用于预测体外受精的成功的新方法和试剂盒的制作方法

用于预测体外受精的成功的新方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明包括一种基于比率确定成功怀孕的方法，所述比率表示为使用在受试者的样品，优选为尿液样品中存在的乳酸菌和葡萄球菌与存在的细菌总量之间的关系的公式。本发明还包括一种用于实施本发明的方法并且输出结果的试剂盒，优选为qPCR试剂盒。这种方法和试剂盒在正在经历或符合进行人工受精方法的条件(例如IVF或ICSI)的受试者中预测成功怀孕的可能性是尤其有利。
【专利说明】用于预测体外受精的成功的新方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及人类生殖的领域，更具体地涉及人类生殖失败的状况。在这种情况中，人工方法被适当地用于协助妇女怀孕，但是这些治疗的成功比较低，并且更重要地是，这些治疗的成功是不可预测的。本发明现提供了一种更可靠的方法，用于预测体外受精中的成功的可能性。
【背景技术】
[0002]在西方世界，生育能力低下影响10%至15%的夫妇。这种生育能力低下在一半情况中可归因于女性因素，在20%至26%的情况中可归因于男性因素，并且在25%至30%的情况中的因素是未知的(Evers，J.L.，2002，Lancet360:151-159)。许多夫妇转向体外受精(IVF)或胞浆内精子注射(ICSI)来满足他们想要孩子的愿望。这些技术的成功率约为每个起始周期的 25% (Andersen, A.等人.2007，Hum.Reprod.22:1513-1525)。如果能够提高该成功率，将具有极大的情感和经济效益。考虑到辅助的怀孕治疗的个人和社会的负担，可取的是识别具有非常低的成功可能性的夫妇和具有高自然怀孕可能性的夫妇。特别是不育的原因是未知的夫妇显示出高自然怀孕率，并且期待治疗对于他们是可取的(Brandes，Μ.等人.，2011，Hum.R印rod.26:360-368)。因此，为了改进该治疗并且为了确定个体情况中是否继续，就需要有能够准确预测妇女在IVF/ICSI之后是否会怀孕并且活产(livebirth)的模型。十多年来，已经获得了多种模型，这些模型基于临床数据(包括年龄、先前失败的IVF尝试的数目以及不育的可能原因)来预测活产的可能性(Templet0n，W.等人.，1996，Lancet348:1402-1406)。对于大规模的组来说，预测的活产与观测到的活产的比率为40%?60% (Nelson, S.Μ.和 Lawlor D.A.2011, PLOS Medicine8:1-10)。这些作者利用了更多年龄分层和不育的原因、(待)使用的程序、卵细胞的来源和想要孩子的愿望的持续时间，基于来自超过140000妇女的数据开发了一种改进的模型。当新模型的报告操作曲线(reporter operated curve)的曲线下的面积(AUROC)被用于指示该新模型功能如何时,报道了轻微但显著的增加(从0.6184增加至0.6335)。该模型似乎给出了对较大组(多于10000)的妇女的良好预测。然而，还未知的是该模型对于个体的预测怎么样。
[0003]实现活产的途径可归纳为三个关键步骤:卵细胞的受精，受精卵被女性环境接受，以及受精卵进一步发育直到实现实际的活产。当第一步骤是人工进行(诸如IVF和ICSI)时，可以通过第二步骤的标记物描述成功获得活产的可能性。然而，影响受精卵的接受的因素几乎是未知的。因此，目前不可能在该第二步骤中建立预测成功的标准。
[0004]因此，仍然需要一种能够基于个体更可靠地预测成功的IVF/ICSI治疗的可能性的模型。

【发明内容】

[0005]本发明人现已发现可以开发一种模型，该模型能够在个体基础上将成功的(或未成功的)IVF/ICSI治疗的可能性的预测增加至75%至100%。[0006]本发明包括一种预测受试者成功怀孕的可能性的方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]a.采集尿液样品；
[0008]b.确定乳酸菌菌种和葡萄球菌菌种的量占所述样品中存在的细菌总量的百分比；
[0009]c.基于所述细菌之间的比率预测成功怀孕的可能性。
[0010]优选地，在所述方法中，所述受试者正在经历人工受精的方法或符合进行人工受精方法的条件，该人工受精的方法例如为IVF或ICSI。在另一优选的实施方案中，乳酸菌种为卷曲乳酸菌，并且所述葡萄球菌种为金黄色葡萄球菌。
[0011]进一步优选地，通过PCR，更优选通过qPCR来进行所述细菌的量的测量。然后在该方法中，优选通过使用引物5’ -GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3’和5’ -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3’来确定葡萄球菌，并且优选通过使用引物5’ -GAITTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3’ 来确定乳酸菌。
[0012]可替代地，通过质谱分析法，更优选通过MALD1-T0F质谱分析法来进行所述细菌的量的测量。
[0013]更具体地，在根据本发明的方法中，通过以下公式确定成功怀孕的可能性:
[0014]Y = a*(%乳酸菌)-b*(%葡萄球菌)-c,
[0015]其中，
[0016]a 具有 0.025 ?0.051 的值；
[0017]b 具有 0.04 ?0.07 的值；
[0018]c 具有-1.10 ?-0.66 的值；
[0019]%乳酸菌为以占细菌总量的百分比的形式表示的乳酸菌细菌的量；
[0020]%葡萄球菌为以占细菌总量的百分比的形式表示的葡萄球菌细菌的量；
[0021]以及其中Y代表成功的可能性。
[0022]优选地，在该公式中，a具有0.025?0.04的值；还优选地b具有0.04?0.06的值；并且进一步优选地c具有-1.06?-0.9的值，更优选具有-1.06?-1.01的值。
[0023]在其中检测细菌的样品可为尿液样品，并且优选该细菌在中段尿液样品中检测，但是该样品也可为阴道样品，例如阴道涂片。
[0024]本发明还包括一种用于预测成功怀孕的可能性的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0025]a.用于测量来自受试者的样品中的细菌总含量的构件；
[0026]b.用于测量乳酸菌细菌的含量的构件；
[0027]c.用于测量葡萄球菌细菌的含量的构件；
[0028]d.根据上述限定的公式计算可能性的构件。
[0029]优选地，在这样的试剂盒中，用于测量乳酸菌细菌的含量的构件包括引物5’ -GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3’，而用于测量葡萄球菌细菌的含量的构件包括引物5 ’ -GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3 ’和5’ -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3’。还优选地，在这样的试剂盒中，用于测量来自受试者的样品中的细菌总含量的构件包括对细菌16s rDNA具有特异性的通用引物组，更优选地，所述通用引物组包括至少一个正向EUB引物和至少一个反向EUB引物。
[0030]进一步优选地，在所述试剂盒中，用于计算可能性的构件包括处理器，所述处理器能够接收测量的细菌值作为输入，并且根据上述限定的式计算可能性，并且优选地，该处理器能够将可能性输出至信号构件，所述信号构件能够被使用所述试剂盒的人员读出。
【具体实施方式】
[0031]在下列描述和实施例中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书(包括这些术语被给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了以下限定。除非本文另有限定外，本发明使用的技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员的常规理解的含义。
[0032]‘IVF’或体外受精为将卵细胞(卵子)移出妇女卵巢的过程。该卵细胞在实验室程序中经精子受精，并且随后将受精卵(胚胎)送回到妇女的子宫中。
[0033]iIcsr代表胞浆内精子注射，是精子被直接注射到卵细胞中以实现受精的试管受精程序。ICSI主要用于男性不育并且可形成TVF程序的一部分。
[0034]‘中段尿液’在本文中被限定为在尿道口已经(通过已流过的尿液)仔细清洗之后，在尿液流出的中间过程中收集的尿液样本。中段尿液样品也被称为‘清洁的捕获样本’。
[0035]‘尿路感染(UTI) ’是影响尿路的任一部分的细菌感染。症状包括频繁的排尿感和/或需要排尿、排尿过程中的疼痛和尿液混浊。
[0036]‘ 16S rDNA’为细胞核的核仁中的DNA，编码随后形成核糖体成分的RNA类型，在核糖体上完成信使RNA向蛋白质链的翻译。不同生物体的核糖体RNA的基因序列比对已被用于确定生物体之间的进化关系。
[0037]本发明人现已发现，通过在女性的泌尿-生殖区中的细菌菌群的构建形成预测受精卵成功植入在子宫内的因素之一。已知的是，(例如在肠或阴道内的)细菌菌群的构成是它们的直接环境的反映，并且该构成能够根据其环境的改变而改变。例如，明显地发现，在所有人群中，肠道中的常驻细菌并不是我们遇到的多种细菌种的随机集合。它们是明显不同的菌群，与其寄主所提供的环境处于动态平衡(Blaser，M.J.和Falkow，S.,2009,NatureRev.Microbiol.7:887-894) 0人类的肠中带有细菌，这些细菌因为它们赋予了人类肠细胞所缺乏的能力且响应它们的宿主的饮食的能力而被接受(De Filippo, C.等人.，2010，PNAS107:14691-14696)。事实上，饮食的改变是细菌生存环境的化学构成的改变。其它会影响肠道微生物构成的环境因素包括宿主因素，例如(免疫)防御系统)、细胞表面特征和它们存在的小生境的物理特征(Backhed, F.等人.,2005, Science307:1915-1920)。
[0038]来自尿生殖道的实例为当阴道条件改变时，阴道的细菌菌群发生变化。一般来说，阴道提供了低PH环境，该低pH环境有利于由I至6种细菌种组成的且乳酸菌种占主导的菌群(Fredricks, D.N.等人.，2005, New Eng.J.Med., 353:1899-1911) ? 乳酸菌进一步维持了低PH，且还积极地保护它们的小生境以抵御其它细菌。在患有细菌性阴道病的妇女中，PH较高，阴道细菌菌群扩展至17种，并且极大地减小了乳酸菌的存在从而有利于致病细菌的入侵。细菌菌群构成中的这种转变的开始可为乳酸菌种的减少或为其它细菌的入侵。然而，持续会成为乳酸菌种的减少、PH的增加和在新状况中生长旺盛的菌种(例如葡萄球菌)的增加之间的动态平衡(shifting balance)。如果这些转变先于阴道病的症状,则该转变平衡仍会被建立。
[0039]在对患有或未患有尿道炎的男性中的小规模研究中，发现细菌菌群可被用于预测特定状况的迹象，其中用广谱16s rDNA分析法研究细菌菌群(Riemersma，W.A.等人，2003，J.Clin.Microbiol.41:1977-1986)。三种迄今为止未知的细菌的存在与未患有尿道炎相关。
[0040]在得到本发明的研究中，发明人主要追问两个问题:妇女的尿液细菌菌落持有妇女的内部环境是否适于进行IVF或ICSI以实现怀孕的信息吗，以及细菌菌群与尿路感染的改变的风险相关吗？引导第一个目标的想法是:IVF或ICSI的成功的第一步是在卵细胞必须着床的过程中，异物(受精卵)被妇女内部环境接受。该内部环境将受激素的调控。该调控的性质并未完全已知，但是可能的是激素的调控将不仅仅影响子宫内的条件，还影响身体内的其它地方(如尿路)的条件。因而，激素的调控将影响异物的接受、在该尿路中的常驻菌群。基于这种想法，制定了两个假设来推动该研究:第一，妇女体内的细菌菌群指示了受精卵将在多大程度上被接受；并且第二，尿液中的细菌菌群将对妇女在怀孕时体内发生的环境改变作出反应。在怀孕期间，尿路经历解剖学变化，例如肾盂和尿道的扩张、膀胱的位移，以及与膀胱平滑肌的松弛和化学改变(尿液pH、尿渗透压、糖尿和氨基酸尿)有关的尿停滞。可以预期这些被改变的条件更适宜于除了常驻细菌之外的细菌类型。由于常驻细菌也可为尿路自身的内部问题(感染)的来源，因此在研究中，还研究了尿液中的细菌菌群的构成和尿路感染之间的关系。
[0041]在该研究中，显示出在测试的所有情况(怀孕、未怀孕、在IVF/ICSI后未怀孕)下，发现五种细菌菌种/菌株的核心组。卷曲乳酸菌(Lactobacillus crispatus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)存在于所有样品的大多数中，而在少量的样品中发现了大肠杆菌(E.coli)、链霉菌种(Streptomyces sp.)和未培养的细菌分离物CH96Fc_HlO0在所有的妇女中，总菌群中大于70%由最多4种类型组成，这4种类型独立地以大于总群体的10%。包括五种提及的细菌菌种加上其他类型的备选清单(参见表5)。在一个或几个样品中发现了百分比较小的细菌类型的初选清单(参见表3)。
[0042]在所有的测试条件下，在妇女中发现的5种细菌菌种的核心组可能代表具有较高的可能性从外部库(pool)入侵尿道，能够更好地适应尿路中的条件或能够更好地被宿主接受的菌种。第二组由不经常被发现的但是可在个别妇女体内存活一段时间并且甚至成为主导菌种的菌种组成。这些菌种为什么未能更经常地被发现的原因可能是尿路暴露于这些细菌的外部库对于所有妇女来说是不同的，或特定的宿主因素允许这些细菌仅存在于小部分的妇女体内。仅在单一样品中发现的大量的菌种可代表在尿路中不能良好存活的“过路人(passer-by)”。
[0043]从该研究中能够总结出:当妇女怀孕时，尿路中的细菌菌群的构成急剧变化。在怀孕之前，各种乳酸菌菌株(主要是卷曲乳酸菌)在细菌菌群中占优势。在怀孕期间，乳酸菌被其它常常变成优势菌株的细菌(主要是金黄色葡萄球菌)所替代。这种转变并不是由于妇女曾经经历的程序所导致的，因为这种转变并未发生在曾经历IVF/ICSI却并未受孕的妇女中。
[0044]当然，因为存在确定怀孕的更容易的方法，所以尿路菌群反映妇女是否怀孕的发现在临床上是无关紧要的。但是通过观测得出妇女的生育状态显然影响尿路中的细菌菌群的关联。这样就支持了如下的假设:尿路中的细菌菌群是用于宿主内部条件的标记物。
[0045]该研究示出该标记物的功能足以特异性地诊断想要受孕的妇女的生育能力。从实验部分可以清楚得出，在IVF/ICSI程序之前基于尿液中的乳酸菌种和葡萄球菌种的相对存在建立的模型能够预测IVF/ICSI的成功与否。
[0046]因此，本发明提供了一种预测受试者中的成功怀孕的可能性的方法，该方法包括以下步骤:
[0047]a.采集尿液样品；
[0048]b.确定乳酸菌菌种和葡萄球菌菌种占所述样品中存在的细菌总量的百分比的量;
[0049]c.基于所述细菌之间的比率预测成功怀孕的可能性。
[0050]尽管优选地，所述受试者正在经历或适宜于人工受精方法(例如IVF或ICSI)，但是该方法并不被限制到这种程度。本发明还能够用于那些对自身以自然方式受孕具有多大可能性感兴趣的受试者。在这个方面，值得注意的是，当样品取自于男性受试者、年轻的女性或已经怀孕的妇女(即受试者不会受孕)时，，该方法也能够给出正确的预测:对于这些样品，测试的结果显示为阴性。当然，在未使用人工受精的情况下，如上计算的成功怀孕的可能性仅仅涉及如下的状况:其中，受孕的可能性不受配偶不育的影响或不受女性受试者体内的大范围的生理异常(例如，子宫缺失、激素不平衡等)的影响。
[0051]优选地，待检测的乳酸菌种为卷曲乳酸菌。然而，还检测其他乳酸菌种(例如詹氏乳酸菌(L.jensenii)、惰性乳酸菌(L.1ners)和加氏乳酸菌(L.gasseri))也可以是有用的。在一些妇女体内遇到的菌种，且将这些菌种并入乳酸菌的组中增加了上述方法的预测能力。这对于葡萄球菌同样适用，其中不仅遇到了金黄色葡萄球菌，还遇到了表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)和孔氏葡萄球菌(S.cohnii),且发现增加了预测能力。优选地，在本发明的方法中通过分子生物学测定法(例如PCR并且优选qPCR)来进行细菌菌种的检测。在这种测定法中，通过使用对待检测的细菌具有特异性的引物进行扩增来检测和定量该细菌。在乳酸菌的情况下，这意味着可使用对卷曲乳酸菌特异性的引物，但是优选地，该引物也可识别如上所述的其它乳酸菌种。目前，最佳的检测方法包括如在实施例2中使用的乳酸菌特异性的引物。
[0052]相似操作的方法也可适用于葡萄球菌种的检测，其中应当主要检测金黄色葡萄球菌，但是也可涵盖表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和孔氏葡萄球菌的检测。并且在该情况下，实施例2中示出的引物组给出了最佳的结果。
[0053]然而，应当理解的是，不应当使用检测的乳酸菌和葡萄球菌的绝对比率。而是使用这些细菌相对于细菌总含量的百分比的比率。为了确定样品中的细菌的总含量，优选使用识别细菌16s rDNA的引物，这样就得到了使用识别所有细菌中存在的16S rDNA的保守部分的引物的时机。在文献中已经描述了对细菌16s rDNA具有特异性并且因此能够仅识别样品中的细菌的引物组，在该样品中存在来自其它生物体的生物材料。在维基百科中描述下列引物(http://en.wikipedia.0rg/wiki/16S_ribosomal_RNA):
[0054]引物名称序列(5’-3’)
B27FAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
U1492RGGT TAC CTT GTT ACG ACT T
928FTAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG
336RACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT
IlOOFYAA CGA GCG CAA CCC
[0055]
11OORGGG TTG CGC TCG TTG
337FGAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG
907RCCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
785FGGA TTA GAT ACC CTG GTA
805RGAC TAC CAG GGT ATC TAA TC
533FGTG CCA GCM GCC GCG GTA A
518RGTA TTA CCG CGG CTG CTG G
[0056]非常适用的引物组被称为EUB引物，其中一些EUB引物是可商购的(例如EUBf933 和 EUB rl387, EUB8f 和 EUB536r, EUB341 和 EUB534 等)。同样，基于 EUR 引物的用于检测细菌16s rDNA的试剂盒也是可商购的(例如来自爱丽斯技术有限公司(Iristechnologies Int.),库尔斯多夫(Cursdorf),德国的Onar?EUB 试剂盒)。
[0057]在本发明的另一实施方式中，通过光谱方法(例如质谱法、拉曼光谱法等)确定样品中的细菌的量。优选地，在测量细菌的量时，使用MALD1-T0F作为分析工具。
[0058]当确定总细菌的量及乳酸菌和葡萄球菌的量时，在本发明的优选实施方式中确定细菌的比率，并且从而根据下列公式能够计算出成功怀孕的可能性:
[0059]Y = a* (%乳酸菌)_b* (%葡萄球菌)_c
[0060]其中
[0061]a 具有 0.025 ~0.051 的值;
[0062]b 具有 0.04 ~0.07 的值；
[0063]c 具有-1.10 至-0.66 的值；
[0064]%乳酸菌为以占细菌总量的百分比的形式表示乳酸菌细菌的量；
[0065]%葡萄球菌为以占细菌总量的百分比的形式表示葡萄球菌细菌的量；
[0066]以及其中Y代表成功的可能性。Y的值可通过公式而被转换成在O (没有成功的可能性)~I ( 一定成功)之间变动的可能性:
[0067]可能性=eY/(1+eY)
[0068]根据使用的常数，Y的值将在4.44(100 %乳酸菌，a = 0.051且c=-0.66)~-8.1 (100%葡萄球菌，b = 0.07且c = -1.1)之间变动。为了预测的怀孕与实际的怀孕之间进行比较，发现最好的截留值(cut-off value)为可能性=0.5。而等于或高于0.5的值Y预测为成功，并且低于0.5的值预测为失败。根据该截留值，公式在第一次尝试IVF/ICSI之后，在86%的妇女中正确地预测了怀孕；并且在I年内多次尝试之后，在92.3%的妇女中正确地预测了怀孕。因此，在7.7%的情况中，公式预测为失败，而妇女在IVF/ICSI之后是受孕的(假阴性)。在3.8%的情况中，由于流产而未完成怀孕。在3.8%的情况中，公式错误预测了实际的活产。在公式了预测怀孕的25%的情况中，却未实现继续怀孕(假阳性)。
[0069]由于想要受孕且使用预测性测试来确定是否继续进行IVF/ICSI的妇女将尤其不能接受假阴性预测，因此期望将假阴性预测从3.8%降低至O。在该情况下，截留值必须降低至0.04。然而，在该截留值处，公式预测所有的妇女都怀孕，这当然也并不是期望的。
[0070]为了最好地预测完整的怀孕，使用一公式，在该公式中，a具有0.03?0.051的值，而进一步优选地b具有0.056?0.064的值。进一步优选地，c具有-1.06?-1.03的值。而用于得到怀孕的可能性的截留优选为0.5。
[0071]来自受试者的样品优选为尿液样品，更优选为中段尿液样品。由于中段尿液样品最好地代表了尿液中细菌菌群，所以其是优选的。这是因为首次尿液冲洗尿道，并且将携带在尿道中聚居的细菌。
[0072]还可能对阴道样品进行本发明的方法。由于在阴道中遇到相同类型的细菌，因此对阴道样品可使用类似的比率且优选使用类似的公式来预测成功怀孕的可能性是合理的。a，b和c的值可能需要进一步被优化，但是这种优化是本领域技术人员熟知的。
[0073]同样，本发明的一部分为用于确定成功怀孕的可能性的试剂盒。这种试剂盒应当包括:用于测量样品中的细菌总含量的构件；以及用于测量乳酸菌细菌和葡萄球菌细菌的含量的构件。此外这种试剂盒应包括基于上述限定的公式计算可能性的构件。这种用于计算可能性的构件优选应包括处理器，该处理器能够接收检测到的细菌和细菌的具体的上述属/菌种的总含量的值。然后该处理器将根据本发明的公式计算Y并且输出成功怀孕的可能性。该输出能够以数值(从公式得到的实际Y的值)的形式，但是也可为可能性的指示:例如通过信号光源，该信号光源可为红色(阴性)或绿色(阳性可能性)；或通过代表Y的值的色码条，其中阴性值示为从暗红色(强阴性)经由浅红色(中度阴性)至黄色(约为O)的梯度，并且阳性值示为从黄色(约O)经由浅绿(中毒阳性)至深绿色(强阳性)的梯度。在这样的情况下，受试者可接收预测的可靠性的视觉指示。在所有的应用中，可包括如下的选择:其中以增加假阳性预测的数目为代价，降低可能性的截留值(标准设定为0.5)以减少假阴性预测的数目。当然，代表Y值的其它指示也应是可能的，并且技术人员在不脱离本发明的主旨的情况下能够设计上述实施方式的变量。
[0074]实施例
[0075]患者的加入和组的划分
[0076]在研究中纳入了在2005和2006年访问过鹿特丹的ErasmusM的IVF病房的98名妇女。在3年的研究期间，在一些情况中的多次尝试之后，该98名妇女中的40名妇女(41%)受孕。在给出知情同意协议和如何进行中段尿液收集的说明之后，在第一次访问期间，妇女递交了中段尿液样品并且回答了有关之前使用抗生素和之前的UTI的问题。她们接收了尿液容器和描述中段尿液收集的程序的文件。在妇女怀孕的第16周或对于未受孕的那些妇女植入胚胎后的可比较时间点，提醒她们收集第二样品。尿液样品在同一天被送回医院，或被冷冻并且在稍后的日子被送回。在收集第二样品之后，追踪这些妇女最长达三年以收集怀孕的结果以及较晚怀孕的数据。
[0077]98名妇女中的16名并没有回答问卷上的所有问题或并未送回完整无损的第二尿液样品。因为我们的研究需要在两个时间点的样品，因此将该16名妇女从我们的发现性研究中排除掉。从剩下的82名妇女中，通过第一尿液样品后的第一个IVF/ICSI周期受孕的第一批21名妇女被包括在发现性研究中。当收集第二样品时(在植入胚胎后的16周)仍未怀孕的21名妇女被包括在未怀孕的妇女的组中。在纳入周期完成之后，发现21名未怀孕的妇女中的I名妇女在她收集第二样品时怀孕。她被重新划分至怀孕组中。这样得到怀孕组为η = 22，而未怀孕组为η = 20。在这些42名妇女中，通过广谱16S rDNA分析法确定两次尿液样品中的细菌菌群。此外，关于怀孕和怀孕的结果，对这些妇女进行三年的临床随访。在所有的42名妇女的第一尿液样品中识别的细菌菌种被用于建立预测IVF/ICSI的结果(怀孕/未怀孕)的模型。将妇女受孕时发生的细菌菌群中的变化与UTI的主因中的变化进行比较。从分离的组中得到后者(参见下文)。
[0078]对于送回两次尿液样品并且完整完成问卷的剩下的40名妇女加上送回完整的第一样品并且完成完整问卷的妇女，我们组成了独立的检验组，η = 42。在该组中，我们利用qPCR测试验证了得到的预测性模型，qPCR测试基于对包括在预测模型中的细菌具有特异性的引物。
[0079]需注意的是:与整组的98名妇女的41%相比，在我们发现性阶段中由于我们选择的方案而得到的怀孕成功率为22/42 = 52%。
[0080]在表1中示出了组的特征。
[0081]排除标准
[0082]排除在16周的研究期间使用抗生素或具有UTI的妇女。
[0083]后续的数据(3年的时间段)
[0084]在怀孕组的4名妇女中，怀孕因流产(3)或子宫内死亡(IUD)而终止。在附加的程序之后，这4名妇女都在收集第二样品之后的6个月内成功怀孕。
[0085]在失败的IVF组中，12名妇女从未受孕，7名妇女在收集第二样品期间未怀孕而在其它时间点怀孕。其中:
[0086]患者6，在弟一样品之后，怀孕〉1年，在弟二样品之后〈I年；
[0087]患者10，在第一样品之后I年内怀孕(双胞胎);
[0088]患者14，在弟一样品之后I年内怀孕；
[0089]患者19，在弟一样品之后I年内，流广
[0090]患者58，在收集第一样品的时间点附近发现自然怀孕。这样导致IUD。随后进行IVF并且在植入胚胎后的16周收集第二样品。IVF失败。该患者被划分到用于测试第一次IVF/ICSI的结果以及测试由于怀孕而发生的变化的未怀孕组。为了完整性，被划分到怀孕组的患者58中也进行了模型的建立。她被划分到用于测试妇女是否能够在I年内受孕的怀孕组中。
[0091]患者78，在第一样品和第二样品之后，自然怀孕>1年，流产[0092]患者92，在第一样品和第二样品之后，怀孕(IVF) >1年，流产，然后在第一次样品之后的2年，成功自然怀孕。
[0093]用于IVF/ICSI的成功的预测模型
[0094]将第一尿液样品的细菌菌群的数据并入二项式回归分析中以建立两种模型。模型I预测第一次IVF/ICSI尝试是否会实现怀孕。模型2预测妇女是否会在I年的IVF/ICSI尝试(I至3次尝试)期间受孕。对于该模型，在收集第一尿液样品后的I年内受孕/怀孕的患者10、14、19和58基于该模型被重新划分到怀孕组，得到η = 26的怀孕组，而未怀孕组为η = 15。患者6、78和92停留在I年内未怀孕的组中，因为她们在收集第二样品之后超过I年后才起始怀孕。预测模型被应用至在第16周收集的尿液样品中。基于广泛分析的模型被转换成在独立测试组中得到验证的具体特异性的QPCR测试。
[0095]未怀孕和怀孕妇女中的细菌菌群和UTI原因
[0096]用DNA分析发现的细菌菌群代表了低量存在于未患有UTI的怀孕妇女/未怀孕妇女的尿路中的细菌。将该数据与去阿尔贝拉(Erbil)的妇产科医院(Maternity Hospital)(库尔德斯坦地区(Kurdistan Region),伊拉克)看病的妇女的尿液和阴道涂片培养物得到的怀孕/未怀孕妇女中的阴道感染和UTI的原因的数据相比较。在2009年间，得到共计599个尿液培养物结果(210个未怀孕，且389个怀孕)以及216个阴道涂片培养物结果(94个未怀孕，且122个怀孕)。
[0097]表1.两组患者的特征
[0098]
【权利要求】
1.一种预测受试者成功怀孕的可能性的方法，所述方法包括以下步骤: a.采集尿液样品； b.确定乳酸菌菌种和葡萄球菌菌种的量占所述样品中存在的细菌总量的百分比； c.基于所述细菌之间的比率预测成功怀孕的可能性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者正在经历人工受精的方法或符合进行人工受精的方法的条件，所述人工受精的方法例如为IVF或ICSI。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述乳酸菌种为卷曲乳酸菌。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述葡萄球菌种为金黄色葡萄球菌。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细菌的量的测量通过PCR，更优选通过qPCR来进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，葡萄球菌通过利用引物5’-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3’ 和 5’ -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3 ’ 来确定。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，乳酸菌通过利用引物5’ -GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3 ’ 来确定。
8.根据权利要求1至4所述的方法，其中，所述细菌的量的测量通过质谱分析法，更优选通过MALD1-TOF质谱分析法来进行。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述成功怀孕的可能性通过以下公式来确定: Y = 3*(%乳酸菌)_13*(%葡萄球菌)-(3， 其中， a具有0.025~0.051的值； b具有0.04~0.07的值； c具有-L 10~-0.66的值； %乳酸菌为以占细菌总量的百分比的形式表示的乳酸菌细菌的量； %葡萄球菌为以占细菌总量的百分比的形式表示的葡萄球菌细菌的量； 以及，其中Y代表成功的可能性。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，a具有0.025~0.04的值。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中，b具有0.04~0.06的值。
12.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，c具有-1.06~-0.9的值，更优选具有-1.06~-L 01的值。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细菌在中段尿液样品中检测。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，步骤a)为采集阴道样品，例如阴道涂片。
15.一种用于预测成功怀孕的可能性的试剂盒，所述试剂盒包括: a.用于测量来自受试者的样品中的细菌总含量的构件； b.用于测量乳酸菌细菌的含量的构件； c.用于测量葡萄球菌细菌的含量的构件； d.用于根据权利要求8至11中限定的公式来计算所述可能性的构件。
16.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述用于测量乳酸菌细菌的含量的构件包括引物 5’ -GAITTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3’ 和 5’ -AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3’。
17.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中，所述用于测量葡萄球菌细菌的含量的构件包括引物5’ -GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3’和5， -GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3，。
18.根据权利要求14至16中任一项所述的试剂盒，其中，所述用于测量来自受试者的样品中的细菌总含量的构件包括对细菌16s rDNA具有特异性的通用引物组。
19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，所述通用引物组包括至少一个正向EUB引物和至少一个反向EUB引物。
20.根据权利要求14至18中任一项所述的试剂盒，其中，所述用于计算所述可能性的构件包括处理器，所述处理器能够接收测量的细菌值作为输入，并且所述处理器根据权利要求8至11中任一项所限定的公式来计算所述可能性。
21.根据权利要求19所述的试剂盒，其中，所述处理器能够将所述可能性输出至信号构件，所述信号构 件能够被使用所述试剂盒的人员读出。
【文档编号】C12Q1/68GK103930786SQ201180074181
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2011年8月12日 优先权日:2011年8月12日
【发明者】迪尔克·扬·郭克, 约瑟夫·斯特凡努斯·伊丽莎白·莱文, 戴尔杉德·玛玛·马格底德, 妮科尔·赫耶尔杰·玛丽亚·贝克尔斯 申请人:鹿特丹伊拉斯谟大学医疗中心