专利名称：一种高活性的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白及其活性检测方法
技术领域：
一种高活性的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白及其活性检测方法属于蛋白质药物领域
背景技术：
骨质疏松症是一种常见的骨代谢疾病，表现为骨吸收超过了骨形成，从而导致骨量减少，骨脆性增加。骨质疏松症在绝经妇女中占有较大比例，而随着世界人口老龄化的日益严峻，寻找新的更有效的骨质疏松症的预防和治疗药物显得尤其重要。目前，骨质疏松症的临床治疗用药主有两类，分别为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂。 人甲状旁腺激素(PTH)目前被认为是唯一能促骨合成代谢的药物，其优于其它骨质疏松药物的特点在于可以重建骨小梁系统。研究表明小剂量PTH即有明显成骨作用，其作用可能是通过调节骨代谢和调节肾小管对钙和磷酸盐的再吸收来实现的。2002年FDA批准特立帕肽(rhPTH(l_34))上市，主要用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症。另一个甲状旁腺激素药物rhPTH(l-84)也于2006年上市。国内对PTH研究起步较晚，现进入到临床研究阶段的PTH药物有注射用重组人甲状旁腺激素(1-34)，而研究热点集中在PTH融合蛋白以及PTH的各种突变体上。对蛋白质或多肽进行单个或多个氨基酸的置换，可能会使得蛋白质的结构发生变化，并产生一系列物理和生化性质(溶解度、稳定性、对底物和受体的亲和力等)的改变。因此对天然人甲状旁腺激素(1-34)进行氨基酸的置换，有希望得到生理活性更强，副作用更小的骨质疏松治疗药物。本发明建立起的活性测定方法可以快速稳定地检测人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的体外活性，涉及到的技术包括荧光实时定量PCR，成骨细胞和破骨细胞共培养等。
发明内容
本发明的一个内容是通过不同物种同源序列比对和初步的计算机模拟分子对接，对天然的人甲状旁腺激素(1-34)的三个氨基酸R25K26K27进行Q25E26L27的置换，并委托吉尔生化(上海)有限公司进行多肽的全合成，多肽纯度为95%以上。本发明的另一个内容是建立了一种能快速稳定的检测突变蛋白活性的方法。甲状旁腺激素(PTH)是由甲状旁腺主细胞分泌的含84个氨基酸残基的单链多肽激素，是生物体内调节钙、磷代谢最为重要的肽类激素之一。甲状旁腺激素氨基端1-34片段具有全分子PTH与受体结合的能力及生物活性，因此被广泛用于研究PTH的结构与功能。对PTH及其类似物的作用机理及活性研究始于上世纪80年代。目前已知PTH可以通过与基质/成骨细胞上的G蛋白偶联受体-甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体I (PTHRl)结合，刺激这些细胞表达M-CSF和NF k B-Iigand(RANKL)。研究表明上述基因缺失的小鼠会丧失形成破骨细胞的能力，而体外培养时，即使没有基质/成骨细胞存在，上述两种蛋白也能刺激破骨细胞的形成。体内和体外实验证明，破骨细胞的形成与RANKL基因的表达成正比，而与M-CSF没有明显的正比关系。RANKL可通过与造血前体破骨细胞上的RANK受体结合，刺激其分化成为成熟的破骨细胞。当RANKL发挥作用时，一种可溶性的诱铒受体-骨保护素(OPG)会阻碍其发挥作用。许多研究表明PTH作用于原代培养的基质/成骨细胞或大鼠时，它能持续的刺激RANKL基因的表达而抑制OPG基因的表达。因此，PTH发挥作用时很有可能是通过凋节RANKL/0PG的比例来影响破骨细胞的形成。磷酸酶是一种可以水解脂肪族和芳香族磷酸酯，从而释放出磷酸盐的酶。磷酸酶根据其发挥作用时所需pH又可以分为酸性磷酸酶和碱性磷酸酶。酸性磷酸酶存在于各种细胞和组织中，如前列腺、肝、肾、脾、红细胞、血小板和破骨细胞。1959年，Burstone报道，破骨细胞能显示出强烈的酸性磷酸酶活性，而成骨细胞则显示出碱性磷酸酶活性。之后的很多报告显示破骨细胞在酒石酸存在的情况下仍能表现出酸性磷酸酶的活性。因此抗酒石酸酸性磷酸酶(TARCP)现在作为一个破骨细胞的标志物被广泛运用于破骨细胞的鉴定和分析。PTH可以通过与基质/成骨细胞上的G蛋白偶联受体-甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体I (PTHRl)结合，刺激这些细胞表达NF K B-Iigand (RANKL)，RANKL可通过与造血前体破骨细胞上的RANK受体结合，刺激其分化成为成熟的破骨细胞。而破骨细胞能表 现出抗酒石酸酸性磷酸酶(TARCP)活性而被染色，因此通过染色结果能间接说明PTH刺激破骨细胞的分化和成熟的能力。本发明建立的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的体外活性检测方法，可以在3-10天内对一种或多种蛋白质或多肽类药物进行活性检测，并与人甲状旁腺激素标准品进行比较，是一种快速稳定的检测活性检测方法。
图I :荧光定量PCR仪检测实时荧光情况图2 PTH (1-34)-(RKK-QEL)对 UAMS-32P 细胞 RANKL/0PG 基因转录的影响X 轴代表组别 vehicle 组、PTH (1-34)阳性对照组、PTH (1-34)-(RKK-QEL)组、小肽(LQDVHNF)组人血清白蛋白(HSA)组。Y轴表示mRNA相对表达量(相对于Rps27基因)图3 :破骨细胞形成实验(TRACP染色)I vehicle组(每组3个复孔)、2 :PTH(1_34)阳性对照组、3 :PTH(1-34)-(RKK-QEL)组、4 :小肽(LQDVHNF)组、5 :HSA 组图4 :破骨细胞形成实验(镜下红色细胞数)X 轴代表组别vehicle 组、PTH(1_34)阳性对照组、HSA 组、PTH(1-34)-(RKK-QEL)组、小肽(LQDVHNF)组。Y轴表示每组平均每孔红色细胞数(每组3个复孔)图5 =PTH (1-34)-(RKK-QEL)对原代培养的小鼠股骨骨髓贴壁细胞RANKL/0PG基因转录的影响X 轴代表组别vehicle 组、PTH(1_34)阳性对照组、HSA 组、PTH(1-34)-(RKK-QEL)组、小肽(LQDVHNF)组。Y轴表示mRNA相对表达量(相对于Rps27基因)，每组设3个复孔
具体实施例方式实施例I :PTH(1-34)-(RKK-QEL)和小肽(氨基酸序列LQDVHNF)委托吉尔生化(上海)有限公司合成，纯度>95% ;实验用标准对照人甲状旁腺激素(1-34)购自sigma公司；人血清白蛋白(HSA)由实验室自行制备并纯化，宿主菌为毕赤酵母GS115，纯度> 90%。实施例2 =PTH (1-34)-(RKK-QEL)对 UAMS-32P 细胞 RANKL/0PG 基因转录的影响(I)细胞系与培养条件
细胞系UAMS_32P细胞(稳定转染PTHR1)培养基a -MEM培养基+10%胎牛血清培养条件组织培养箱37 °C，5 % CO2细胞长至80%左右汇合时分瓶传代，再长至80%左右汇合时进行实验。(2)UAMS_32P细胞的铺板培养与加药6孔板按IO5/孔细胞铺板，生长至80%左右汇合时换液，换液后6h加药药物剂量给药组均按l(T7mol/L加药组别vehicle组PTH(1-34)阳性对照组PTH (1-34)-(RKK-QEL)组小肽(LQDVHNF)组HSA 组(3) UAMS-32P 细胞总 mRNA 的提取细胞加药培养24h后，弃去培养基，按试剂盒说明提取总RNA (Takara)。取部分RNA样品用紫外分光光度计于260和280nm处测定OD值，评价RNA纯度并进行定量。(4)反转录成cDNA第一链控制每组等量RNA (1-1. 5 ii g)，反转录为cDNA第一链。反转录采用20 ii L体系，体
系如下
5 X PT-Master Mix 4u L RNA1.5 u g
DEPC水补至20 u L
37°C 反应 30-60min以上述反转录的cDNA作为模板，将模板进行适当稀释，用于实时荧光定量RT-PCR。(5)实时荧光定量PCR检测RANKL和OPG的mRNA转录水平实验设vehicle 组，PTH(1-34)阳性对照组，HSA 组，PTH(1-34) (RKK-QEL)组和小肽(LQDVNFH)组。每组分别检测Rps27，RANKL, OPG基因的转录情况，每组每个基因设3个平行复孔。3 步法 PCR :50°C，2min ；95°C, IOmin ;95°C，15s，60°C，Imin ;40 个循环。荧光定量
PCR仪检测实时荧光情况。
实施例3 PTH(1-34)-(RKK-QEL)在体外成骨细胞和破骨细胞共培养体系中的活性检测/破骨细胞形成实验(TRACP染色法)Dayl (I)小鼠股骨骨髓细胞的获得和培养在无菌条件下，取出3-6周小鼠股骨，并冲洗骨髓腔，离心收集洗下的骨髓细胞。培养基重悬骨髓细胞，用直径为IOcm的培养皿在在37°C，5% CO2条件下培养2d。(2)UAMS-32P细胞(稳定转染PTHR1)长至80%左右汇合时，对细胞进行消化。细胞按2000/孔铺24孔板，37°C，5% CO2条件下培养2d。
Day3 小鼠股骨骨髓悬浮细胞与UAMS-32P细胞共培养体系的建立(I)收集培养皿中的骨髓细胞培养液上清，合并上清液并离心收集细胞。用一定体积的培养基对细胞进行重悬，血球计数板进行细胞计数。(2)吸去Dayl铺板的UAMS-32P细胞的培养液上清，将上述小鼠股骨骨髓悬浮细胞按16X IO4/孔铺板，用培养基补至培养体积为lmL。加药后37°C，5% CO2条件下培养。实验设vehicle 组，PTH(1-34)阳性组，HSA 组，PTH(1-34) (RKK-QEL)组和小肽(LQDVNFH)组。每组设3个平行复孔。给药浓度为10-7mol/L。Day5 对24孔板中的细胞进行半换液，吸去0. 5mL培养基，用新鲜培养基补足ImL并补足药物以维持药物浓度为10_7mol/L。Day7 重复第五天的操作，对细胞进行半换液。Day9 吸去24孔板的细胞培养液，并用PBS轻柔的洗一次。对贴壁细胞进行TRACP (耐酒石酸酸性磷酸酶)染色(TRACP/ALP染色试剂盒购自Takara),具体步骤如下24孔板每孔添加250 ii L Fixation solution固定细胞，室温放置5min。每孔加2mL无菌水稀释固定液后移去，再每孔添加2mL无菌水清洗一次，移去液体。配制好含10%酒石酸的ACP (酸性磷酸酶)底物溶液，24孔板每孔添加250 ii L，盖上板盖于37°C孵育15-45min。移去上清液，用无菌水洗3次以终止显色。显微镜下计算每孔中被染成紫红色的细胞数(见附图4)，并拍照(见附图3)。
实施例4 =PTH (1-34) - (RKK-QEL)对原代培养的小鼠股骨骨髓贴壁细胞RANKL/0PG基因转录的影响将实施例3中Day3中培养皿内的贴壁细胞消化，用培养基适当稀释后进行计数。按实施例2中⑵、(3)、(4)、(5)步中的操作，检测PTH(1-34)-(RKK-QEL)对原代培养的小鼠股骨骨髓贴壁细胞RANKL/0PG基因转录的影响。
权利要求
1.天然人甲状旁腺激素(1-34)的氨基酸序列为SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF。
2.权利要求人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白为对天然人甲状旁腺激素(1-34)的R25K26K27进行了突变的蛋白。
3.根据权利要求2中所述的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白为天然人甲状旁腺激素(1-34)的R25突变为Q，K26突变为Q或E，K27突变为E或L的蛋白，其中较为优选的是R25突变为Q，K26突变为E，K27突变为L。
4.根据权利要求3中所述的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白为人工化学合成的或者重组表达的蛋白。
5.根据权利要求4所述的重组表达为以大肠杆菌为代表的原核表达系统或以酵母为代表的真核表达系统以及哺乳动物细胞表达系统。
6.根据权利要求2所述的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的体外活性检测方法采用的细胞为原代培养的成骨细胞或骨髓细胞、成骨细胞系或成骨细胞株。
7.权利要求6中原代培养的成骨细胞或骨髓细胞来源为小鼠，较为优选的是小鼠股骨骨髓细胞。
8.根据权利要求6中的成骨细胞系或成骨细胞株，其特征是转染了PTH I型受体的细胞，较为优选的为UAMS-32P细胞系。
9.权利要求3所述的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白活性检测的指标为UAMS-32P细胞特定基因mRNA的相对表达量以及刺激小鼠股骨骨髓细胞分化形成破骨细胞的能力。
10.根据权利要求8中的特定的基因，其特征是耦联成骨细胞、基质细胞和破骨细胞分化、活化与生物活性的主要细胞因子。
11.权利要求9中特定的基因,较为优选的是护骨素(osteoprotegerin,OPG)、NF-K B受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κ B ligand, RANKL) 2 个基因。
12.权利要求8中mRNA的相对表达量，其检测方法为反转录PCR和实时荧光定量PCR。其中较为优选的是实时荧光定量PCR。
13.权利要求9中刺激小鼠股骨骨髓细胞分化形成破骨细胞的能力是通过对破骨细胞的染色来评价的，较为优选的是耐酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色。
14.权利要求2和3所述的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白在治疗骨质疏松症药物中运用。
全文摘要
本发明“一种高活性人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白及其活性检测方法”属于蛋白质药物领域。本发明通过对天然人甲状旁腺激素(1-34)的第25、26、27位氨基酸进行置换，发现了一种高活性的人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白。本发明还建立了一种快速的稳定的活性检测方法，可以在3-10天内对一种或多种蛋白质或多肽类药物进行活性检测，并与人甲状旁腺激素标准品进行比较。活性检测结果显示上述人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的活性优于标准品，因此有望成为疗效更强，副作用更小的骨质疏松治疗药物。
文档编号C12Q1/68GK102775492SQ201210001319
公开日2012年11月14日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者付强, 储敏, 姜曰水, 朱瑞宇, 李英, 邱爽, 金坚, 陈蕴, 雷楗勇, 高明珠 申请人:江南大学