专利名称：凝胶电泳核酸标志物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳核酸标志物，尤其涉及ー种可用于分析、分离小分子核酸PAGE电泳的核酸标志物、及其制备方法和应用。
背景技术：
凝胶电泳(Gel electrophoresis)是用于分离和分析不同物理性质的分子的ー类技木，该方法操作简便快捷，可以分辨其它方法不能分类的DNA、RNA片段，因此被广泛应用于分子生物学、遗传学和生物化学，通过检测出的不同条带，即可确定核酸的位置，进行进一歩分析或回收。核酸的凝胶电泳一般采用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)，其中，聚丙烯酰胺凝胶具有较高的分辨率，能有效分离相差Int的核酸分子，因此，对于小分子(く 200nt)核酸的电泳，一般采用聚丙烯酰胺凝胶。目前用作小分子(<100nt)核酸电泳的分子对照物(标志物)很少，并且大多为单链 RNA。由于RNA酶无处不在，并且难以灭活，通常在操作前需要对所用器材进行严格处理，对操作者技术要求较高，大大限制了 RNA分子标志物的应用。而不含变性剂(如尿素、甲酰胺等)的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离IOOnt以下片段RNA、尤其是20nt左右微小RNA (miRNA), 尚缺乏有效的分子标志物。通过液相杂交然后非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可用于小分子核酸的检测， 该方法建立在传统Northern Blot技术核心上，能有效检测样品内非编码小RNA的表达量， 具有简便、经济、快速、可靠等特点。然而要获得准确可靠的結果，必须有非变性聚丙烯酰胺电泳相对应的分子标志物作參照。因此，需要探索用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离更为稳定、可靠的核酸分子标志物。
发明内容
针对小分子核酸凝胶电泳分子标志物缺乏、以及实用性受限的缺陷，本发明提供了ー种新型小分子核酸标志物，用于液相杂交后非变性PAGE凝胶电泳分子对照，尤其适用于对<200bp核酸的检测。本发明第一个目的是提供ー种核酸电泳的分子标志物，包括包括单链DNA，还包括DNA-DNA双链和/或DNA-RNA杂化双链。DNA-DNA双链中的两个单链DNA碱基数目相同并且互补，同样地，DNA-RNA双链中的单链DNA和单链RNA碱基数目相同并且互补。其中，所述DNA-RNA杂化链中单链RNA优选为10nt、21nt、40nt、88nt的序列，进ー 步优选为21和40nt的序列；所述单链DNA、DNA-DNA双链和DNA-RNA杂化链中单链DNA优选为10nt、21nt、40nt、88nt的序列，进ー步优选为21和40nt的序列。本发明上述的非变性PAGE电泳核酸标志物的ー种优选实施方式，其中，单链DNA 和单链RNA中同一碱基连续不超过4个。
其中，单链DNA和单链RNA中A、G碱基占碱基总数量的百分比彡60%。本发明上述的非变性PAGE电泳的核酸标志物，单链DNA和/或单链RNA的3'端标记非同位素(生物素)。本发明第二个目的是提供ー种上述非变性PAGE电泳核酸标志物的制备方法，根据待测样品来源和探针类型，设计合成DNA单链及其互补单链DNA序列，RNA单链及其互补的DNA单链；DNA单链及其互补单链DNA序列，RNA单链及其互补的DNA单链通过液相杂交按照碱基互补配对原则分别形成DNA-DNA杂化链和/或DNA-RNA双链。其中，所述单链RNA和单链DNA优选为10nt、21nt、40nt、88nt的序列，进ー步优选为21nt和40nt的序列；如10nt、21nt、40nt、88nt等不同大小序列。例如
IOntDNA 序列(5‘ -3')
atgtagagctSEQ ID No. 1
IOntDNA 互补序列(5‘ -3')
agctctacatSEQ ID No. 2
2IntDNA 序列(5‘ -3')
acccagtagccagatgtagctSEQ ID No. 3
2IntDNA 互补序列(5‘ -3')
agctacatctggctactgggtSEQ ID No. 4
40ntDNA 序列(5' -3')
atcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgaggctbEQ ID No. 5
40ntDNA 互补序列(5' -3')
agcctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatSEQ ID No. 6
88ntDNA 序列(5' -3')
aaccatgacctcaagaacagtatttccaggaatccccatcttagcatctaagggattcctgggaaaactggac cgtgaggacaaggctSEQ ID No. 7
88ntDNA 互补序列(5' -3')
agccttgtcctcacggtccagttttcccaggaatcccttagatgctaagatggggattcctggaaatactgtt cttgaggtcatggttSEQ ID No. 8
2IntRNA 序列(5‘ -3')
agcuacaucuggcuacuggguSEQ iD No. 9
40 ntRNA 序列(5' -3') agccucgcuucggcagcacauauacuaaaauuggaacgaubEQ ID No. 10
本发明上述的非变性PAGE电泳核酸标志物的ー种优选实施方式，其中，DNA单链和RNA 单链中同一碱基连续不超过4个。其中，A、G碱基占碱基总数量的百分比不超过60%。本发明上述的非变性PAGE电泳核酸标志物，单链DNA和/或单链RNA的3'端还标记非同位素(生物素)。本发明第三个目的是提供ー种使用上述非变性PAGE电泳核酸标志物进行凝胶电泳检测核酸的方法，步骤包括
步骤1，核酸探针与待测核酸液相杂交；步骤2，加入分子对照物进行凝胶电泳；
步骤3，确定待测核酸探针和目的核酸的杂交链在凝胶电泳迁移。其中，所述待测核酸为可以是彡200bp的核酸，包括RNA和DNA。其中，所述凝胶电泳可以是含变性剂的PAGE或非变性PAGE凝胶电泳，最优选为非变性PAGE凝胶电泳。本发明用于非变性PAGE电泳的核酸对照物，可起到有效的分子标志作用，填补了缺乏液相杂交-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下的分子对照物空白；该非变性PAGE电泳的核酸对照物中DNA单链对照物同样也适用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子对照，拓展了该系列分子对照物的应用。
图1为使用末端转移酶在单链DNA末端标记生物素，经聚丙烯酰胺胶电泳检测显示結果；
图2为紫外交联固定，结合链亲和霉素-HRP，显影发光检测不同分子杂交链标记的有效性结果；
图3为各DNA单链及不同大小单链DNA混合后在非变性PAGE电泳的迁移； 图4为使用本发明的核酸标志物检测微小RNA在非变性PAGE电泳迁移； 图5为使用本发明RNA-DNA双链为对照物、凝胶电泳监测微小RNA电泳照片； 图6为使用本发明DNA-DNA双链为对照物、凝胶电泳监测微小RNA电泳照片。
具体实施例方式核酸对照物序列的设计源于探针与目的核酸杂交的原理，综合考虑到序列的可靠性及能在一定条件下形成杂交双链或杂化链。目前用于核酸杂交的探针主要有DNA探针、 cDNA探针、RNA探针、cRNA探针、寡核苷酸探针等，寡核苷酸单链DNA探针应用较为广泛，技术相对成熟。本发明根据序列类型及碱基互补配对原则，液相杂交后形成RNA-DNA双链、 DNA-DNA双链，提供了具有较高实用性的可用于非变性PAGE的分子对照物。首先根据寡核苷酸探针要求设计核酸对照物序列，但是为了避免单链DNA/RNA内部形成发夹或环状结构，同一碱基连续不超过4个，A、G碱基不超过碱基总数的60%，不同数目的核苷酸间不互补。合成DNA单链及其互补DNA序列，RNA单链及其互补的DNA序列，使用末端转移酶(TdT)在单链DNA 3’末端标记非同位素(生物素)，经聚丙烯酰胺胶电泳-转移至尼龙膜-HRP偶联的链亲和霉素检测寡核苷酸标记有效性；然后在液相杂交缓冲液中使RNA、DNA互补的序列模拟退火按照碱基互补配对原则形成RNA-DNA链、DNA-DNA双链。运用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，验证单链RNA、单链DNA、RNA-DNA双链及DNA-DNA双链在非变性聚丙烯酰胺胶中的迁移及评估作为小分子对照物的可能性。固相转移至尼龙膜或硝酸纤维素膜后，结合链亲和素酶-HRP，便可在X线光片显影以确认各分子的大小；同样，检测单链DNA、RNA-DNA双链、DNA-DNA双链混合液中不同碱基数的核酸的迁移并评估作为小分子核酸对照物的实用性。下面參照附图，通过实施例对本发明凝胶电泳核酸标志物、及其指标方法和应用进行详细的解释和描述，以使更好地理解本发明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。实施例1
选取不同核苷酸数目的单链DNA序列和RNA序列，其中，单链NDA序列分别为10nt、 21nt、40nt、88nt，单链RNA序列分别为21nt、40nt。所述单链DNA序列如下 IOntDNA 序列(5 ‘ -3')
atgtagagctSEQ ID No. 1
IOntDNA 互补序列(5‘ -3')
agctctacatSEQ ID No. 2
2IntDNA 序列(5 ‘ -3')
acccagtagccagatgtagctbEQ ID No. 3
2IntDNA 互补序列(5‘ -3')
agctacatctggctactgggtSEQ ID No. 4
40ntDNA 序列(5' -3')
atcgttccaattttagtatatgtgctgccgaagcgaggctSEQ ID No. 5
40ntDNA 互补序列(5' -3')
agcctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatSEQ ID No. 6
88ntDNA 序列(5' -3')
aaccatgacctcaagaacagtatttccaggaatccccatcttagcatctaagggattcctgggaaaactggac cgtgaggacaaggctbEQ ID No. 7
88ntDNA 互补序列(5' -3')
agccttgtcctcacggtccagttttcccaggaatcccttagatgctaagatggggattcctggaaatactgtt cttgaggtcatggttSEQ ID No. 8
2IntRNA 序列(5‘ -3')
agcuacaucuggcuacuggguSEQ ID No. 9
40 ntRNA 序列(5' -3') agccucgcuucggcagcacauauacuaaaauuggaacgauSEQ iD No. 10
使用末端转移酶在单链DNA的3'端标记生物素，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，显示单链DNA末端成功标记了生物素(图1)。然后混合DNA单链及其互补DNA序列、RNA及其互补DNA序列，液相杂交形成 DNA-DNA双链和DNA-RNA杂化链。液相杂交体系如下
DNA寡核苷酸A5μ 1
DNA寡核苷酸B5 μ 1 (或RNA单链)
退火缓冲液10 μ 1
总体积20 μ 1
按上述順序加入各试剂，混勻。置于95 ° C，5min，然后 42 ° C，2_3h。纯化后，使用Exonuclease I特异性切除单链未杂交核酸，反应体系如下杂交双链混合物2. 5 μ g
10 X Exonuclease I 缓冲液2μ 1iixonuclease 丄10 μ 1
ddH20补充至20 μ 1
置于 37 ° C、30min;然后 80 ° C、15min。使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至尼龙膜，紫外交联固定，结合链亲和霉素-HRP，显影发光检测不同分子杂交链标记的有效性。结果显示，杂交后的条带在未杂交条带上方，各杂交条带按碱基数大小依次排列(图2)。首先选择10nt、21nt、40nt、88nt的单链DNA及其混合物在非变性聚丙酰胺胶电泳，确认不同单链DNA分子在非变性聚丙酰胺凝胶的迁移(图3)。选择21nt单链RNA及互补DNA、40nt的单链RNA及互补DNA分别杂交形成双链， 并加入不同碱基数目的单链DNA混合物在非变性聚丙酰胺凝胶电泳，确认杂化双链在非变性聚丙酰胺凝胶的迁移(图3)。选择10nt、21nt、40nt、88nt单链DNA及各自互补单链DNA分别杂交成双链，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，确认DNA双链在非变性聚丙酰胺凝胶的迁移(图3)。本实施例制备的分子对照物具有如下特点
1)应用于非变性聚丙烯酰胺胶电泳检测小分子核酸，尤其适用于微小RNA的检测，对变性聚丙烯酰胺胶检测小RNA也具有分子參照作用。2)条带大小和含量容易记住。单链DNA分子对照物10nt、21nt、40nt、88nt ； DNA-DNA 分子对照 21nt、40nt、88nt、176nt ；DNA-RNA 分子对照 4&it、80nt。3)可预先设置各条带浓度，对DNA/RNA条带进行粗略定量。4)单链DNA，或DNA-DNA双链，DNA-RNA双链稳定性较好，可在_20°C长期保存，使用方便，快捷。实施例2
以检测微小RNA (约20nt)为例，使用上述实施例制备的分子对照物进行非变性 PAGE电泳方法如下miRNA探针和总RNA液相杂交，杂交后的双链长约40nt，加入含有 IOnt (2 μ Μ)、21nt (4 μ Μ)、40nt (4 μ Μ)、88nt (2 μ Μ)单链DNA分子对照物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。确定miRNA探针和目的核酸(待测核酸)的杂交链在非变性聚丙酰胺凝胶电泳迁移。结果如图4所示，可以看出，miRNA探针与目的核酸杂交条带与未杂交探针条带分离。说明本发明上述实施例制备的分子对照物能够用于非变性PAGE电泳检测miRNA序列。实施例3 RNA-DNA双链检测实例
以检测小RNA U6(约IOOnt)为例，使用上述实施例制备的分子对照物进行非变性PAGE 电泳方法如下U6探针和总RNA液相杂交，杂交后的条带约120nt，加入含有42nt、80nt (各 2 μ M)的RNA-DNA双链分子对照物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。确定U6探针和目的核酸 (待测核酸)的杂交链在非变性聚丙酰胺凝胶电泳迁移。结果如图5所示，可以看出，U6探针与目的核酸杂交条带出现在RNA-DNA双链对照物SOnt上方。说明本发明上述实施例制备的分子对照物能够用于非变性PAGE电泳检测小RNA序列。实施例4DNA-DNA双链检测实例
以检测微小RNA (约20nt)为例，使用上述实施例制备的分子对照物进行非变性 PAGE电泳方法如下miRNA探针和总RNA液相杂交，杂交后的双链长约40nt，加入含有 20nt (4 μ Μ)、42nt (4 μ Μ) DNA-DNA双链分子对照物在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。确定 miRNA探针和目的核酸(待测核酸)的杂交链在非变性聚丙酰胺凝胶电泳迁移。结果如图6所示，可以看出，miRNA探针与目的核酸杂交条带与未杂交探针条带分离。说明本发明上述实施例制备的分子对照物能够用于非变性PAGE电泳检测miRNA序列。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种凝胶电泳核酸标志物，其特征在干，包括单链DNA，还包括DNA-DNA双链和/或 DNA-RNA杂化双链；其中，DNA-DNA双链中的两个单链DNA碱基数相同，并且互补；DNA-RNA 双链中的单链DNA和单链RNA碱基数相同，并且互补。
2.根据权利要求1所述的凝胶电泳核酸标志物，其特征在干，所述DNA-RNA杂化链中单链RNA为IOnt 88nt的序列。
3.根据权利要求1所示的凝胶电泳核酸标志物，其特征在干，所述单链小DNA、DNA-DNA 双链和DNA-RNA杂化链中单链DNA为IOnt 88nt的序列。
4.根据权利要求2或3所述的凝胶电泳核酸标志物，其特征在干，所述单链DNA和/或单链RNA中，同一碱基数量连续不超过4个，A、G碱基占碱基总数的百分含量彡60%。
5.根据权利要求4所示的凝胶电泳核酸标志物，其特征在干，单链DNA和/或单链RNA 的3'端标记非同位素。
6.ー种应用权利要求1所述凝胶电泳核酸标志物进行凝胶电泳检测核酸的方法，其特征在于，步骤包括步骤1，核酸探针与待测核酸液相杂交；步骤2，加入权利要求1所述分子对照物中的一种或多种进行凝胶电泳；步骤3，确定待测核酸探针和目的核酸的杂交链在凝胶电泳迁移。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在干，所述待测核酸为<200bp的核酸。
8.—种如权利要求1所述的凝胶电泳核酸标志物的制备方法，其特征在干，设计合成单链DNA、单链DNA互补系列和/或单链RNA ；单链RNA、单链DNA、单链DNA互补序列液相杂交按照碱基互补配对原则形成RNA-DNA杂化双链和DNA-DNA双链。
9.根据权利要求8所述的凝胶电泳核酸标志物的制备方法，其特征在干，所述单链DNA 或单链RNA中，同一碱基数量连续不超过4个，A、G碱基占碱基总数的百分含量彡60%。
10.根据权利要求8所述的凝胶电泳核酸标志物的制备方法，其特征在干，所述单链 RNA为IOnt 88nt的序列；所述单链DNA为IOnt 88nt的序列。
全文摘要
本发明提供了一种聚丙烯酰胺凝胶电泳核酸标志物、所述凝胶电泳核酸标志物的制备方法以及使用所述凝胶电泳核酸标志物进行凝胶电泳检测核酸的方法，所述凝胶电泳核酸标志物包括单链DNA，还包括DNA-DNA双链和/或DNA-RNA杂化双链；其中，DNA-DNA双链中的两个单链DNA碱基数相同，并且互补；DNA-RNA双链中的单链DNA和单链RNA碱基数相同，并且互补，可用于液相杂交后非变性PAGE凝胶电泳分子对照，尤其适用于对<200bp核酸的检测。
文档编号C12N15/11GK102534012SQ20121001498
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者姜斌, 时婧, 郭跃辉, 高丰厚 申请人:上海交通大学医学院附属第三人民医院