专利名称：利用实时荧光pcr技术检测胆囊结石中华支睾吸虫dna的方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的方法。
背景技术：
胆囊结石病是目前全世界范围内最常见的消化系统疾病之一，随着发病率的日趋增加，严重影响人民的健康和生活质量。近年来胆囊结石成因的研究有了较大进展，如乔铁等报道了华支睾吸虫与胆囊结石有密切相关性，但目前对胆囊结石的形成机制仍不十分明了，尚未对华支睾吸虫与胆囊结石形成机制之间的关系进行DNA水平上的研究。
发明内容
针对以上要解决的技术问题，本发明的目的在于提供一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的方法，从而为探讨华支睾吸虫卵与胆囊结石形成机制的关系提供新的角度和方向。为了达到上述技术目的，本发明是通过以下技术方案实现的:本发明所述的利用实时荧光PCR技术检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的方法，其具体步骤包括:I)胆囊结石预处理；2)提取胆囊结石中的DNA ；3)设计并合成特异性引物及探针:根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，设计并合成如下特异性的引物及探针:正向引物序列:5'-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'；反向引物序列:5'-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'；探针序列:5' - (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3'；将以上引物及探针配制成浓度为1(^11的储存液，-201:保存；4)实时荧光PCR反应。根据本发明提供的检测方法，所述步骤I)中，胆囊结石预处理的具体步骤如下:A)将胆囊结石用蒸馏水冲洗至少2次，然后置于60°C烘箱中12小时烘干；B)取步骤A)中烘干后的胆囊结石10毫克，液氮冷冻30分钟后取出，再向胆囊结石中加入500 μ I生理盐水，冰上研磨充分后，12000rpm离心10分钟，弃上清保留胆囊结石沉渣；C)向所述胆囊结石沉渣中加入I毫升80v/v%乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣；
D)重复步骤C);E)向步骤D)所得的胆囊结石沉渣中加入I毫升生理盐水，12000rpm离心10分钟，弃上清,保留沉洛。根据本发明提供的检测方法，所述步骤2)中提取胆囊结石中的DNA的具体步骤为:使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取胆石DNA，再用100 μ I AE溶液溶解所提取的DNA，-20°C保存。根据本发明提供的检测方法，所述步骤4)中实时荧光PCR反应的具体步骤如下:a)在冰上配制PCR反应体系，依次加入以下试剂:Premix Ex Taq 25 μ 1、正向引物溶液 μ 1、反向引物溶液 μ 1、探针溶液 μ 1、rox液 μ 1、结石dna 2 μ 1，然后再加蒸懼水至总体积为50 μ I ;
b)设置PCR反应条件:第一步95°C预变性30秒，第二步95°C变性15秒，60°C退火延伸31秒，共计45个循环。与现有技术相比，本发明通过实时荧光PCR技术，能够高效地提取胆囊结石中华支辜吸虫的DNA,并且无需电泳，可以节省检测时间，灵敏度闻，并有效避免有毒物质(如EB)的污染，为探讨华支睾吸虫卵与胆囊结石形成机制的关系提供了新的研究角度和方向。
图1是对华支睾吸虫、弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫、蛔虫的DNA及阴性对照的实时荧光PCR特异性分析结果比较。图2是本发明实时荧光PCR灵敏度检测结果。图3是Ct值与华支睾吸虫DNAlO倍浓度梯度稀释的相关性分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。实施例1胆囊结石的获取喉罩全身麻醉，迷你腹腔镜直视右肋缘下小切口抓取胆囊，胆囊底部微小切口(< 6mm)，使用三通道硬质胆道镜(CHiAO，桥牌)探查胆囊、取石，选取直径大于5mm的结石，用套石网取出；对于直径小于5mm的结石以及泥沙样结石，用胆囊小结石吸取箱(CHiAO，桥牌)取出。 实施例2胆囊结石DNA的提取将以上手术获得的胆囊结石经蒸馏水冲洗至少2次，置于60°C烘箱内12小时烘干。称取IOmg胆囊结石标本置2.0ml Ep管中，液氮冷冻30分钟后取出，将结石标本置研钵内，加500 μ I生理盐水，冰上研磨充分后转移至2.0ml Ep管中，12000rpm离心10分钟，弃上清保留胆石沉渣。然后加Iml 80v/v%乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，重复一次(抽提部分胆红素及胆固醇)。最后再加Iml生理盐水，12000rpm离心10分钟,弃上清,保留沉洛。按照DNeasy Blood &Tissue Kit (QIAGEN)说明书操作步骤提取胆石DNA。最后用100 μ I AE溶液(QIAGEN)溶解DNA，-20°C保存。实施例3设计并合成实时荧光PCR引物、探针根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列(Genebank:FJ965388.1)，应用Beacon Designer_v7.51软件设计特异性的引物及TaqMan探针，将筛选出的引物探针组合提交NCBI 网站(http://www.ncb1.nl rn.nih.gov/blast/Blast.cgi)与其他物种基因序列进行Blast比对，保证引物、探针的高度特异性，最终确认选取的探针5’端标记荧光报告基团J0E，3’端标记荧光淬灭基团BHQ-1。正反向引物以及探针的碱基序列如下:正向引物序列:5'-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'反向引物序列:5'-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'探针序列:5'- (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3'将合成的引物、探针配制成浓度为10 μ M的储存液，_20°C保存。实施例4实时荧光PCR反应体系及条件的建立实时荧光PCR反应体系如下:在生物安全柜内，冰上配置PCR反应体系。向PCR反应管中依次加入以下试剂:Premix Ex Taq (Takara) 25 μ 1、正向引物I μ I (10 μ Μ)、反向引物 I μ I (10 μ Μ)、探针 I μ I (10 μ Μ)、R0X 液(Takara) I μ 1、胆石 DNA 2 μ I,然后再加灭菌超纯水至总体积为50 μ I。同时以华支睾吸虫成虫DNA做阳性对照，以蒸馏水做阴性对照。实时荧光PCR反应条件如下:第一步95°C预变性30秒；第二步95°C变性15秒，60°C退火延伸31秒，共计45个循环。实时荧光PCR仪优选为ABI7300实时荧光PCR仪(USA)。
实施例5实时荧光PCR检测体系的灵敏度及特异性分析1.特异性分析分别对华支睾吸虫、弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫和蛔虫的成虫DNA用本实验建立的实时荧光PCR检测方法在相同反应条件下进行PCR扩增，以确定其检测特异性。结果显示，应用该实验所设计的华支睾吸虫特异性引物、TaqMan探针，建立的华支睾吸虫实时荧光PCR检测方法，能特异性地检测到华支睾吸虫DNA，而对弓形虫、日本血吸虫、广州管圆线虫、蛔虫的DNA及阴性对照均未有特异性扩增出现。结果如图1所示。图中，曲线1:华支睾吸虫，曲线2:弓形虫，曲线3:日本血吸虫，曲线4:广州管圆线虫，曲线5:蛔虫，曲线6:蒸馏水(即阴性对照)。2.灵敏度分析应用本发明所建立的华支睾吸虫实时荧光PCR检测方法，分别对不同浓度梯度的华支睾吸虫成虫DNA在相同条件下进行实时荧光PCR扩增，以确定其检测阈值。结果显示，本实验建立的华支睾吸虫实时荧光PCR检测方法，对华支睾吸虫DNA的最低检测阈值可达到0.1pg,检测灵敏度高，并且荧光信号强度与华支睾吸虫DNA浓度成线性相关(R2 > 0.99)，如图2、3所示。图2中，曲线1:10ng、曲线2:ln g、曲线3:lOOpg、曲线4:10pg、曲线5:lp g、曲线6:0.1p g、曲线7:蒸懼水(阴性对照)。图3为Ct值与华支睾吸虫DNAlO倍浓度梯度稀释的相关性分析，其中X轴为DNA浓度的负对数，Y轴为Ct值。
权利要求
1.一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)胆囊结石预处理； 2)提取胆囊结石中的DNA； 3)设计并合成特异性引物及探针:根据华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因序列，设计并合成如下特异性的引物及探针: 正向引物序列-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'； 反向引物序列-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'；探针序列:5' - (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3;； 将以上引物及探针配制成浓度为10 μ M的储存液，-20°C保存； 4)实时荧光PCR反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤I)中，胆囊结石预处理的具体步骤如下: A)将胆囊结石用蒸馏水冲洗至少2次，然后置于60°C烘箱中12小时烘干； B)取步骤A)中烘干后的胆囊结石10毫克，液氮冷冻30分钟后取出，再向胆囊结石中加入500 μ I生理盐水，冰上研磨充分后，12000rpm离心10分钟，弃上清保留胆囊结石沉渣； C)向所述胆囊结石沉渣中加入I毫升80v/v%乙醇，混匀后静置5分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，保留沉渣； D)重复步骤C); E)向步骤D)所得的胆囊结石沉洛中加入I毫升生理盐水，12000rpm离心10分钟,弃上清，保留沉渣。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中提取胆囊结石中的DNA的具体步骤为:使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取胆石DNA，再用100 μ I AE溶液溶解所提取的DNA，-20°C保存。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤4)中实时荧光PCR反应的具体步骤如下: a)在冰上配制PCR反应体系，依次加入以下试剂:PremixEx Taq 25 μ 1、正向引物溶液Ιμ 1、反向引物溶液Ιμ 1、探针溶液Ιμ 1、rox液 μ 1、结石dna 2μ 1，然后再加蒸馏水至总体积为50 μ I ; b)设置PCR反应条件:第一步95°C预变性30秒，第二步95°C变性15秒，60°C退火延伸31秒，共计45个循环。
全文摘要
本发明提供了一种利用实时荧光PCR技术检测胆囊结石中华支睾吸虫DNA的方法，其包括以下步骤1)胆囊结石预处理；2)提取胆囊结石中的DNA；3)设计并合成特异性引物及探针；4)实时荧光PCR反应。本发明提供的方法能够高效提取胆囊结石中华支睾吸虫的DNA，并且无需电泳，可以节省检测时间，灵敏度高，并有效避免有毒物质的污染，为研究华支睾吸虫卵与胆囊结石形成机制的关系提供了新的研究角度和方向。
文档编号C12Q1/68GK103224976SQ201210021338
公开日2013年7月31日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者乔铁, 郑培明, 谢景夏, 马瑞红, 罗小兵, 罗振亮 申请人:广州市番禺区胆囊病研究所