专利名称：产琥珀酸放线杆菌菌株及其筛选和发酵生产丁二酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种琥珀酸放线杆菌菌株的筛选及其应用。
背景技术：
丁二酸，又称琥珀酸(succsinic acid)，是一种常见的天然有机酸，广泛存在于动、植物和微生物体内，是生物进行TCA循环的中间产物之一。它是一种重要的有机合成中间体，主要应用于食品、医药、生物降解塑料、表面活性剂、洗涤剂、和绿色溶剂等领域。此夕卜，丁二酸还可以用作动物饲料添加剂和植物生长刺激剂等方面。目前，丁二酸生产主要是利用化学合成的方法，从丁烷通过顺式丁烯二酐生产琥珀酸，主要由石蜡氧 化法、轻油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氢等方法。以化学方法生产丁二酸，需要消耗大量不可再生的石化原料，生产成本高，环境污染严重，从而限制了琥珀酸的广泛应用。因此，人们开始将目标转向通过生物发酵法来生产琥珀酸。与传统的化学合成法相比，发酵法具有成本低、环境效益好等优点。目前，通过发酵法生产得到的琥珀酸，其价格大约为O. 55 I. I$ /kg。另外,据Bio-amber公司称,琥拍酸具有25亿欧元的市场,且生物法生产琥拍酸能够与石化的方法相竞争，并计划于2011前利用植物作为原料进行工业生产琥珀酸。丁二酸是许多严格厌氧菌和兼性厌氧菌代谢的重要中间产物。目前人们已经发现多种微生物可以通过发酵来生产琥珀酸，其中研究主要集中在大肠杆菌(E. coli)，曼海姆产玻拍酸菌(Mannheimia,产玻拍酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillutnsucciniciproducens)和产玻拍酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes ) 此外,一些乳酸菌、丙酸产生菌及真菌等也可以产生少量丁二酸。在众多的产琥珀酸微生物中，瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌能够利用多种糖类进行发酵，并且可以耐受葡萄糖和琥珀酸的浓度分别高达158 g/L和104 g/L;同时，该菌以其高产量、高耐受性等优势，成为最具发展前景的琥拍酸产生菌之一。国外在琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸研究方面研究较多，其中美国密歇根生物技术研究院(MEI) Zeikus等人课题组处于领先地位。他们在1996年筛选出一株高产丁二酸菌株 130Z (.Actinoabcillus succinogens ATCC 55618),并以 130Z 为出发菌株，筛选出对单氟乙酸抗性的自发突变株。在最适条件下，此抗性株发酵时间48h，发酵产物中的琥珀酸/乙酸比例高达85:1 ;琥珀酸/甲酸比例高达160:1，丁二酸产量可以达到80-110 g/L,得率高达97%,使丁二酸发酵获得了突破性进展(Applied and EnvironmentalMicrobiology. 2005, 71: 6651-6656 -,Int J Syst Bacteriol 1999, 49:207-216)。国内对琥珀酸酸放线杆菌发酵产丁二酸的研究也较多。较早的有天津大学的赵学明等人对购自国外的ATCC55618菌株发酵研究发现其琥珀酸产量在11. 49g/L，并有乳酸等副产物存在，对该菌株诱变后产量亦无显著高。近期，江南大学的孙志浩等人，筛选出菌株Actinobacillus succinogens CGMCC1593,对其诱变选育后，SF-9 在 5L 发酵耀上发酵 36h琥珀酸产量达40. 51g/L，但仍然存在乳酸、甲酸和乙酸等副产物。南京工业大学姜岷等通过对筛选得到的玻拍酸放线杆菌jcii/ oAaci77w5· succinogenes NJl 13 (CGMCCNO. 1716)进行改造和发酵条件优化，丁二酸的产量可达的52 g/L。中国专利文献琥珀酸放线杆菌菌种改组、选育方法以及用其发酵生产丁二酸的方法，申请号CN200810146688，申请日2008-09_05，发明人孙志浩；倪晔；郑璞；董晋军；专利权人江南大学。该发明涉及一株具有较强钠离子耐受性和产酸性能的琥珀酸放线杆菌 Actinobacillus succinogenes CGMCC 2653 (即 F3-10),该菌株的选育方法及用其发酵生产丁二酸的方法。以琥珀酸放线杆菌CGMCC 1593作为出发菌株，分别对其进行X-射线、紫外线诱变和硫酸二乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)化学诱变，筛选得到具有改良的发酵产酸性能，特别是钠离子耐受性有改良三株菌株X-8、UV-17、SE-6，和具有氟乙酸抗性的高产菌株SF-9，将它们用基因组改组方法选育得到高产、耐钠、抗氟乙酸的菌株F3-10。该菌株F3-10以甘蔗糖蜜为原料，采用Na2C03控制发酵pH，在5L发酵罐中进行补料分批发酵，48h产丁二酸53. 96g/L，对消耗糖产率89. 2 %，糖利用率94. O %，丁二酸比杂酸为6.58 1，较出发菌CGMCC1593有显著提高。
综上所述，目前由于国外的技术封锁，国外的菌种难以获得，即使购买到国外菌种，也会由于具体技术条件难以得知，产量也不高，根本达不到文献报道的产量；国内丁二酸菌株生产方面与国外还有一定的差距，目前国内最高产的也就是50 g/L左右的丁二酸。因此，筛选丁二酸更高产的微生物菌株和研究出一种能够生产更高浓度丁二酸的方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的就是国内生产丁二酸菌株产量不高的现状，提供一种丁二酸产量能达到70 g/L的琥珀酸放线杆菌，以及其筛选和生产丁二酸的方法。本发明是这样实现的
一株产琥拍酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes菌株，分类属巴斯德菌科(pasteureIIaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产玻拍酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes) GXAS-137，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学邮编430072，保藏时间保存编号为CCTCC N0:M2011399，保藏时间为2011年11月18日，并于2011年11月25日检测结果为存活。
以上所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，根据产丁二酸菌株能够利用富马酸产生丁二酸的特点，设计以富马酸钠为唯一碳源富集培养基和选择平板，此外通过添加莫能菌素可有效抑制产乳酸菌和产甲烷菌等杂菌生长，在筛选平板中添加适量的丁二酸钠，可以抑制提高筛选菌株对丁二酸的耐受性，可以有效筛选产琥珀酸放线杆菌菌株，具体步骤如下
(1)将新鲜牛的瘤胃内容物悬浮于适量生理盐水中，用无菌纱布过滤去除粗纤维等固体物质；
(2)将过滤得到的悬浮液接种于^50-150ml富集培养基的250ml三角瓶中，30_37°C厌氧箱中培养16_30h ;所述的富集培养基为含有富马酸盐作为唯一碳源并添加氮源、无机盐和莫能菌素的培养基，详细配方如下富马酸钠10_30g/L，酵母粉5-20g/L，蛋白胨5-20g/L, K2HP04l-5g/L, CaCl2O. 1-lg/L，NaCl O. 5_2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2g/L，MgCl2O. l_lg/L，莫能菌素O. 1-0. 2g/L，将前述原料混匀即可得到富集培养基。(3)转接2次后，培养物按照梯度稀释后，涂布在筛选培养基的平板上，于厌氧箱培养30-48h,挑选菌落较大菌株于发酵培养基中，培养结束后，HPLC测定每个样品丁二酸含量，选取丁二酸产量浓度大于10g/L菌株进行复筛，选取复筛后丁二酸产量高、副产物少的菌株，即可得到权利要求I所述的产琥珀放线杆菌菌株。所述的筛选培养基为在富集培养基基础上添加30-100 g/L 丁二酸钠，平板培养时加入15-20 g/L琼脂粉。将经过上述筛选到的菌株(在此命名为GXAS137)进行16S rDNA基因序列测定和生理生化鉴定，结果如下
1.经过对GXAS137菌株的16SrDNA (附图I)基因序列比对，与Actinobacillussuccinogenes 130Z的序列同源性最高,为94%。具体DNA基因序列为
0001 ATTGAAGAGT TTGATCATGA CTCAGATTGA CGATAACGAG TGAAAAGCTT GCTATCCATG 0061 CTGAAGAGTG GCGAACGAGT GAGTAATGCT TGAGAATCTG GCTTATGAAG GAGAATAACG0121 AAGAGAAAAT GTCGCTAATA CCGCGATGTC TAAGAACTAA AGAGTGAGAT TATCGAACCG0181 CCCGCCATAA GATGAGCCCA AGTGAGATTA GATAGTTGAT GAGATAAAGA AGCCCAAGTG0241 GAATTAGATA GTTGATGAGA TAAAGAACTA CCAAGCCGAA GATCTCTAGC TGATCTGAGA0301 GAATGAACAG CCAAAATGAA AATGAGAAAA GATCCAGAAT CCTAAGAGAG GCAGCAGTGA0361 GAAGAAGCAA CGAATAACTC CGTGCCAGCA GCCGCGATAA TAAGAAGAGT GCGAGCGTTA0421 TTCCCGAGCC AAGTTCTTTC TTGTAAAAAA AAGAAGAATA AGTTAACAGC TATGATTCAT0481 GAAGTTAGCC AAAGAAGAAG CAACGAATAA CTCCGTGCCA GCAGCCGCGA TAATAAGAAG0541 GATGCGAGCG TTAATCGAAA TAACTGAGCG TAAAGAGCAA GCAGAAGAAT ATATAAGTGA0601 ATCGAAATAA CTGAGCGTAA AGAGCAAGCA GAAGAATGAA TGAGATCAAG GAATTCGTAA0661 TGAGTTGTAA GTAGAATTCC AAGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGAAATAAC0721 GAAGAAGAAG GCAGCCCCTT GAGAACGTAA TGAAGCTCAT GTGCGAAAGC GTGAGAAGCA0781 AACATGAGAG GATAACCTGA TAGTCCAAGC TGTAAAAGCT GTCGATATGA GAATTGAGCG0841 ATAAGCCTGA TGCCCGAAGC TAACGTGATA AATCGAACGC CTGAGAAGTA CGAACGCAAG0901 GTTAAAACTC AAATGAATTG AAGAGAGCCC CATAACAAGA TGAAGCATGT GATATAATTC0961 GATGCAACGC GAAGAACCTT AACTAATCTT GAAATCCTCA GAATCCGATA GAGATATCGA1021 AGTGCCTTCG GAAAATGAGA GAAAGATGCT GCATGAATGT CGTCAGCTCG TGTTGTGAAA1081 TGTTGAGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTATCCTT TGTTGCCAGC ATGTAGAGAT1141 GAGAACTCAA AGAAGAATGC CGATGATAAA CCGAAGAAAG GTGAGAATGA CGTCAAGTCA1201 TCATGAACCT TAAGAGTAGA GCTAAAAAAG TGCTAAAATG GCGTATAAAG AGAGAAAAGA1261 ATGAGAACTC AAAGAAGAAT GCCGATGATA AACCGAAGAA AGATGAGAAT GAAGTCAAGT1321 CATCATGAAC CTTAAGAGTA GAGCTAAAAA CGTGCTAAAA TGAAGTATAA AGAGAGAAAA1381 GAGCCTGCGA GAGAGAGTGA ATCTCAGAAA GTGCGTCGTA GTCCGAATTG GAGTCTGCAA1441 ATCGAATCCA TGAAGTCGAA ATCGCTAGTA ATCGCGAATC AGCATGTCGC AGTTCTATCG1501 ATGATGAGAA AGAAGAATGT TAACAGCTTA TTCGATTGAA GTTAGCCAAA
2.GXAS137菌株为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，细胞成杆状或球杆状，不运动，无芽孢，也不产生孢子。生长温度为20-40 °C，最适35-38°C，生长pH4. 5-8. 0，最适6. 5-7. 5。3. GXAS137菌株可以发酵以下底物产酸葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，D-木糖，乳糖，果糖，甘露糖，D-阿拉伯糖，甘露醇，D-山梨醇等糖类或醇类，以及糖质原料如甘蔗汁、甜菜汁、糖蜜等和淀粉质及纤维素原料的水解液。4. GXAS137菌株的代谢产物该菌代谢产物以丁二酸为主，其他副产物由乙酸、甲
酸、乳酸、丙酮酸、苹果酸和富马酸。当提供较高CO2时，菌体生产较快，丁二酸快速积累，其他副产物较少。由以上16S rDNA基因序列测定和生理生化特性结果，可以认定GXAS-137菌株属于巴斯德菌科(pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产琥拍酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes),现已保藏于中国典型培养物保藏中心,保存编号为CCTCC N0:M2011399，保藏时间为2011年11月18日，并于2011年11月25日检测结果为存活。
运用以上所述产琥珀放线杆菌菌株发酵产丁二酸的方法将产琥珀放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38°C静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节PH在6. 0-7. O,并在30-38°C发酵24_120h，即可得到丁二酸，所述的调节PH用的是碳酸盐、氨水、NaOH，所述的碳酸盐为碱式碳酸镁，所述的发酵条件为有氧或通入N2或CO2。优选方案为碱式碳酸镁调节pH，通入CO2 ;如采用氨水、NaOH等碱性调节，必须通入CO2。以上所述的种子培养基的成分及其浓度为糖类10-20 g/L，酵母粉5-10 g/L，蛋白胨 5-10 g/L, K2HPO4 1-5 g/L, CaCl2 O. 5-1 g/L，NaCl O. 5-2 g/L，(NH4)2SO4 0.5-2 g/L,MgCl2 0.5-1 g/L，碱式碳酸镁 10-20 g/L。以上所述的发酵培养基的成分及其浓度为糖类40-100 g/L，氮源10-40 g/L,K2HPO4 1-5 g/L，CaCl2 O. 5-1 g/L，NaCl O. 5-2 g/L, (NH4)2SO4 0.5-2 g/L, MgCl2 0.5-1 g/L0以上所述的糖类包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖；木薯、玉米、甘薯淀粉质原料水解释放出的糖；纤维素的水解物中的一种或多种的组合。以上所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。本发明的优点和有益效果
(I)本发明采用添加中间代谢物富集和产物抑制，筛选到一株丁二酸产量可达70 g/L菌株CCTCC M 2011399 (GXAS137)，具有工业化生产的潜力。(2)该菌株还可以发酵木糖产生丁二酸，因此，可以充分利用自然界中丰富的纤维素资源，保证原料廉价、可持续供应，可以解决丁二酸化学合成的化石资源紧张，污染环境的问题。(3)该菌株可以采用木薯、玉米粉或纤维素等可再生生物质原料，是一种利用可再生原料的生产方法，可缓解化学合成丁二酸的石化资源紧张问题，对环境友好，而且这些原料中还含有一些可供微生物利用的氮源、维生素等其他营养成份，可显著提高丁二酸产量和降低生产成本。
图I产琥珀酸放线杆菌CCTCC M 2011399电镜照片。
具体实施例方式以下是琥珀 酸放线杆菌菌株CCTCC M 20113997筛选、鉴定及发酵生产丁二酸的具体实施实例。但对本发明没有限制。
实施例I
琥珀酸放线杆菌菌株的筛选与鉴定
I、富集培养基的制备含有富马酸盐为唯一碳源并添加氮源、无机盐和莫能菌素的培养基。详细配方如下(g/L):富马酸钠10-30，酵母粉5-20，蛋白胨5-20，K2HPO4 1-5，CaCl2O. 1-1，NaCl O. 5-2，(NH4)2SO4 O. 5-2, MgCl2 O. 1-1，莫能菌素 O. 1-0. 2，将前述原料混匀即可得到富集培养基。经试验验证，前述富集培养基原料配方内的任一浓度组合制备的富集培养基均可筛选出本发明的GXAS137菌株。2.、平板筛选培养基的制备在富集培养基的基础上添加丁二酸钠和琼脂粉。详细配方如下(g/L):富马酸钠 10-30，酵母粉 5-20，蛋白胨 5-20，K2HPO4 1-5, CaCl2 O. 1-1，NaClO. 5-2，(NH4)2SO4 O. 5-2，MgCl2 O. 1-1，丁二酸钠 30-100，琼脂粉 15-20，将前述原料混匀即可得到筛选培养基。经试验验证，前述筛选培养基原料配方内的任一浓度组合制备的筛选培养基均可筛选出本发明的GXAS137菌株。3.、琥珀酸放线杆菌菌株的筛选
(1)从南宁市某肉联厂新鲜牛胃中采样，将新鲜牛的瘤胃内容物悬浮于适量生理盐水中，用无菌纱布过滤去除粗纤维等固体物质；
(2)将过滤得到的悬浮液接种于含50-150ml制备好的富集培养基的250ml三角瓶中，37°C厌氧箱中培养(若无厌氧箱也可用血清瓶代替三角瓶)24h，厌氧箱通入N2:C02:H2=85 10 5的混合气。(3)按5%接种量转接2次后，，培养物按照梯度稀释后，涂布在分离培养基的平板上，厌氧箱培养30-48h，挑选菌落较大菌株于装有发酵培养基的试管中发酵，培养结束后；
(4)HPLC测定每个样品丁二酸含量，选出产丁二酸菌株357株，经过进一步三角瓶放大发酵复筛，筛选出18株丁二酸产量较高菌株，其中一株GXAS137遗传稳定性好(详见表I),丁二酸产量高，副产物较少，将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCCM 2011399。HPLC 测定戴安 Utimat3000，自动进样器，色谱柱AminexHPX_87H 300X7. 8mm,流动性5 mmol/LH2S04, pH2. 5，柱温45°C，进样量10uL，流速O. 6mL/min,紫外检测器波长210nmo表I复筛后产丁二酸较高的菌株产酸及副产物情况
权利要求
1.一种发酵产丁ニ酸的微生物菌株，其分类属巴斯德菌科(pasteurellaceae)放线杆菌属(Actinobacillus)的产玻拍酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes) GXAS-137,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为CCTCC M 2011399。
2.—种权利要求I所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，其特征在于将新鲜牛的瘤胃内容物悬浮于适量生理盐水中，用无菌纱布过滤去除固体物质，将过滤得到的悬浮液接种于富集培养基中，30-37°C厌氧培养16-30h，转接2次后，培养物按照梯度稀释后，涂布在含筛选培养基的平板上，厌氧培养30-48h,挑选菌落较大菌株于发酵培养基中，培养结束后，HPLC測定每个样品丁ニ酸含量，选取丁ニ酸浓度大于10g/L菌株进行复筛，选取复筛后丁ニ酸产量高、副产物少的菌株，即可得到权利要求I所述的产琥珀酸放线杆菌菌株。
3.根据权利要求2所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，其特征在于所述的富集培养基为含有富马酸盐作为唯一碳源并添加氮源、无机盐和莫能菌素的培养基，详细配方如下富马酸钠 10-30g/L，酵母粉 5-20g/L，蛋白胨 5-20g/L，K2HP04l-5g/L，CaCl20. I-Ig/L，NaCl O. 5-2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2gL，MgCl2O. 1-lg/L，莫能菌素 O. 1-0. 2g/L，将前述原料混匀即可得到富集培养基。
4.根据权利要求2所述的产琥珀酸放线杆菌菌株的筛选方法，其特征在于所述的筛选培养基为在富集培养基基础上添加30-100g/L丁ニ酸钠，平板培养时加入15-20g/L琼脂粉。
5.ー种运用权利要求I所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于将产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38°C静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节pH在6. 0-7. 0，并在30_38°C发酵24-70h，即可产生丁ニ酸，所述的pH调节剂是碳酸盐、氨水、NaOH,所述的碳酸盐为碱式碳酸镁，所述发酵的条件为有氧或通入N2或C02。
6.根据权利要求5所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于所述的种子培养基的成分及其浓度为糖类10_20g/L，酵母粉5-10g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HP04l-5g/L, CaCl2O. 5-lg/L，NaCl O. 5_2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2g/L，MgCl2O. 5-lg/L，碱式碳酸镁 10-20g/L。
7.根据权利要求6所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分及其浓度为糖类40-100g/L，氮源10-40g/L，K2HP04l_5g/L，CaCl2O. 5-lg/L, NaCl O. 5_2g/L，(NH4)2SO4O. 5_2g/L，MgCl2O. 5-lg/L。
8.根据权利要求6或7所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于所述的糖类包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖，甘蔗、甜菜、糖蜜中所含的糖；木薯、玉米、甘薯淀粉质原料水解释放出的糖；纤维素的水解物中的一种或多种的组ムロ ο
9.根据权利要求6或7所述产琥珀酸放线杆菌菌株发酵生产丁ニ酸的方法，其特征在于所述的氮源包括有机氮源和无机氮源；所述的有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆和豆饼粉，所述的无机氮源包括尿素、硫酸铵。
全文摘要
本发明公开了一种产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)GXAS-137，以及其筛选和发酵生产丁二酸的方法，该菌株从牛瘤胃富集、筛选获得，并利用该产琥珀酸放线杆菌菌株接入种子培养基中，在厌氧培养箱或普通培养箱中30-38℃静止培养24-36h，按1-10%的接种量接入发酵培养基中，调节pH在6.0-7.0，并在30-38℃发酵24-120h，即可得到丁二酸。并对不同原料和培养基中进行发酵研究，丁二酸产量能达到70g/L，具有工业化生产的潜力。
文档编号C12R1/01GK102851224SQ201210017288
公开日2013年1月2日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者申乃坤, 黄日波, 王青艳, 秦艳, 黎贞崇, 朱婧, 王成华, 廖思明 申请人:广西科学院