专利名称：高产s-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，并对该菌株发酵生产S-腺苷蛋氨酸的过程进行了优化，S-腺苷蛋氨酸的产量可达4.37 g/L，达到工业化生产水平。
背景技术：
S-腺苷蛋氨酸英文名为S-adenosy Imethionine,简称SAM,化学名称为5’ -[[(3S) -3-氨基-丙基]甲基-(S)-砜]-5’ -脱氧腺苷，分子式C15H22N6O5S,分子量为399。S-腺苷蛋氨酸是广泛存在于生物体内的一种重要生理活性物质，具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用，参与了体内40多种生化反应，与蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成密切相关，并连接多胺和谷胱甘肽的转化。近年来的研究表明，S-腺苷蛋氨酸对肝病、抑郁症、关节炎、纤维性肌痛、偏头痛等疾病具有治疗作用。(I)治疗肝病。大量临床研究证明，SAM对各种原因引起的肝功能异常有良好疗效，包括各种原因引起的慢性肝炎、原发胆汁性肝硬化、药物性胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等。(2)治疗抑郁症。与其他抗抑郁药不同，SAM抗抑郁作用无计量相关性，起效快，几乎无不良反应，耐受性好。(3)治疗关节炎。与非类固醇类抗炎药性比，SAM既不抑制前列腺素合成，也不会损伤胃肠道。(4)治疗纤维性肌痛、偏头痛。SAM可以使止痛药用量降低，改善患者情绪。此外，SAM还可以治疗阿尔茨海默氏症、癫痫、帕金森氏病、亚急性脊髓变性以及HIV引起的神经性并发症等。目前，SAM主要从大肠杆菌、酵母、链霉菌中分离纯化制得。但是由于SAM的表达量小，纯化蛋白步骤烦琐，SAM稳定性差、易发生失活反应，产物得率低。尤其在国内，尽管很早就开始研究，虽然近几年取得一定进步，但因技术水平较低、成本过高仍未能够产业化，相关产品长期依赖进口，价格昂 贵，远远不能被普遍使用，严重阻碍了市场拓展，研究和开发新的制备方法已成为当务之急。采用基因工程和发酵工程相结合的方法将有望降低成本且能大规模生产S-腺苷蛋氨酸。随着基因工程技术的完善和发展，不断地有新的基因工程产品面市，目前至少有50%以上的重组蛋白药物是用基因工程技术生产的，如人胰岛素、干扰素、白细胞介素-2、生长激素、粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、表皮生长因子等。表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容，也是生命科学研究领域的热点。毕赤酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，有多种受体菌和表达载体可供选择，可进行胞内表达或分泌表达，是良好的表达系统。SAM有着巨大的国际市场需求，据国际卫生组织有关的报告:目前，全球每年用在治疗肝病和帕金森氏病等疾病的SAM大约需要450-500t左右。SAM在国内的市场也非常广阔。我国是肝炎流行的大国，而我国目前尚无一种真正改善肝细胞代谢的生物药物。同时，随着社会物质生活水平的不断提高和社会竞争的持续加剧，患有脂肪肝等肝病患者的人数越来越多，抑郁症人数也与日俱增，S-腺苷蛋氨酸的需求量将会日益增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法。高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:
(O从酿酒酵母基因组中PCR扩增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，连接至质粒PPIC9K中，得到真核表达载体pPIC9K-sam2，然后将其转化到巴斯德毕赤酵母；
(2)从毕赤酵母基因组中PCR扩增出胱硫醚β合成酶基因cbs，将其亚克隆至载体PMD19T中，得到重组载体T-cbs ;将博莱霉素抗性基因zeocin导入重组载体T_cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除质粒T-C-Z，酶切后获得cbs基因敲除片段C-Z ；
(3)将片段C-Z转化至步骤I所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德毕赤酵母，得到敲除cbs基因又强化sam2基因 的高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株。进一步地，步骤I中S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的扩增引物序列为:
SanfZ-Y:5’ -CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3，
Sam2~R:5， -GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3，。步骤2中胱硫醚β合成酶基因的扩增引物序列为:
Cbs-F:5’ -TTCTGGAGCACATTGGAA-3’
Cbs-R:5’ -AGTGTATGCCTAGATGG-3’。步骤2中所述博莱霉素抗性基因从pPICZa-A中扩增得到，其扩增引物序列为: Zeocin-F:5’ -GGACTAGTAGACCTTCGTTTGTGC-3’
Zeocin-R:5’ -GGACTAGTCGGTTCCTGGCCTTTTG-3’。本发明的另一个目的在于提供通过上述方法所构建的高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株。本发明采用现代生物技术，构建了能够高效表达酿酒酵母S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的重组载体以及敲除巴斯德毕赤酵母基因组中的胱硫醚β合成酶基因，再将该重组载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高表达的SAM工程菌，并对该菌的发酵条件进行了优化。为了提高S-腺苷蛋氨酸的产量，本发明首先将来自酿酒酵母的S-腺苷蛋氨酸合成酶基因(sam2)连接到表达载体pPIC9K中，再将该重组载体转至表达量高、易于纯化及放大的巴斯德毕赤酵母中，构建sam2基因强化菌株；同时，本发明将毕赤酵母中的胱硫醚β合成酶基因(cbs)连接至载体pMD19T中，构建重组载体T-cbs，再将博莱霉素抗性基因zeocin导入重组载体T-cbs的cbs基因，酶切后获得cbs基因敲除片段C_Z，再将该片段转至上述巴斯德毕赤酵母菌中，构建既强化sam2基因又敲除cbs基因的工程菌，以实现高效廉价SAM的产业化生产。在本发明优化的条件下，S-腺苷蛋氨酸的产量可达4.37 g/L，达到工业化生产水平。
图1表示包含sam2基因序列的的真核表达载体的构建。
图2表示包含被敲断cbs基因序列的的重组载体的构建。图3表不发酵过程中菌株生物量和S-腺苷蛋氨酸产量的变化。图4表示发酵罐中S-腺苷蛋氨酸的液相色谱图。
具体实施例方式实施例1.重组表达载体pPIC9K_sam2的构建
利用引物 sam2-F:5’ -CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3’ ；sam2-R:5’ -GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3 ’从酿酒酵母基因组中扩增出基因sam2，用EcoRl和BamHl分别双酶切PCR扩增产物和PPIC9K质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T4DNA连接酶连接回收的目的条带，得到真核表达载体pPIC9K-sam2，用CaCl2法42°C热激90秒将其转化到大肠杆菌DH5a。利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆经PCR、酶切鉴定证明克隆正确后送大连宝生物公司测序。具体操作见图1。实施例2.cbs基因敲除质粒T-C-Z及片段C-Z的获得
利用引物 cbs-F:5，-TTCTGGAGCACATTGGAA-3，；cbs-R:5，-AGTGTATGCCTAGATGG-3’从毕赤酵母基因组中扩增出cbs基因，将其亚克隆至载体pMD19T中，得到重组载体 T-cbsο 利用引物 zeocin-F:5’ -GGACTAGTAGACCTTCGTTTGTGC-3，；zeocin-R:5’ -GGACTAGTCGGTTCCTGGCCTTTTG-3’ 从 pPICZ a -A 中扩增出 zeocin 基因，用分el 分别酶切PCR产物zeocin基因和重组质粒T-cbs，割胶回收后用T4DNA连接酶连接回收片段，得到cbs基因敲除质粒T-C-Z。经PCR鉴定及酶切鉴定成功后，送大连宝生物公司测序。测序成功后，用fe7I和汝"/11双酶切重组质粒T-C-Z，割胶回收2100bp大小的片段，命名为C-Z。具体操作流程见图2。`实施例3.重组巴斯德毕赤酵母的转化和筛选
将鉴定正确的重组表达载体pPIC9K-sam2质粒DNA经内切酶极^/11021线性化处理，电击转化毕赤酵母GS115。电击结束后，立即加入Iml预冷的lmol/1山梨醇，3000rpm离心5min，菌体重悬于400 μ I预冷的lmol/1山梨醇中，取200 μ I涂布于MD平板(1.34%ΥΝΒ, 4Χ10_5%生物素，2%葡萄糖，2%琼脂糖)上，30°C培养至菌落出现。随机挑取菌落点种到含不同浓度 G 418 (0，0.50mg/ml, 1.00mg/ml, 2.00mg/ml, 3.00mg/ml, 4.0Omg/ml)的YH)平板上，30°C培养2 5d，每天检查菌落生长情况。根据生长情况快速筛选出G 418抗性较高的阳性克隆转化子ZJGSU01。将C-Z片段分别电击转化毕赤酵母GS115和ZJGSU1，电击转化步骤同上，取200 μ I涂布含有zeocin、组氨酸和谷胱甘肽的MD平板，30°C培养至菌落出现，根据生长情况分别筛选出cbs基因敲除菌ZJGSU02和既敲除cbs基因又强化sam2基因的工程菌ZJGSU03。实施例4.重组菌株ZJGSU03发酵生产SAM的过程优化
将菌株ZJGSU03接种于5 mL YH)液体培养基中，30°C，220 rpm振荡培养16 h后，转接于含100 mL YI3D液体培养基的500 mL摇瓶中。以此作为发酵种子。将种子接种于2 L BMGY培养基中，在线灭菌并冷却后，加入1.34% ΥΝΒ、4Χ1(Γ5%生物素和8 mL PTM1，用25%_28%的氨水调节PH至5.0，将种子液以5 %的接种量接种于5 L发酵罐中，温度30°C，搅拌速度600印111，通气量2.0 vvm。此阶段流加氨水控制ρΗ5.0，溶氧20%左右。培养约18 h后，甘油耗尽，溶氧急剧上升，以100 mL/h的速度开始流加甘油(50%，含L-met 10 g/L, PTMl 12mL/L),约10 h后，菌体湿重大约达到200g/L时，停止流加。此阶段控制pH5.0，溶氧20%左右。甘油停止流加后，碳源饥饿I h，以便酵母更好地利用甲醇。底物L-met的补加:根据响应面优化的结果，L-met的补加量为1.0%，5 L罐补加的质量应为50 g，甘油流加阶段已补充了 10 g左右，而诱导阶段共持续96个小时，故剩下的40 g L-met每24 h加入一次，每次10 g，共4次。当碳源饥饿阶段结束后，开始慢慢增加甲醇的补加量，直至溶氧量降到30%，固定此时的甲醇流加速度，一直以此速度流加至发酵结束。上述发酵过程菌株生物量的变化和S-腺苷蛋氨酸产量的变化如图3所示，在上述条件下，S-腺苷蛋氨酸产量最高大
4.37g/L。发酵罐中S-腺苷蛋氨酸的液相色谱图如图4所示。 本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。
权利要求
1.产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (O从酿酒酵母基因组中PCR扩增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，连接至质粒PPIC9K中，得到真核表达载体pPIC9K-sam2，然后将其转化到巴斯德毕赤酵母； (2)从毕赤酵母基因组中PCR扩增出胱硫醚β合成酶基因cbs，将其亚克隆至载体PMD19T中，得到重组载体T-cbs ;将博莱霉素抗性基因zeocin导入重组载体T_cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除质粒T-C-Z，酶切后获得cbs基因敲除片段C-Z ； (3)将片段C-Z 转化至步骤I所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德毕赤酵母，得到敲除cbs基因又强化sam2基因的高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株。
2.按权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤I中S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的扩增引物序列为:SanfZ-Y:5’ -CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3，Sam2~R:5， -GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3，。
3.按权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中胱硫醚β合成酶基因的扩增引物序列为:Cbs-F:5’ -TTCTGGAGCACATTGGAA-3’Cbs-R:5’ -AGTGTATGCCTAGATGG-3’。
4.按权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述博莱霉素抗性基因从PPICZa-A中扩增得到，其扩增引物序列为:Zeocin-F:5’ -GGACTAGTAGACCTTCGTTTGTGC-3’Zeocin-R:5’ -GGACTAGTCGGTTCCTGGCCTTTTG-3’。
5.权利要求1-4任一构建方法所构建的高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株。
全文摘要
本发明公开了一种高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤从酿酒酵母基因组中PCR扩增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，连接至质粒pPIC9K中，得到真核表达载体pPIC9K-sam2，然后将其转化到巴斯德毕赤酵母；从毕赤酵母基因组中PCR扩增出胱硫醚β合成酶基因cbs，将其亚克隆至载体pMD19T中，得到重组载体T-cbs；将博莱霉素抗性基因zeocin导入重组载体T-cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除质粒T-C-Z，酶切后获得cbs基因敲除片段C-Z；将片段C-Z转化至步骤1所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德毕赤酵母，得到敲除cbs基因又强化sam2基因的高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株。
文档编号C12N15/09GK103087934SQ20121001218
公开日2013年5月8日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者于平 申请人:浙江工商大学