专利名称：一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及ー种ー菌多酶菌株产蛋白酶的方法，具体涉及对一菌多酶菌株产蛋白酶的条件进行优化，并对蛋白酶酶学性质进行分析，属于微生物技术领域。
背景技术：
酶制剂最初是以动、植物作为原料直接提取，但由于动、植物生长周期长、原料有限、酶提取エ艺复杂等多种因素的影响，不适于大規模的エ业生产。而微生物在酶制剂的生产中有其他生物不可比拟的优越性微生物对外界环境有很强的适应性和变异能力，人们可利用各种生物学技术按照自己的意愿对微生物进行改造，生产出目的酶；微生物对营养物质的要求不高，大部分是农产品废弃物，价格低廉，易得到，生产成本低；大部分微生物繁殖快，生长周期短，有利于提高酶制剂的产量等。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种ー菌多酶菌株产蛋白酶的方法。为了实现上述目的，本发明的方法采用了ー种ー菌多酶菌株产蛋白酶的方法包括以下步骤将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)l. 1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO M 2011286，可产蛋白酶等9种酶，其中蛋白酶活特别高，将其刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37°C温箱中培养24h，发现有水解圈产生,而且水解圈与菌落直径的可达4. 80。在培养基初始pH值7. 0，接种量为3%，种龄22h，培养温度37°C，发酵时间24h时，所产生的蛋白酶酶活达到最高。以I %可溶性淀粉为最佳碳源、I %酵母浸粉为最佳氮源，使发酵培养基组分达到最优。所产生的蛋白酶在温度25_40°C范围内稳定性较好。所产生的蛋白酶最适作用温度为40°C。所产生的蛋白酶在pH5. 5-6. 5条件下较稳定。所产生的蛋白酶在最适pH为值5. 7。在所产生的蛋白酶，Mn2+和Cu2+可显著提高该蛋白酶的酶活，Mg2+、Ba2+、Zn2+对该蛋白酶也有一定的促进作用，Al3+、Fe2+对该蛋白酶具有不同程度的抑制作用，且Al3+的抑制作用明显强于Fe2+。本发明对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件如pH值、接种量、装液量、种龄、培养温度、培养基组分中的碳源、氮源进行优化。结果表明，该菌株产蛋白酶的最适发酵时间24h，最适宜培养基pH值7. 0，接种量为3 %，装液量15mL/100mL，种龄22h，控制培养温度37°C。最优碳源为可溶性淀粉，氮源为酵母浸粉。并通过Folin酚法对影响蛋白酶酶活的温度、pH、热稳定性以及金属离子等因素进行了研究。结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用温度为40°C，最适作用pH为5. 7，Mn2+和Cu2+对酶有一定的促进作用，Al3+对酶有強烈的抑制作用。本发明中所涉及的枯草芽孢杆菌菌株可产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、月旨肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等9种酶，其中蛋白酶、甘露葡聚糖酶和糖化酶产量比较高，而各酶之间的相互影响因素、诱导条件，最佳产酶条件及复合酶制剂最佳配伍都有待于进ー步开发研究。本发明对蛋白酶最适的培养基配制、最适的发酵条件以及影响其酶活的相关因素进行了探讨，以期达到高质、高量的产生木聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、甘露葡聚糖酶、糖化酶等复合酶制剂，实现ー菌多酶发酵奠定了基础。酪氨酸标准曲线的绘制取6支试管，依照表I配制不同浓度的酪氨酸标准溶液，分别取上述溶液各I. OOmL，各加O. 4mol/L碳酸钠溶掖5. OOmL，Folin酚试剂稀释液I. OOmL，置于40°C ±2°C水浴中显色20min后取出，用分光光度计于波长660nm,用IOmm比色皿比色，以不含酪氨酸的O号管为空白，分别测定其吸光度，记录0D660 值。以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据作图，计算出当吸光度为I时的酪氨酸的量，即为吸光常数K值。表I酪氨酸标准曲线绘制方法
体ロ 酪氨酸标准溶液浓度取lOOug/mL酪氨酸标取水的体积(mL)
(ug/mL)准溶液体积(mL)
0OO10
12028
24046
36064
48082
一5 _100_10 _O _酶活的计算公式蛋白酶活力(U/mL) = Δ 0D660nmXNXKX4/10A0D660nm为以对照样品为空白时样品的光密度值；K为光密度为I. 00时所相当的酪氨酸浓度；N为酶液的稀释倍数；4为反应试剂的总体积；10为反应时间IOmin。枯草芽孢杆菌产蛋白酶发酵条件的优化I.菌种的活化及种子液的制备取冻干枯草芽孢杆菌菌种划线法接种于普通琼脂培养基上，37°C条件下培养18-24h。并挑起单个菌落接种于液体培养中，37°C、140rpm条件下培养18h，保存备用。2.发酵培养条件对酶活的影响(I)不同发酵时间对菌株产蛋白酶的影响将种子液按2%接种量接入发酵培养基中，37。。140印111培养，于811、1211、1611、2011、2411、2811分别去发酵产物，用改良？01丨11酚法对其酶活进行測定。(2)不同培养基初始pH值对菌株产蛋白酶的影响将种子液按2%接种量接入pH值分别是5. 4,6. 2,7. 0,7. 8,8. 6发酵培养基中，37°C 140rpm摇床振荡培养，以上述时间为最优培养时间，分别取样用改良Folin酚法对其酶活进行測定。
(3)不同接种量对菌株产蛋白酶的影响种子液分别按112%,314%,5%接种于发酵培养基中，37°C 140rpm以上述最优时间、最佳pH值培养，分别取样用改良Folin酚法对其酶活进行測定。(4)不同菌龄对菌株产蛋白酶的影响分别取种子液菌龄为10h、13h、16h、19h、22h、25h接种于发酵培养基中，37°C 140rpm以最优时间、pH值、接种量培养分别取样品，用改良Folin酚法对其酶活进行測定。(5)不同温度对菌株产蛋白酶的影响将最佳菌龄的种子液按最佳接种量接种于适宜培养基中，分别在27 °C、32 °C、37 °C、42で、47 °C下，140rpm培养，分别取样，用改良Folin酚法对其酶活进行測定。3.发酵培养基组成对酶活的影响
(I)不同碳源对菌株产蛋白酶的影响分别用1%葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和麦芽糖等量替代基础发酵液中的蔗糖制成培养基。在最佳培养条件下进行发酵培养，分别取样品，用改良Folin酚法对其酶活进行測定。(2)不同氮源对菌株产蛋白酶的影响采用最优碳源，氮源改用1%尿素、氯化铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉替代基础发酵培养液中1%蛋白胨，在最佳培养条件下进行发酵培养，分别取样品，用改良Folin酚法对其酶活进行測定。枯草芽孢杆菌蛋白酶影响因素的研究I. pH对蛋白酶活性的影响以不同pH值的缓冲液I倍稀释酶液，制得pH分别为5. 0,5. 5,6. 0,6. 5,7. O的酶液，在40°C下保温30min，并用相应pH值的缓冲液配制酪蛋白溶液作为底物，用改良Folin酚法对其酶活进行測定。2.温度对蛋白酶活性的影响将酶液用pH 7.5的磷酸缓冲液1倍稀释后，分别在25で、30で、35で、40で、45で下以酪素溶液为底物，用改良Folin酚法测定酶活力。3.常见金属离子对蛋白酶活性的影响分别将CuS04、FeS04、MgS04、MnS04、ZnS04、BaCl2、AlCl3 配成 O. Olmol/L 的溶液，各取ImL分别加入到纯化的ImL酶液中(即将酶液稀释2倍)，在最适温度下处理IOmin后，并以不加金属离子的酶液作对照，用改良Folin酚法測定残余蛋白酶活力。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) I. 1111,保藏于位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO M 2011286，保藏日期为2011年8月11日。
图I为酪氨酸标准曲线图；图2为发酵时间对菌株产蛋白酶的影响；图3为不同培养基初始pH值对产酶的影响；图4为不同接种量对产酶的影响；图5为不同种龄对产酶的影响；图6为不同温度对产酶的影响；图7为不同碳源对产酶的影响；图8为不同氮源对产酶的影响；
图9不同pH对酶活的影响；图10为温度对酶活的影响；图11金属离子对酶活的影响。
具体实施例方式(一)酪氨酸标准曲线绘制实施例依据实验結果，以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制酪氨酸标准曲线。如图I所示，据图计算线性回归方程的斜率K = 92. 98，即吸光常数为92. 98。( ニ)枯草芽孢杆菌产蛋白酶发酵条件的优化实施例
I.发酵培养条件对枯草芽孢杆菌产蛋白酶的影响(I)发酵时间对菌株产蛋白酶的影响将种子液按2%接种量接入发酵培养基中，37°C 140印111培养，于811、1211、1611、2011、24h、28h分别去发酵产物，用改良Folin酚法测定酶活结果如图2所示。由图2可知，培养初期枯草芽孢杆菌开始产生蛋白酶，随着培养时间的延长，酶活性逐渐升高。培养24h酶活性达到最高，为23. 39U/mL, 28h后酶活性比24h的低。因此该菌株产生蛋白酶的最佳培养时间为20-24h，随后酶活力开始下降，产蛋白酶与菌体生长同步进行，该蛋白酶生物合成类型属于同步合成型。(2)培养基初始pH值对菌株产蛋白酶的影响将种子液按2%接种量接入pH值分别是5. 4,6. 2,7. 0,7. 8,8. 6发酵培养基中，370C 140rpm摇床振荡培养，培养24h，分别取样用改良Folin酚法对其酶活进行測定，结果如图3所示。由图3可知，培养基起始pH过高或过低都会影响蛋白酶的产生，尤其是当pH值达8. 6时，对蛋白酶的产生有非常大影响，pH为6. 2吋，酶活为17. 39U/mL, pH为7. O时，产酶效果最好，酶活达到19. 67U/mL。(3)接种量对菌株产蛋白酶的影响种子液分别按I %、2 %、3 %、4 %、5 %接种于pH7. O发酵培养基中，370C 140rpm24h，分别取样用改良Folin酚法对其酶活进行測定，其结果见图4。由图4可知，接种量3%时，其酶活最高。接种量为1%、2%时产酶量较低；接种量为4%、5%时，蛋白酶产量也较低。(4)不同菌龄对菌株产蛋白酶的影响分别取种子液菌龄为1011、1311、1611、1911、2211、2511按3%接种于？!17.0发酵培养基中，37°C 140rpm24h,分别取样品，用改良Folin酚法对其酶活进行測定，其结果见图5所示。由图5可知，接种13h菌龄的种子液产酶量最低，比IOh种龄的还低，这可能是由实验条件引起的，如发酵瓶溶氧量等，接种19h到22h菌龄的种子液，菌株产酶量大逐渐增大，22h后产酶量大逐渐減少。(5)不同温度对菌株产蛋白酶的影响将22h菌龄的种子液按3%接种于pH7. O发酵培养基中，分别置于27°C、32°C、37°C、42°C、47°C，140rpm摇床振荡24h，分别取样用改良Folin酚法对其酶活进行測定，其结果见图6所示。
由图6可知，培养温度低于27°C时，酶活性较低，随着温度的升高，酶活性逐渐提高；培养温度达到37°C时，发酵液的酶活性最高，为23. 39U/mL ;随着温度升高，酶活性开始下降2.发酵培养基组成对酶活的影响(I)不同碳源对菌株产蛋白酶的影响分别用I %葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和麦芽糖等量替代基础发酵液中的蔗糖制成培养基，置于37°C 140rpm下培养24h，分别取样品，用改良Folin酚法对其酶活进行測定，其结果见图7。由图7可知，以可溶性淀粉为碳源时酶活最高，蔗糖次之，而麦芽糖作为碳源时产酶量最低。(2)不同氮源对菌株产蛋白酶的影响 采用可溶性淀粉为碳源，氮源改用1%尿素、氯化铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉替代基础发酵培养液中1%蛋白胨，置于37°C 140rpm下培养24h，分别取样品，用改良Folin酚法对其酶活进行測定，结果见图8。由图8可知，蛋白胨、牛肉膏等有机氮相对尿素、氯化铵等无机氮而言，产蛋白酶酶活较高，尤其是以酵母浸粉为氮源时酶活最高。(三)枯草芽孢杆菌蛋白酶影响因素的研究实施例I. pH对蛋白酶活性的影响以不同pH值的缓冲液I倍稀释酶液并用相应pH值的缓冲液配制酪素溶液作为底物，用改良Folin酚法对其酶活进行測定，其结果见图9。如图9所示，pH在5. 0-5. 7时，酶活性随着pH值的升高而升高；pH5. 7时，酶活性达到最高；PH > 5. 7时，酶活性呈下降趋势。因此，该酶在弱酸性环境下比较稳定，酶的最适pH为5. 7。2.温度对蛋白酶活性的影响将酶液用pH 7.5的磷酸缓冲液1倍稀释后，分别在25で、30で、35で、40で、45で下以酪素溶液为底物，用改良Folin酚法测定酶活力，其结果见图10。如图10示，在25_40°C之间，酶活性随着温度的上升而上升；40°C时，酶活性达到最高；超过40°C后，酶活性开始下降。因此，蛋白酶的最适反应温度为40°C。3.常见金属离子对蛋白酶活性的影响分别将CuS04、FeSO4, MgSO4, MnSO4, ZnSO4, BaCl2, AlCl3 配成 O. Olmol/L 的溶液，各取ImL分别加入到纯化的ImL酶液中(即将酶液稀释2倍)，在40°C处理IOmin后，并以不加金属离子的酶液作对照，用改良Folin酹法测定残余蛋白酶活力,其结果见图11。由图11可知，经Al3+、Fe2+处理后，酶活性低于对照，表明这两种离子对蛋白酶活性有不同程度的抑制作用，而Al3+的抑制作用明显强于Fe2+ ;经Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ba2+、Zn2+处理后，酶活性高于对照，表明这几种金属离子对蛋白酶活性有促进作用，其中Mn2+和Cu2+的促进作用尤其强，酶活分别增加了 42. 4%和38. 9%, Mg2+、Zn2+、Ba2+的促进作用相近，酶活分别增加了 9. 4%,8. 2%和7. 6%。
权利要求
1.一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于包括以下步骤将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)l. 1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO M2011286刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37°C温箱中培养24h，发现有水解圈产生，而且水解圈与菌落直径的可达4. 80。
2.根据权利要求书I中所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于在培养基初始pH值7. O，接种量为3 %，种龄22h，培养温度37°C，发酵时间24h时，所产生的蛋白酶酶活达到最闻。
3.根据权利要求书I所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于以1%可溶性淀粉为最佳碳源、I %酵母浸粉为最佳氮源，使发酵培养基组分达到最优。
4.根据权利要求书I所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于所产生的蛋白酶在温度25-40°C范围内稳定性较好。
5.根据权利要求书4所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于所产生的蛋白酶最适作用温度为40°C。
6.根据权利要求书I所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于所产生的蛋白酶在pH5. 5-6. 5条件下较稳定。
7.根据权利要求书6所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于所产生的蛋白酶在最适pH为值5. 7。
8.根据权利要求书I所述一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，其特征在于在所产生的蛋白酶，Mn2+和Cu2+可显著提高该蛋白酶的酶活，Mg2+、Ba2+、Zn2+对该蛋白酶也有一定的促进作用，Al3+、Fe2+对该蛋白酶具有不同程度的抑制作用，且Al3+的抑制作用明显强于Fe2+。
全文摘要
本发明涉及一种一菌多酶菌株产蛋白酶的方法，包括以下步骤将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)1.1111，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NOM 2011286刺种在酪蛋白琼脂培养基上，在37℃温箱中培养24h，发现有水解圈产生，而且水解圈与菌落直径的可达4.80。本发明通过Folin酚测定酶活法测定其最优酶活条件为在培养基初始pH值7.0，接种量为3％，种龄22h，培养温度37℃，发酵时间24h时，所产生的蛋白酶酶活达到最高。同时，通过Folin酚测定酶活法对影响蛋白酶酶活的温度、pH、热稳定性以及金属离子等因素进行了研究。结果表明该菌株所产蛋白酶最适作用温度为40℃，最适作用pH为5.7，Mn2+和Cu2+对酶有一定的促进作用，Al3+对酶有强烈的抑制作用。本发明为进一步探索各酶相关影响因素、最适的培养基配制、最适的发酵条件、最佳的复合酶配伍，以期实现一菌多酶高质、高量的共同发酵生产奠定基础。
文档编号C12R1/125GK102676483SQ20121001142
公开日2012年9月19日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者丁轲, 关随霞, 刘一尘, 吴庭才, 张谦, 李宏伟, 李小康, 李银聚, 汪洋, 王臣, 盛敏, 程相朝, 龚婷 申请人:河南科技大学