专利名称：一种青蟹眼柄rna的提取方法
技术领域：
本发明属于RNA的提取领域，特别涉及一种青蟹眼柄RNA的提取方法。
背景技术：
青蟹为中国及东南亚沿海重要的甲壳类海产品，我国年产量在10万吨以上，居海水蟹之首。然而，其生长及繁殖方面还存在大量相关的科学问题亟需研究，尤其是其眼柄中 X-腺窦复合体内特异表达与生长繁殖相关的多肽基因家族，因此青蟹眼柄RNA的提取是研究这些基因家族的首要问题。青蟹的RNA的提取通常采用Trizol试剂进行，然而用普通 Trizol试剂盒提取其眼柄处RNA时，在进行沉淀RNA的步骤会析出大量乳白色沉淀，影响提取过程中RNA的正常沉淀，使得最后提取得到的RNA质量、数量不稳定，无法确保得到高质量的RNA，从而使得后续的分子生物学实验难以顺利进行。Trizol试剂盒提取RNA过程中主要步骤1)由于眼柄RNA易被实验环境RNA酶污染，因此眼柄组织制备需要采用整只眼柄在液氮中研磨完成；2)眼柄组织加入RNAiso Plus试剂后静置离心取上清液；幻上清液加入1/5体积氯仿混合静置离心，此时得到三层相水相，蛋白相，氯仿相，吸取水相，其余弃掉；4)水相中加入等体积异丙醇静置离心沉淀；5)沉淀用乙醇清洗后烘干，溶于少量DEPC水中。其中在步骤幻中的水相中含有在步骤 4)中的乳白色沉淀。根据其在水中有较高的溶解度，加入异丙醇后溶解度下降，并且是在蟹眼柄组织中存在，推测可能是眼柄处甲壳内的甲壳素在RNAiso Plus作用下产生的多糖类物质。这类物质在加入异丙醇后溶解度降低，因此以乳白色沉淀形式大量析出，影响RNA提取。同时，青蟹眼柄处RNA极易被周围环境中RNA酶分解，在常温中沉淀RNA，即使在通风橱中完成实验。获得的提取物在电泳时依然经常得到高质量的RNA。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种青蟹眼柄RNA的提取方法，该方法消除沉淀RNA过程中析出的大量乳白色沉淀，得到高质量的RNA，从而克服常规方法提取青蟹眼柄 RNA质量不能保证的问题。本发明的一种青蟹眼柄RNA的提取方法，包括(1)在液氮中将青蟹标本的眼柄组织研磨成粉末，取部分加入RNAiso Plus试剂后室温静置离心，取上清液；(2)在上述上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，混勻，室温静置离心，获得水相、 蛋白相和氯仿相，取水相；(3)在上述水相中加入1/3水相体积的醋酸钾溶液，室温离心、静置；加入等体积的异丙醇，混勻，_70°C静置、室温离心，弃上清液保留沉淀；(4)在上述沉淀中加入乙醇，室温离心，弃上清液保留沉淀；干燥，用DEPC水溶解沉淀，得青蟹眼柄RNA。
所述步骤(1)中的RNAiso Plus试剂的加入量为600 μ 1。所述步骤(3)中的醋酸钾溶液浓度为5mol/L，用醋酸调节pH至6. 0。所述步骤(4)中的乙醇浓度为75V01%。所述步骤(4)中的DEPC水的加入量为20 μ 1。高浓度盐溶液可增高多糖类物质的溶解度，避免加入异丙醇后多糖类物质的沉淀影响RNA提取。因此在本发明中，配置5mol/L醋酸钾溶液，并使用醋酸调pH = 6. 0作为增溶剂。加入1/3水相体积的醋酸钾溶液，4°C，5000g离心1分钟并静置5分钟，该步骤能有效阻止加入异丙醇后大量乳白色沉淀的析出，仅析出少量半透明状沉淀。在沉淀RNA时，由于_70°C下RNA酶活性远低于常温，为避免在设备中可能存在的微量RNA酶对实验造成的影响，本发明在-70°C冰柜中沉淀。通过本发明的改进方案提取的RNA，无论是电泳，紫外线分光光度仪以及逆转录 PCR对比的结果，均显示该发明能够从青蟹眼柄中提取质量较好的RNA。有益效果本发明从难以提取的青蟹眼柄组织中提取出RNA，消除沉淀RNA过程中析出的大量乳白色沉淀，得到高质量的RNA，从而克服常规方法提取青蟹眼柄RNA质量不能保证的问题，支持青蟹眼柄X-腺窦复合体中相关多肽基因的研究，同时对其他甲壳类生物眼柄组织提取RNA提供了启示，具有良好的应用前景。
图1为获得的产物在琼脂糖电泳后得到的条带，从左到右分别是分子量Marker， 常规Trizol法获取产物，本发明的方法获取的产物；图2为获得产物的DEPC水溶液在紫外线分光光度仪下的检测结果图表，每一种产物分别检测三次，A表示常规Trizol法，B表示本发明的方法；图3为常规Trizol法与本发明方法获得的产物通过逆转录及通过PCR扩增管家基因的结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1取青蟹中最常见的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)进行操作。1)采用手术剪剪取一只拟穴青蟹眼柄标本，在液氮中将眼柄组织研磨成粉末状；2) 一半眼柄组织加入装有600 μ 1 Takara RNAiso Plus的1. 5ml离心管中室温静置5分钟；3)离心管4°C，12000g离心5分钟，上清液转移至新1. 5ml离心管；4)加入1/5上清液体积的氯仿，震荡混勻，室温静置5分钟；5)离心管4°C，12000g离心15分钟，获得三层相水相，蛋白相，氯仿相，取上层水相加入新的离心管中；
6)水相中加入1/3体积的5Mol/L醋酸钾(pH = 6. 0，用醋酸调节)溶液，4°C， 5000g离心1分钟，室温静置5分钟；7)加入与离心管中液体等体积异丙醇，震荡混勻，-70°C静置20分钟；8)离心管4°C，12000g离心10分钟，弃上清液保留沉淀；9)离心管中加入75%乙醇lml，4°C，5000g离心3分钟，弃上清液保留沉淀；10)干燥沉淀，用20 μ 1 DEPC水溶解；11)通过1. 5%琼脂糖-TEB凝胶电泳观察相关条带，并验证提取产物是否为RNA。通过图1可以看到本发明所得结果有明显rRNA的条带，而常规Trizol法基本无明显的rRNA条带。12)通过DU 800分光光度仪检验溶液产物是否为RNA。通过图2可以看到，320nm 下的结果显示本发明的方法获得的RNA其值小于常规Trizol法获取的RNA，说明本发明方法获得的水溶液浑浊度小于常规iTrizol法；RatiO260nm/280nm的检测结果中，本发明方法获取的RNA测量值平均数1. 913，在1. 8-2. 0间，说明获得的产物为较为纯净的核酸，而常规 Trizol法获取的RNA其测量平均值为1. 381，说明获得产物存在其他杂质的污染。13)通过One Step RNA PCR Kit ver 3. O试剂盒，及根据拟穴青蟹管家基因 Ubiquitin conjugating enzyme E2及Beta-actin设计的引物进行逆转录及扩增，引物序列为见表1 :表1拟穴青蟹两个看家基因的RT-PCR扩增反应所用引物序列
权利要求
1.一种青蟹眼柄RNA的提取方法，包括(1)在液氮中将青蟹标本的眼柄组织研磨成粉末，取部分加入RNAisoPlus试剂后室温静置离心，取上清液；(2)在上述上清液中加入1/5上清液体积的氯仿，混勻，室温静置离心，获得水相、蛋白相和氯仿相，取水相；(3)在上述水相中加入1/3水相体积的醋酸钾溶液，室温离心、静置；加入等体积的异丙醇，混勻，-70°C静置、室温离心，弃上清液保留沉淀；(4)在上述沉淀中加入乙醇，室温离心，弃上清液保留沉淀；干燥，用DEPC水溶解沉淀， 得青蟹眼柄RNA。
2.根据权利要求1所述的一种青蟹眼柄RNA的提取方法，其特征在于所述步骤(1)中的RNAiso Plus试剂的加入量为600 μ 1。
3.根据权利要求1所述的一种青蟹眼柄RNA的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中的醋酸钾溶液浓度为5mol/L，用醋酸调节pH至6. O。
4.根据权利要求1所述的一种青蟹眼柄RNA的提取方法，其特征在于所述步骤(4)中的乙醇浓度为75V01%。
5.根据权利要求1所述的一种青蟹眼柄RNA的提取方法，其特征在于所述步骤(4)中的DEPC水的加入量为20 μ 1。
全文摘要
本发明涉及一种青蟹眼柄RNA的提取方法，以RNAiso Plus试剂为基础，通过在提取过程中RNA悬液中加入1/3悬液量5mol/L醋酸钾后快速离心混合再进行沉淀及采用-70℃条件沉淀RNA，经上述改进后能提取出较好满足实验要求的眼柄部位的RNA。本发明从难以提取的青蟹眼柄组织中提取出RNA，消除沉淀RNA过程中析出的大量乳白色沉淀，得到高质量的RNA，从而克服常规方法提取青蟹眼柄RNA质量不能保证的间题，同时对其他甲壳类生物眼柄组织提取RNA提供了启示，具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/10GK102559662SQ20121001695
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者于忠利, 孙曼曼, 张丹, 张凤英, 房娅博, 朱厚泽, 皮妍, 蒋科技, 马凌波 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所