的共培养物，其中所述宿主细胞表达相同的木糖代谢酶。
40.权利要求38的共培养物，其中所述宿主细胞表达不同的木糖代谢酶。
41.权利要求38的共培养物，其中所述宿主细胞表达至少一种共同的木糖代谢酶。
42.发酵木糖的方法，其包括: 温育反应混合物，所述反应混合物包含: (a)生物质，其中所述生物质包含木糖；和 (b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木糖。
43.权利要求42的方法，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求1-35的任一项的宿主细胞。
44.产生一种或多种木糖发酵产物的方法,包括: 温育反应混合物，所述反应混合物包括: (a)生物质，其中所述生物质包含木糖；和 (b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木糖以产生一种或多种木糖发酵产物。
45.权利要求44的方法，其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求1-35的任一项的宿主细胞。
46.权利要求44的方法，其中所述一种或多种木糖发酵产物包括乙醇。
47.重组热纤梭菌宿主细 胞，其能够发酵木聚糖。
48.权利要求47的重组热纤梭菌宿主细胞，其包含一种或多种编码一种或多种能够代谢木聚糖的酶的异源多核苷酸。
49.权利要求48的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸在特定位点整合进入宿主细胞的基因组。
50.权利要求49的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述异源多核苷酸的至少一个的整合发生在宿主细胞的基因组的特定基因的位点。
51.权利要求50的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于所述异源多核苷酸的整合而被破坏。
52.权利要求50的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述特定基因由于所述异源多核苷酸的整合而缺失。
53.权利要求51的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞不能产生被破坏的基因的蛋白质产物。
54.权利要求52的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞不能产生缺失基因的蛋白质产物。
55.权利要求48的重组热纤梭菌宿主细胞,其中所述一种或多种异源多核苷酸在宿主细胞中存在于染色体外质粒中。
56.权利要求48的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸随机整合进入宿主细胞的基因组。
57.权利要求47-56的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞将木聚糖发酵成乙醇。
58.一种发酵液,其包含: (a)能够发酵木聚糖的重组热纤梭菌宿主细胞；和 (b)培养基，其中所述培养基包含木聚糖，并且其中所述培养基能够支持所述宿主细胞的生长。
59.权利要求58的发酵液,其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求47-56的任一项的宿主细胞。
60.—种共培养物,其包含权利要求47-56的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种其它宿主细胞。
61.权利要求60的共培养物，其中所述宿主细胞表达相同的木聚糖代谢酶。
62.权利要求60的共培养物，其中所述宿主细胞表达不同的木聚糖代谢酶。
63.权利要求60的共培养物，其中所述宿主细胞表达至少一种共同的木聚糖代谢酶。
64.发酵木聚糖的方法，其包含: 温育反应混合物，所述反应混合物包含: (a)生物质，其中所述生 物质包含木聚糖；和 (b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木聚糖。
65.权利要求64的方法,其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求47-56的任一项的宿主细胞。
66.产生一种或多种木聚糖发酵产物的方法,其包括: 温育反应混合物，所述反应混合物包含: (a)生物质，其中所述生物质包含木聚糖；和 (b)重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述宿主细胞能够发酵木聚糖以产生一种或多种木聚糖发酵产物。
67.权利要求66的方法,其中所述重组热纤梭菌宿主细胞是权利要求47-56的任一项的宿主细胞。
68.权利要求66的方法，其中所述一种或多种木聚糖发酵产物包括乙醇。
69.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞,其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 5-21的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一'I"生的核苷酸序列。
70.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞,其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO: 5-21的核苷酸序列之任一项具有至少95%的同一'I"生的核苷酸序列。
71.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:5-21的核苷酸序列之任一项相同的核苷酸序列。
72.权利要求69的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一项具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。
73.权利要求70的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一项具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。
74.权利要求71的重组热纤梭菌宿主细胞，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQ ID NO:22-38的氨基酸序列之任一项相同的氨基酸序列的多肽。
75.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞,其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一项具有至少90%的同一'I"生的核苷酸序列。
76.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞,其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO:39-50的核苷酸序列之任一项具有至少95%的同一'I"生的核苷酸序列。
77.权利要求1-34的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞，其还包含一种或多种异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID N0:39-50的核苷酸序列之任一项相同的核苷酸序列。
78.权利要求75的重组热纤梭菌,其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQID NO:51-62的氨基酸序列之任一项具有至少90%的同一性的氨基酸序列的多肽。
79.权利要求76的重组热纤梭菌,其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQID NO:51-62的氨基酸序列之任一项具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽。
80.权利要求77的重组热纤梭菌，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含与SEQID NO:51-62的氨基酸序列之任一项相同的氨基酸序列的多肽。
81.—种共培养物，其包含权利要求1-35的任一项的重组热纤梭菌宿主细胞和至少一种权利要求69-80的任一项的其它重组热纤梭菌宿主细胞。
82.权利要求1-35的任一项的第一重组热纤梭菌宿主细胞，其通过在包含木糖作为唯一糖源的培养基上生长10代以产生第二重组热纤梭菌宿主细胞来进行选择，所述第二重组热纤梭菌宿主细胞比未经历 所述选择的在其它方面相同的细胞更高效地利用木糖。
【文档编号】C12P19/24GK103429751SQ201180066549
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年12月22日 优先权日:2010年12月22日
【发明者】A·阿吉罗斯, T·巴雷特, N·卡亚萨, D·霍格塞特 申请人:马斯科马公司