专利名称：一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，同时还涉及一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌作为饲料添加剂在饲料方面的应用。
背景技术：
纤维素酶是降解纤维素的一组酶系总称，主要由外切￠-葡聚糖酶、内切￠-葡聚糖酶和3-葡萄糖苷酶组成。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶 、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种[YANG Sheng, HOU Hong-ping, et al. Recentadvance in cellulase [J]. China Condiment，2008，11 :56 62.]，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。纤维素酶应用广泛，在饲料方面，饲用纤维素酶对于反刍动物来说，可以补充体内微生物形成纤维素酶的不足，促进胃肠道有益微生物生长，提高饲料利用率；对于单胃动物来说，可以降低可溶性非淀粉多糖在食糜中产生的黏性，促进内源酶扩散，改善消化道环境[ZHANG Weiwei,SHAO Shuli,WANG Shudan,et al. Characterization of a High CellulaseProducing Strain from Chicken Crop [J]. China Poultry，2009，22 :23 25.]。在稻杆处理方面，获取高效降解秸杆纤维素的微生物菌株，是解决我国秸杆饲料化和人畜争粮的最好的方法之一[Guillaume P，Zoulikha M R，Frederic S，et al. High-performancehydrolysis of wheat straw using cellulase and thermomechanical pretreatment[J].Process Biochemistry，2011，46，11 :2194 2200.]。因此，显示其具有巨大的利用价值和商业价值。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体内。早在20世纪初，人们已经在蜗牛的消化液中发现有纤维素酶，能分解天然纤维素。20世纪40 50年代对产纤维素酶的微生物进行了大量的分离筛选工作，建立起比较完整的分离筛选方法。在动物界，纤维素酶已经在松木线虫Bursaphelenchus xylophilus、长角天牛甲虫Apriona germari、蓝蛘 Mytilus edulis 和淡水螺 Ampullaria. crossean 等体内发现[Kentaro Sakamoto,Haruhiko Toyohara. Molecular cloning of glycoside hydrolase family 45 cellulasegenes from brackish water clam Corbicula japonica[J]. Comprative Biochemistryand Physiology, PartB, 2009，152 :390 396.]。在微生物界，木霉 Trichoderma spp.、曲霉 Aspergillus、青霉 Penicillium 等主要产耐酸纤维素酶[Mohammad I G，MohammadA M. Production of carboxymethyl cellulase from local isolate of AspergillusSpecies [J] Pak. j. life soc. Sci，2010，8 (I) :1 6.];乳酸杆菌 LactobacillusAcidophilus[LI Jv_di，LIU Jian-xin，WU Yue-ming，et al. Effects of Lactobacillusand Cellulase on Fermentation Characteristics of Water Hyacinth Stem andLeaf [J]. Chinese Journal of Animal Science，2007，11 :29 32.]、芽抱杆菌Bacillaceae[Samanta B P，Florencia C 0，Daniel J D，et al. Cellulase-producingBacillus strains isolated from the intestine of Amazon basin fish[J].Aquaculture Research, 2011,42 (6) :887 891.]等主要产中性和耐喊纤维素酶。真菌中的绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉，是目前公认的较好纤维素酶产生菌，但霉菌为好氧微生物，而饲料发酵、污染物的纤维素类分解等都是在少氧或缺氧环境中进行，并且细菌产纤维素酶大多为中性和弱碱性，在肠道特定环境中具有较高活性，故来源于细菌的纤维素酶更具有应用上的现实意义。虽然现在市场上已有纤维素酶的成熟产品，但是由于这些酶产品是通过微生物发酵、分离、纯化，再与相应的载体混合等一系列工艺后才能推向市场，而且这些酶在保存和应用时又有严格的条件限制，如温度、PH等，很容易受外界条件的影响而使其酶活降低，甚至失活。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌。 再者，本发明的目的还在于提供一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌制成的饲料添加剂。进一步地，本发明的目的还在于提供了一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌在制备饲料方面的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，它编码的蛋白质具有序列表SEQ ID NO. I所述的氨基酸序列。所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌是将乳酸杆菌的信号肽基因与纤维素酶基因重组到乳酸杆菌的表达载体上，再电转化整合到乳酸杆菌，得到转纤维素酶重组乳酸杆菌。具体为所述的重组乳酸杆菌基因组中整合了带有乳酸杆菌信号肽(signalpeptide, sp)的枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因(cel);其中，纤维素酶基因来源于GenBank上的登陆号为AB016164的枯草芽孢杆菌，所扩增的序列是从727-2232bp位碱基；信号肽基因来源于GenBank上的登陆号为Z14250的短小乳酸杆菌L. brevisl. 2028，所扩增的序列是260-349位的碱基；将纤维素酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体pllac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L. CECT5276的核糖体结合位点中，从而获得纤维素酶基因重组乳酸杆菌。所述的重组乳酸杆菌在重组表达质粒中，设计并合成的一对特异性引物用于扩增枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因，分别为上游引物PI : 5' -AATCTAGATGTYGAGCCAATATGATGAG-3'(下划线为 XbaI 酶切位点)；下游引物P2 5 ' -TCCCCCGGGACTAATCTGGTACTGATG-3 '(下划线为 SmaI 酶切位点)；所说的纤维素的DNA序列，其包含序列表SEQ ID NO. 2的序列或经修饰的序列。所述的重组乳酸杆菌在重组表达质粒中，设计并合成的一对特异性引物用于扩增短小乳杆菌的信号肽基因，其引物分别为上游引物P3 :5 ’ -AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3 ’，PstI 位点为 CTGCAG ；
下游引物P4 :5 ’ -CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3 ’，XbaI 位点为 CTGCAG ；所述的用于扩增短小乳杆菌(Lactobacillus brevis I. 2028)的信号肽基因具有序列表SEQID NO. 3所述的氨基酸序列。则更具体的，重组乳酸杆菌含有表达质粒pllac-sp-cel，重组表达质粒pllac-cel含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因sp、纤维素酶基因cel、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery基因，其表达式为 -ori-RBS-lac-sp-ceI-RBS-Ery-o由转纤维素酶基因重组乳酸杆菌菌种可以发酵形成的液态、固态产品。本发明的技术方案还采用了一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌制备而成的饲 料，具体组成为转纤维素酶基因重组乳酸杆菌占饲料总重的0. I %。 进一步地，本发明的技术方案还采用了一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌作为添加剂在制备饲料中的应用。本发明是从芽孢杆菌中克隆出纤维素酶基因，并将其重组到乳酸杆菌高效表达载体中，通过向饲料中添加能够表达纤维素酶的重组乳酸杆菌来达到补充动物机体内纤维素酶的不足。在以玉米、大麦、糠麸、饼柏等植物性饲料为主要原料的猪禽的饲料中添加高产纤维素酶的重组乳酸杆菌，一方面乳酸杆菌在生长繁殖过程中分泌的纤维素酶可以使构成植物细胞壁等不易利用的植物纤维素分解成能被吸收的葡萄糖，从而提高动物对高纤维饲料的消化吸收，提高饲料利用率，降低饲料成本；另一方面乳酸杆菌本身可以提高动物生产性能，促进动物生长，从而实现一菌多用的功能，不仅促进了动物的生长，降低了饲料成本，更是促进了动物的健康，可以作为一种无残留畜禽产品有效的饲料添加剂。本发明所构建的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌可以作为一种口服饲料添加剂应用于养猪业或养禽业，从而可以弥补猪、禽肠道不能分泌纤维素酶的不足，而不必添加昂贵的纤维素酶制剂，不仅有利于促进饲料原料中的粗纤维的代谢，而且可以促进猪的生长，增加养殖的经济效益。此外，宿主菌乳酸杆菌是一种干酪乳杆菌，其本身对动物机体也有益生功能，通过本发明可提供一种人工产纤维素酶益生基因工程乳酸杆菌，在猪、禽等单胃动物生产中具有重要的应用价值。本发明的一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其构建方法包括引物设计、枯草芽孢杆菌基因组的提取、纤维素酶cel基因的PCR扩增、cel基因与pMD18_T载体的连接与转化、短小乳杆菌L. brevis I. 2028基因组的提取、信号肽SP基因的PCR扩增、sp基因与PMD18-T的连接、sp基因和cel基因的连接、sp-cel基因与表达载体pllac的连接、重组表达载体pllac-sp-cel的转化,具体步骤为I、引物设计11纤维素酶基因引物设计利用生物学软件Primer Premier6. 0,参照GenBank中菌株AB016164所提供的信息设计一对引物，由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，引物序列如下上游引物5 ' -AATCTAGATGTYGAGCCAATATGATGAG-3 '(下划线为 XbaI 酶切位点)；下游引物5' -TCCCCCGGGACTAATCTGGTACTGATG-3'(下划线为 SmaI 酶切位点);
I. 2信号肽基因引物设计利用生物学软件Primer Premier6. 0,参考短小乳杆菌L. brevisl. 2028的S-层蛋白基因信号肽序列设计一对引物，由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成，引物序列如下上游引物P3 :5 ’ -AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3 ’，PstI 位点为 CTGCAG ；下游引物P4 :5 ’ -CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3 ’，XbaI 位点为 CTGCAG ；2、枯草芽孢杆菌基因组的提取
将活化的枯草芽孢杆菌培养18h后，取3ml菌液，然后参照北京艾德莱生物科技有限公司的细菌基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)提取其基因组DNA，方法按使用说明书步骤进行；3、纤维素酶cel基因的PCR扩增以上述提取的枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因，反应体系如下表I纤维素酶cel基因PCR扩增体系
上游引物(20pM)__1.5 U I
下游引物(20pM)__1.5 U I
10XPCR Buffer__5.0 U IPyrobest DNA Polymerase (5U/ U I)1.0 U I
dNTPs (IOpM)__0.25 U I
模板 DNA__0.5 u I
加灭菌超纯水至__50 u I轻轻混匀，2000 Xg瞬时离心后进行PCR。反应参数95°C预变性5min，95°C变性40s，56°C退火50s，72°C延伸70s，循环35次，最后72°C延伸lOmin，得到PCR产物，于4°C保存备用；PCR产物可以进行鉴定，例如可以取5iU PCR产物在I. 5%琼脂糖凝胶上电泳，以Markerl05为对照，观察扩增片段的长度是否约为1152bp，如是，则初步判定为正确；4、cel基因与pMD18_T载体的连接与转化将上述鉴定正确的PCR产物按照北京艾德莱生物科技有限公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明进行回收，然后再按照大连宝生物有限公司的pMDlS-T试剂盒说明进行连接，连接产物的转化按照常规方法将其转化入大肠杆菌JM109中，例如，可以使用J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T最尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版第96页上介绍的方法；利用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，验证正确后命名为pMD-cel。5、短小乳杆菌L. brevis I. 2028基因组的提取方法同步骤2。6、信号肽SP基因的PCR扩增以上述提取的基因组为模板，扩增短小乳杆菌的信号肽基因，反应体系如下
表2信号肽SP基因PCR扩增体系
权利要求
1.一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于它编码的蛋白质具有序列表SEQID NO. I所述的氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌是将乳酸杆菌的信号肽基因与纤维素酶基因重组到乳酸杆菌的表达载体上，再电转化整合到乳酸杆菌，得到转纤维素酶重组乳酸杆菌。
3.根据权利要求2所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于所述的重组乳酸杆菌基因组中整合了带有乳酸杆菌信号肽(signal peptide, sp)的枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因(cel);其中，纤维素酶基因来源于GenBank上的登陆号为AB016164的枯草芽孢杆菌，所扩增的序列是从727-2232bp位碱基；信号肽基因来源于GenBank上的登陆号为Z14250的短小乳酸杆菌L. brevisl. 2028，所扩增的序列是260-349位的碱基；将纤维素酶基因和信号肽基因连接后插入到乳酸杆菌表达载体Pllac的多克隆位点，然后再将其整合到干酪乳杆菌L. CECT5276的核糖体结合位点中，从而获得纤维素酶基因重组乳酸杆菌。
4.根据权利要求I所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于所述的重组乳酸杆菌在重组表达质粒中，设计并合成的一对特异性引物用于扩增枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因，分别为 上游引物 PI : 5' -AATCTAGATGTYGAGCCAATATGATGAG-3'(下划线为 XbaI 酶切位点); 下游引物 P2 :5' -TCCCCCGGGACTAATCTGGTACTGATG-3'(下划线为 Sma I 酶切位点)。
5.根据权利要求I所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于所说的纤维素的DNA序列，其包含序列表SEQ ID NO. I的序列或经修饰的序列。
6.根据权利要求I所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于所述的重组乳酸杆菌在重组表达质粒中，设计并合成的一对特异性引物用于扩增短小乳杆菌的信号肽基因，其引物分别为上游引物 P3 :5’ -AACTGCAGATGCAATCAAGTTTAAAG-3 , PstI 位点为 CTGCAG ； 下游引物 P4 :5’ -CGCTCTAGAGTTAGCTGAAGCAGTCGT-3，, XbaI 位点为 CTGCAG。·
7.根据权利要求3所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于所述的用于扩增短小乳杆菌(Lactobacillus brevis I. 2028)的信号肽基因具有序列表SEQ ID NO. 2 PJf述的氨基酸序列。
8.根据权利要求I所述的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌，其特征在于重组乳酸杆菌含有表达质粒pllac-sp-cel,重组表达质粒pllac-cel含有乳酸杆菌复制子ori、核糖体结合位点RBS、操纵子lac、乳酸杆菌信号肽基因sp、纤维素酶基因cel、核糖体结合位点RBS和抗性筛选基因红霉素Ery基因，其表达式为-ori-RBS-lac-sp-cel-RBS-Ery-。
9.一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌制备而成的饲料，其特征在于具体组成为转纤维素酶基因重组乳酸杆菌占饲料总重的O. 1%。
10.一种该转纤维素酶基因重组乳酸杆菌作为添加剂在制备饲料中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种转纤维素酶基因重组乳酸杆菌及其制品和应用，转纤维素酶基因重组乳酸杆菌编码的蛋白质具有序列表SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。本发明所构建的转纤维素酶基因重组乳酸杆菌可以作为一种口服饲料添加剂应用于养猪业或养禽业，从而可以弥补猪、禽肠道不能分泌纤维素酶的不足，而不必添加昂贵的纤维素酶制剂，不仅有利于促进饲料原料中的粗纤维的代谢，而且可以促进猪的生长，增加养殖的经济效益。此外，宿主菌乳酸杆菌是一种干酪乳杆菌，其本身对动物机体也有益生功能，通过本发明可提供一种人工产纤维素酶益生基因工程乳酸杆菌，在猪、禽等单胃动物生产中具有重要的应用价值。
文档编号C12N9/42GK102676441SQ20121001085
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月2日 优先权日2012年3月2日
发明者丁轲, 余祖华, 刘一尘, 刘炜, 王天奇, 程相朝, 胡益源, 赵振升, 闫文朝, 黄俊克 申请人:河南科技大学