专利名称：特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的pcr方法
技术领域：
本发明涉及一种大孢指疫霉菌(Sclerophthora macrospora)的检测方法，具体涉及一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR(聚合酶链式反应)技术。
背景技术：
大孢指疫霉菌是指疫霉属的一种真核菌，属于卵菌纲，此纲的成员的有性阶段产生卵孢子。此菌寄生于多种禾本科植物，易引起霜霉病。水稻受霜霉病危害之后心叶淡黄、 卷曲、不易抽出，下部老叶逐渐枯死，植株矮缩，不能抽穗或花器畸形，在局部地区造成严重损失。水稻霜霉病的诊断一般首先从症状上初步判断，再用显微镜检查病组织，如果检查到病菌卵孢子即确定为阳性。但检查到卵孢子时用药防治为时已晚，即便植株可以抽穗， 也不能正常结实。而早期的症状不易与除草剂药害和病毒病相区分。因此有必要建立一种早期检测技术，对未镜检到卵孢子的疑似病株进行诊断。在植物病原物的检测上，PCR是一种准确、高效、应用最广的技术，但应用于大孢指疫霉菌的检测方面，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其依据大孢指疫霉菌已经报告的核糖体大亚基RNA 基因序列来设计特异性PCR引物，建立起PCR诊断技术体系，可检测到多种禾本科植物如水稻、玉米等上的大孢指疫霉菌，解决水稻霜霉病早期检测难的问题。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，该方法是以大孢指疫霉菌特异性引物对待测样品进行PCR 扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为正向引物5，-AGAATGCAGCGCTAAGC-3，(如SEQ ID No 1 所示)(对应于EU拟6II9· 1的第加7-223个碱基)，反向引物5，-ATGCGCATCCACTCAGC-3，(如SEQ ID No 2 所示)(对应于 EU826119. 1 的第 629-613 个碱基)。详述如下一、引物的设计发明人根据真核生物核糖体RNA基因碱基序列的特异性，从NCBI/GenBank搜索并下载大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖体大亚基RNA基因碱基序列(GenBank :EU826119. 1共 846个碱基)，只得到一条序列。依据此序列用primerBLAST工具设计特异性PCR引物序列如下正向引物5，-AGAATGCAGCGCTAAGC-3，(对应于EU拟6II9· 1的第加7-223个碱基)
反向引物5，-ATGCGCATCCACTCAGC-3，(对应于 EU826119. 1 的第 629-613 个碱基)；上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预期大小为423个碱基。将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见图1和图2。结果表明与正向引物序列和反向引物序列均100%覆盖且碱基100%相同的只有EU拟6119. 1。二、病菌的PCR过程(以水稻来进行说明)DNA的提取按常规方法对疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株提取基因组DNA。用上述设计的引物对对提取的疑似感染大孢指疫霉菌的水稻植株总DNA进行扩增，预计扩增片段约为42!3bp。PCR 扩增体系 05 μ 1) :DNA 扩增模板 IylUOXPCR Buffer 2·5μ1、 dNTPs (IOmm) 0· 5 μ 1、Taq 酶(2· 5 μ / μ 1) 0· 5 μ 1、Forward Primer (IOmm) 1 μ 1、Reverse Primer(IOmm) 1 μ dd H2O 18. 5 μ 1。扩增条件预变性94°C 5min ；循环参数:94 V 30sec ；56°C 40sec ；72°C 40sec ；共 30个循环；72 °C IOmin延伸。三、PCR扩增产物的鉴定扩增产物经常规电泳并用凝胶成像系统检查，结果出现的条带与预期的大小相符，见图3。PCR产物送由宝生物工程(大连)有限公司测序，测序结果经BLAST，只找到作为引物设计基础的EU826119. 1，见图4。本文中提及的PCR技术包含从PCR衍生的所有技术，如实时荧光PCR。与现有技术相比，本发明的优点是本方法使用的一对引物是根据大孢指疫霉菌 HUH 892菌系核糖体大亚基RNA基因设计的，使用此对引物做PCR检测时，可检测到禾本科植物上的大孢指疫霉菌，从而在水稻霜霉病和玉米疯顶病发病早期将大孢指疫霉菌与它种病因区分开来，及早防治水稻霜霉病和玉米疯顶病，本发明的引物对特异性高。
图1是本发明正向引物的BLAST结果。图2是本发明反向引物的BLAST结果。图3是水稻植株PCR初步检测电泳结果。从左至右的4条泳道依次是marker，疑似病株，检测到卵孢子的病株，健康水稻。图4是水稻霜霉病PCR产物序列BLAST。图5是不同县市水稻病株PCR检测电泳结果。图中，从左至右各泳道依次为隆回、邵阳、江永、会同、邵东、健康对照、marker、新邵、炎陵、双峰、安化1、安化2、洪江1、洪江2。图6是起初未镜检到卵孢子但PCR阳性的新邵县水稻植株，后镜检到卵孢子。图7是玉米PCR检测电泳结果。图中，从左至右各泳道分别为第1道为阴性对照1(未加DNA模板)；第2道为阴性对照2(健康玉米)；第3-5道为玉米病株；第6道为阴性对照3(水稻健株)；第7道为阳性对照(水稻病株)；第8道为marker。
图8是用1个水稻霜霉菌系PCR产物序列做BLAST的结果，显示了 8个PCR产物碱基序列递交到GenBank后得到的登录号。图中“strain”表示菌系，7个水稻霜霉菌系名最后2个字母是SD，1个玉米疯顶菌系名最后2个字母是YM。菌系HUH892为德国报告的大孢指疫霉菌菌系。
具体实施例方式实施例一水稻霜霉病株检测用本发明的引物对对采自隆回、邵阳、江永、会同、邵东、新邵、炎陵、双峰、安化、洪江的疑似感染水稻霜霉病的水稻植株做PCR检测。电泳结果见图5。结果表明病株均呈阳性，而健康对照为阴性。对其中未检测到卵孢子且栽植成活的新邵县病株每隔5天镜检一次，在病株心叶变黄白色时镜检到卵孢子，见图6。选取上述PCR产物中7个电泳斑点较亮的PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司测序，序列递交 NCBI/GenBank，得到登录号(HQ641401. 1，HQ641399. 1，HQ641402. 1， HQ641395. 1，HQ641398. 1，HQ641397. 1，HQ641394. 1)。图 8 显示用 HQ641401. 1 做 BLAST 得到的结果，证明上述登录号的存在。实施例二玉米疯顶病株检测用本发明的引物对对采自湖南辰溪县经镜检确认感染疯顶病的玉米植株做了 PCR 检测。电泳结果见图7。结果表明，3个玉米病株标本和阳性对照(水稻病株)均呈阳性， 而3个阴性对照均为阴性。其中1个玉米疯顶PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司测序，序列递交NCBI/GenBank，得到登录号HQ641400. 1，见图8。图8显示用1个水稻霜霉PCR产物做BLAST得到的序列排在前面的都是找到本专利引物PCR产物的序列和作为模板的德国大孢指疫霉菌序列，证明了 PCR产物与模板序列高度一致，证明实施例一和实施例二的PCR产物全为大孢指疫霉菌。由以上实施例可知，本发明的该对特异性引物对大孢指疫霉菌是特异的，采用该引物对大孢指疫霉菌引起的病害作PCR，可得到准确可靠的结果。
权利要求
1.一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其特征在于该方法是以大孢指疫霉菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定，该特异性引物为正向引物5 ’ -AGAATGCAGCGCTAAGC-3 ’， 反向引物5’ -ATGCGCATCCACTCAGC-3，。
2.如权利要求1所述的特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌的PCR方法，其特征在于所述特异性引物是根据大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖体大亚基RNA基因(GenBank EU826119. 1共846个碱基)的核苷酸序列设计的，PCR产物大小为423个碱基。
全文摘要
一种特异性检测禾本科植物上大孢指疫霉菌(Sclerophthora macrospora)的PCR方法，是根据大孢指疫霉菌HUH 892菌系核糖体大亚基RNA基因(GenBankEU826119.1共846个碱基)的核苷酸序列设计的一对引物，BLAST结果表明这对引物的特异性非常好。用这对引物做PCR检测时可准确地将禾本科植物上的大孢指疫霉菌检测出来，从而及早防治水稻霜霉病。
文档编号C12Q1/68GK102559900SQ20121001500
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者夏花, 高必达 申请人:湖南农业大学