用于产生发酵产物的工艺的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其中在液化过程中存在和/或添加热稳定性α-淀粉酶和任选的热稳定性蛋白酶。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。
【专利说明】用于产生发酵产物的工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。
[0002]涉及序列表
[0003]本发明包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
[0004]发明背景
[0005]从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇在本领域是公知的。在产业上，目前使用两种不同种类的工艺。最常用的工艺，通常称作“常规工艺”，包括通常使用细菌α-淀粉酶在高温液化糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同步糖化和发酵(SSF)。另一种公知的工艺，通常称作“生淀粉水解”工艺(RSH工艺)，包括在起始糊化温度以下，通常在酸性真菌α -淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下，同时糖化和发酵粒状淀粉。
[0006]虽然在过去十年中发酵产物产生工艺显著改善，但显著量的剩余淀粉物质并未转化为所需的发酵产物如乙醇。至少一些未转化的剩余淀粉物质例如糖和糊精为不可发酵的Maillard产物的形式。
[0007]因此，仍然存在对提供下述用于从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺的需要，所述工艺可与常规工艺相比提供更高的发酵产物产率。
【发明内容】
[0008]本发明涉 及使用发酵生物从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。
[0009]在第一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺，其包括下述步骤:
[0010]i)在80至90°C范围的温度在4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料:
[0011]-0-淀粉酶，其在？!14.5，851:，0.121111 CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)；
[0012]-任选地，蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为800C /70°C的相对活性确定的；
[0013]ii)使用糖源生成酶进行糖化；
[0014]iii)使用发酵生物进行发酵。
[0015]在一个实施方案中，在步骤i)的液化过程中存在和/或添加糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或普鲁兰酶(pulIulanase)。
[0016]在一个第二个方面，本发明涉及组合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中
[0017]i)所述 α -淀粉酶在 ρΗ4.5，85。。，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min);和
[0018]ii)所述蛋白酶具有作为80°C /70°C的相对活性确定的超过20%的热稳定性值。
[0019]在一个实施方案中，所述组合物进一步包含糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或普鲁兰酶。
[0020]在一个实施方案中，在液化步骤i)过程中存在和/或添加第二 α -淀粉酶。[0021 ] 在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含:
[0022]i) α -淀粉酶，其在 pH4.5，85°C，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T l/2(min)，来源于嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophi lus)；
[0023]ii)蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的，且该蛋白酶来源于激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和/或橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus);和任选的
[0024]iii)葡糖淀粉酶,其来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)
[0025]在一个实施方案中，所述组合物包含第二 α -淀粉酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1显示用α-淀粉酶1407、并且用或不用蛋白酶Pfu或葡糖淀粉酶ΡΕ001，在ΡΗ4.8制备的用于液化(85°C )的54小时的乙醇的比较。
[0027]图2显示对于实施例10中的实验在32%DS的峰值和断裂粘度(breakviscosity),其比较了
[0028]- α -淀粉酶 A(l.4 微克)(ρΗ5.8)；
[0029]- α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0030]- α -淀粉酶A (0.35微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0031 ] - α -淀粉酶A (0.7微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196(1微克)(ρΗ4.8)；
[0032]图3显示了对于实施例10中的实验在32°C在32%DS的最终粘度，其比较了:
[0033]- α -淀粉酶 A(l.4 微克)(ρΗ5.8)；
[0034]- α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0035]- α -淀粉酶A (0.35微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196 (I微克)(ρΗ4.8)；
[0036]- α -淀粉酶A (0.7微克)+ α -淀粉酶1407 (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶196(1微克)(ρΗ4.8).[0037]图4显示了对于实施例10中的实验在32%DS的峰值和断裂粘度，其比较了 α -淀粉酶八(1.4微克)(?!15.8)和α-淀粉酶A (1.4微克)+葡糖淀粉酶ΡΕ001 (10微克)+蛋白酶 196(1 微克)(ρΗ4.8)。
[0038]图5显示了对于实施例10中的实验在32°C在32%DS的最终粘度，比较了 α -淀粉酶八(1.4微克)(?册.8)和α-淀粉酶Α(1.4微克)+葡糖淀粉酶PEOOldO微克)+蛋白酶196(1微克)(?財.8).[0039]发明详述
[0040]本发明涉及使用发酵生物从含淀粉材料产生发酵产物如乙醇的工艺。本发明亦涉及适用于本发明的工艺的组合物。
[0041]本发明人显示了本发明的工艺具有多种优点。如实施例中所示，本发明的工艺导致较高的乙醇产率。其它益处包括对使用H2SO4调整pH的需求减少。这导致DDGS中的下游的硫更少，前端沾污(front end fouling)更少，啤酒石(beerstone)更少，且植酸沉淀更少。
[0042]本发明的工艺亦导致糖和糊精损失为Maillard产物的减少。DDGS的颜色得到改善，且热交换器寿命(较少的固体)得到延长。此外，由于所用的酶的较高热稳定性，可减少酶剂量。本发明的工艺仅需对现存工艺和工艺设备进行有限的变化，因此仅需有限的资金投入。
[0043]由于在液化中存在如本文中定义的热稳定性α-淀粉酶和第二 α-淀粉酶，(进一步)减少了例如衆料罐(slurry tank)中的峰值粘度。这导致混合消耗的能量减少。而且，具有较低的平均粘度可改善浆料罐中醪/淀粉的混合，及其在整个液化工艺中的抽运(pumping)。[0044]在第一个方面，本发明涉及用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤:
[0045]i)在80°C至90°C范围的温度、4.5至5.0范围的pH使用下述酶来液化含淀粉材料:
[0046]- α -淀粉酶，其在 ρΗ4.5，85°C，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)；
[0047]-任选的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为800C /70°C的相对活性确定的；
[0048]ii)使用糖源生成酶进行糖化；
[0049]iii)使用发酵生物进行发酵。
[0050]在一个优选实施方案中，步骤ii)和iii)顺序或同时进行。在液化步骤i)之前和/或之中可添加热稳定性α -淀粉酶，和任选的热稳定性蛋白酶，以及任选的糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的普鲁兰酶。热稳定性α-淀粉酶的实例可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的α-淀粉酶”部分。热稳定性蛋白酶的实例可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的蛋白酶”部分。本发明的组合物可合适地在本发明的工艺中使用。然而亦可分别添加酶组分。
[0051]在一个优选实施方案中，在液化过程中的pH为4.5至4.8。
[0052]在一个实施方案中，在液化过程中亦存在糖源生成酶。在一个优选实施方案中，所述糖源生成酶是热稳定性葡糖淀粉酶。在一个实施方案中，所述糖源生成酶不同于在步骤?)中的糖化和/或步骤iii)中的发酵过程中使用的糖源生成酶。
[0053]“糖源生成酶”的实例，包括特别是葡糖淀粉酶，可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。热稳定性葡糖淀粉酶的实例可见于下文“在液化过程中存在和/或添加的葡糖淀粉酶”部分。
[0054]在一个实施方案中，本发明的工艺进一步在步骤i)之前包括下述步骤:
[0055]a)降低含淀粉材料的粒度,优选通过干磨；
[0056]b)形成包含含淀粉材料和水的浆料。
[0057]所述含淀粉材料如全谷粒可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。通常存在两种方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨提供胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的地方。干磨和湿磨在淀粉加工领域是已知的。根据本发明，优选干磨。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05到3.0mm,优选0.1-0.5mm,或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更加优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.0mm筛目(screen),优选0.1到0.5mm筛目的筛。在另一个实施方案中，至少50%，优选至少70%，更优选至少80%，特别是至少90%的含淀粉材料可穿过具有#6筛目的筛。
[0058]水性浆料可含有10_55w/w%干固形物(DS)，优选25_45w/w%干固形物(DS)，更优选30-40w/w%干固形物(DS)的含淀粉材料。将浆料加热到糊化温度以上，优选80至90°C，ρΗ4.5至4.8，进行约15至60分钟。
[0059]可将热稳定性α-淀粉酶，任选的热稳定性蛋白酶和任选的糖源生成酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选的普鲁兰酶添加至所述水性浆料以起始液化(稀化(thinning))。在一个实施方案中,仅将一部分酶共混物(本发明的组合物)添加至所述水性浆料，而将剩余的酶在液化步骤i)过程中添加。液化步骤i)通常在80至90°C，pH4.5至4.8进行I至3小时。
[0060]在一个实施方案中，在进行步骤(a)中的液化之前，所述水性浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使衆料糊化。所述喷射蒸煮可在110至145°C,优选120至140°C,如125至135°C，优选约130°C的温度进行约I至15分钟，优选约3至10分钟，特别是约5
分钟左右。
[0061]糖化和发酵
[0062]在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中存在和/或添加一种或多种糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶。所述糖源生成酶可优选为葡糖淀粉酶，但亦可为选自下组的酶:β -淀粉酶，产麦芽糖淀粉酶和α -葡糖苷酶。
[0063]糖源生成酶包括葡糖淀粉酶的实例，可见于下文“在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加的糖源生成酶”部分。
[0064]当进行顺序糖化和发酵时，糖化步骤ii)可使用本领域中公知的条件进行。举例而言，糖化步骤ii)可持续约24至约72小时，然而经常仅在30至65°C，通常约60°C的温度进行通常40至90分钟的预糖化，接着在同步糖化和发酵(“SSF”)中在发酵过程中进行糖化。糖化通常在20至75°C，优选40至70°C，通常60°C左右的温度，和在4至5的pH，正常约PH4.5进行。
[0065]同步糖化和发酵(“SSF”)广泛用于产业规模的发酵产物产生工艺，特别是乙醇产生工艺。当进行SSF时，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)同时进行。对于糖化无保持阶段，意指发酵生物如酵母和酶可一同添加。SSF根据本发明通常在25°C至40°C，约28°C至35°C，如30°C至34°C，优选大约32°C左右的温度进行。在一个实施方案中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。在一个实施方案中，pH为3.5至5，特别是3.8至4.3。
[0066]发酵培养基
[0067]发酵培养基("Fermentationmedia"或"fermentation medium")指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源。发酵培养基可包含对于发酵生物的营养物和生长刺激物。营养物和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；尿素、维生素和矿物质，或其组合。
[0068]发酵牛物[0069]术语“发酵生物”指任何适用于发酵工艺并能够产生所需发酵产物的生物，包括细菌生物和真菌生物。特别合适的发酵生物能够将糖，如葡萄糖或麦芽糖，直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物，如乙醇。发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)的菌株。
[0070]在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基中活的发酵生物如酵母计数为IO5至1012，优选IO7至101°的范围内，特别是约5xl07。[0071 ] 商业上可获得的酵母包括，例如RED STAR?和ETHANOL RED?酵母(可从Fermentis/Lesaffre, USA 获得),FALI (可从 Fleischmann，s Yeast, USA 获得),SUPERSTART和 THERMOSACC?新鲜酵母(可从Ethanol Technology, WI, USA获得)，B10FERM AFT和 XR (可从 NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, USA 获得)，GERT STRAND (可从Gert Strand AB, Sweden 获得)和 FERM10L (可从 DSM Specialties 获得)。
[0072]含淀粉材料
[0073]根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。起始材料通常基于所需的发酵产物而选择。适用于本发明的工艺的含淀粉材料的实例包括全谷粒、玉米、小麦、大麦、黑麦、买罗高粱、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆类(peas)、豆类(beans)或甘薯，或其任意混合物，或从其来源的淀粉，或谷类。亦涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。
[0074]发酵产物
[0075]术语“发酵产物”意指由包括使用发酵生物的发酵步骤的工艺产生的产物。根据本发明涵盖的发酵产物包括醇(例如乙醇，甲醇，丁醇)；有机酸(例如柠檬酸，乙酸，衣康酸，乳酸，琥珀酸，葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如4和CO2);抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B12, β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选实施方案中`，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或在可消费醇类工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈忙啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcoholbeer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。所用的优选发酵工艺包括醇类发酵工艺。根据本发明获得的发酵产物如乙醇，可优选地用作燃料，其通常与汽油混合。然而，在乙醇的情况下，其亦可用作可饮用的乙醇。
[0076]
[0077]在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏发酵培养基以提取所需发酵产物，或可通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基提取所需发酵产物。或者，发酵产物可通过汽提或其它本领域公知的方法来回收。
[0078]在液化过程中存在和/或添加的α -淀粉酶
[0079]根据本发明，在液化过程中存在和/或添加热稳定性α-淀粉酶，热稳定性α-淀粉酶任选地与热稳定性蛋白酶，和任选地与糖源生成酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶，和/或任选地与普鲁兰酶一同存在和/或添加。根据本发明，α -淀粉酶在ΡΗ4.5至5.0的液化中对淀粉溶解具有高活性，且在ΡΗ4.5至5.0和80°C至90°C，优选pH4.5至4.8，85°C左右具有闻热稳定性。[0080]更具体而言，用于本发明的工艺的α -淀粉酶，如实施例1中所述确定，在ρΗ4.5，85。。，0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)。
[0081]在一个优选实施方案中，在pH4.5，85°C，0.12mM CaCl2的T 1/2 (min)为至少15，如至少20，如至少25，如至少30，如至少40，如至少50，如至少60，如10-70，如15-70，如20-70，如 25-70，如 30-70，如 40-70，如 50-70，如 60-70。
[0082]在一个实施方案中所述热稳定性α -淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶变体，其与公开于WO 99/019467的SEQ ID NO:3的多肽或本文中的SEQ ID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
[0083]在本发明的一个实施方案中所述α -淀粉酶是细菌α _淀粉酶，优选来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是如作为SEQ ID N0:3公开于WO 99/019467或本文中的SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌，其具有双重缺失I181+G182和取代N193F，进一步包括下述突变:
[0084]
【权利要求】
1.一种用于从含淀粉材料产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤: i)在80至90°C范围的温度、4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料: -α -淀粉酶，其在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)； -任选的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的； ?)使用糖源生成酶进行糖化； iii)使用发酵生物进行发酵。
2.权利要求1的工艺，其中所述α-淀粉酶是细菌α -淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) α -淀粉酶的变体，例如本文中SEQ ID NO:1所不的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别地，所述嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是截短的，优选截短为具有大约491个氨基酸。
3.权利要求2的工艺，其中所述α-淀粉酶变体与本文中的SEQID NO:1的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，以及甚至最优选至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
4.权利要求1-3任一项的工艺，所述α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其截短为具有大约491个氨基酸，并具有选自下组的突变:
-1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S ；
-1181*+G182*+N19 3F+E129V+K177L+R179E ;和
-1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
5.权利要求1-4任一项的工艺，其中在液化步骤i)过程中添加第二α-淀粉酶。
6.权利要求1-5任一项的工艺，其包括下述步骤: i)在80至90°C范围的温度、4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料: -α-淀粉酶，其在pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2具有至少10的T 1/2 (min)，优选为权利要求2-4任一项所述的α -淀粉酶；以及第二 α -淀粉酶，其在pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2具有少于10的T 1/2 (min)； -蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的； ?)使用糖源生成酶进行糖化； iii)使用发酵生物进行发酵。
7.权利要求1-6任一项的工艺，其中所述蛋白酶是作为本文中的SEQID N0:3的成熟部分公开的金属蛋白酶的变体，优选所述蛋白酶变体与本文中SEQ ID N0:3的多肽的成熟部分具有至少75%同一性，优选至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，以及甚至最优选至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
8.权利要求1-7任一项的工艺，其中所述蛋白酶是SEQID N0:3中所示的橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)蛋白酶的变体,其具有选自下组的突变:
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L ；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L ；-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L ;和
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。
9.权利要求1-8任一项的工艺，其中所述蛋白酶是细菌来源的，例如是来源于火球菌属(Pyrococcus)的菌株、优选激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株的蛋白酶,优选所述蛋白酶是与本文中的SEQ ID NO: 13具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性的蛋白酶。
10.权利要求1-9任一项的工艺，进一步地，其中在液化步骤i)过程中存在和/或添加糖源生成酶，优选葡糖淀粉酶，特别是其中所述糖源生成酶是在85°C、pH5.3具有至少30%，优选至少35%的热稳定性的葡糖淀粉酶。
11.权利要求10的工艺，其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，优选来源于青霉属(Penicillium)的菌株的葡糖淀粉酶，特别是作为本文中的SEQ ID N0:9或14公开的草酸青霉(Penicillium oxalicum)的菌株的葡糖淀粉酶,特别是其中所述糖源生成酶是所述来源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶的变体，其在SEQ ID NO:9或14中具有K79V取代(使用SEQ ID NO: 14中所示的成熟序列进行编号)，例如其中所述葡糖淀粉酶与本文中的SEQID NO: 9或14中所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，以及甚至最优选至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。
12.权利要求1-11任一项的工艺，进一步地，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加葡糖淀粉酶，优选其中所述葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属(Aspergillus),优选黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.0ryzae)的菌株；或木霉属(Trichoderma),优选里氏木霉(T.reesei)的菌株；或踝节菌属(Talaromyces),优选埃默森踝节菌(T.emersonii)的菌株，或密孔菌属(Pycnoporus)的菌株,或Gloephyllum的菌株 。
13.权利要求1-12任一项的工艺，进一步地，其中在液化和/或糖化过程中存在普鲁兰酶。
14.权利要求1-13任一项的工艺，其包括下述步骤: i)在80至90°C范围的温度、4.5至5.0范围的pH使用下述来液化含淀粉材料: -来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α -淀粉酶，其在ΡΗ4.5、85°C、0.12mMCaCl2具有至少10的 T 1/2(min)； -来源于激烈火球菌或橙橘嗜热子囊菌的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的；?)使用葡糖淀粉酶进行糖化；iii)使用发酵生物进行发酵。
15.—种组合物，其包含α-淀粉酶和蛋白酶，其中 i)所述 α -淀粉酶在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)；?)所述蛋白酶具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的。
16.权利要求15的组合物，其中所述α-淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如本文中的SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，特别地，其中所述嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶变体是截短的，优选截短为具有大约491个氨基酸，特别地，其中所述α-淀粉酶变体与本文中的SEQ ID NO:1的多肽的成熟部分具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，以及甚至最优选至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，但少于100%的同一性。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述α-淀粉酶来源于嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶，其截短为具有大约491个氨基酸，具有选自下组的突变:
-1181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S ；
-1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E ;和
-1181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
18.权利要求15-17任一项的组合物，进一步地，其中所述组合物包含第二α-淀粉酶，特别是细菌来源的第二 α-淀粉酶。
19.权利要求15-18任一项的组合物，其包含: -α -淀粉酶，其在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有至少 10 的 T 1/2 (min)； -第二 α -淀粉酶，其在 pH4.5、85°C、0.12mM CaCl2 具有少于 10 的 T 1/2 (min)； -蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的； -热稳定性葡糖淀粉酶。`
20.权利要求15-19任一项的组合物，其中所述蛋白酶具有作为80°C/70°C的相对活性确定为超过30%，超过40%，超过50%，超过60%，超过70%，超过80%，超过90%，超过100%，例如超过105%，例如超过110%，例如超过115%，例如超过120%的热稳定性。
21.权利要求15-20任一项的组合物，其中所述蛋白酶是SEQID NO:3中显示的橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的变体，具有选自下组的突变:
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L ；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L ；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L ；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L。
22.权利要求15-21任一项的组合物，其中所述蛋白酶来源于火球菌属的菌株，优选激烈火球菌的菌株，其中所述蛋白酶与本文中的SEQ ID NO: 13具有至少80%，例如至少85%，例如至少90%，例如至少95%，例如至少96%，例如至少97%，例如至少98%，例如至少99%的同一性。
23.权利要求15-22任一项的组合物，其进一步包含糖源生成酶，特别是其中所述糖源生成酶是葡糖淀粉酶，其优选在85°C、pH5.3具有至少20%，至少30%，优选至少35%的相对活性热稳定性，特别是其中所述葡糖淀粉酶来源于青霉属的菌株，特别是草酸青霉的菌株，其作为本文中的SEQ ID NO:9或14公开，特别是其中所述糖源生成酶是所述来源于草酸青霉的菌株的葡糖淀粉酶变体，其在SEQ ID NO:9或14中具有K79V取代(使用SEQ ID NO: 14中所示的成熟序列进行编号)，特别是其中所述葡糖淀粉酶与本文中的SEQ ID NO:9或14中所示的成熟多肽具有至少80%，更优选至少85%，更优选至少90%，更优选至少91%，更优选至少92%，甚至更优选至少93%，最优选至少94%，和甚至最优选至少95%，例如甚至至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的同一性。
24.权利要求15-23的组合物，进一步包含普鲁兰酶。
25.权利要求15-24任一项的组合物，其包含: i)来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α -淀粉酶，其在pH4.5、85°C、0.12mMCaCl2具有至少10的 T 1/2(min)； ?)来源于激烈火球菌或橙橘嗜热子囊菌的蛋白酶，其具有超过20%的热稳定性值，所述热稳定性值是作为80°C /70°C的相对活性确定的；和任选的iii)来源于草酸青霉的 葡糖淀粉酶。
【文档编号】C12P7/06GK103608460SQ201180068324
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2011年12月21日 优先权日:2010年12月22日
【发明者】R.德因哈默, S.克拉克, M.奎罗斯, J.马修斯, A.G.朱尔曼德, C-L.宋, 松井知子, 高木忍 申请人:诺维信北美公司, 诺维信公司