专利名称：薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及植物病毒的诊断试剂盒及检测方法，具体是针对薇甘菊萎蔫病毒 (Mikania micrantha wilt virus, MMWV)的基因诊断试剂盒及检测方法。
背景技术：
薇甘菊(Mikaniamicrantha H. B. K.)是菊科(Compositae)假泽兰属 (Mikaniaffilld)多年生藤本植物。目前已生物入侵到我国华南地区，对生态环境造成严重的危害。薇甘菊萎蔫病毒属于豇豆花叶病毒科(Comoviridae)蚕豆病毒属(Fabavirus)。薇甘菊感染该病毒后出现叶片萎蔫、顶枯、节间矮化等症状，可以严重地抑制薇甘菊的生长。 该病毒与蚕豆萎蔫病毒-1 (Broad bean wilt virus_l，BBWV_l)和蚕豆萎蔫病毒-2 (Broad bean wilt virus-2,BBWV-2)有较高的遗传同源性，可以感染蔬菜作物、豆科作物等多种重要的经济作物，造成严重地经济损失。目前对于薇甘菊萎蔫病毒尚无有效的检测方法。因此简便快速、特异性强、灵敏度高的诊断试剂盒及其方法是早期快速诊断薇甘菊萎蔫病毒及有效监控该病毒传播途径的有效方法。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是利用DNA片段两侧的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技木。该方法具有快速、灵敏和特异性强等特点，被广泛应用到各项科研工作和生产实践中。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒。本发明的另一目的在于提供ー种利用上述试剂盒检测薇甘菊萎蔫病毒基因的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一种薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒，包含两对特异性引物，分别是MMWV RNAl F :5，-TGAGGAATTGGGAAGGTC ；MMWV RNAl R :5，-CGACTCGGCGTCATAAAC ；MMWV RNA2 F :5，-GGAATCCCTGAAACTATGC ；MMWV RNA2 R :5，-TGCTCCACCAATCACAACA ；上述两对弓I物是以MMWV RNAl和MMWV RNA2的保守区域设计的，可以特异性地扩增携带MMWV病毒的待测样品的相关基因片段；所述的薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒还包括dNTP混合物、含mg2+的10倍反应缓冲液和聚合酶；所述的聚合酶优选TaqE。一种应用上述试剂盒检测薇甘菊萎蔫病毒的方法，包括以下步骤(1)按照常规通用方法提取待测植物样品的RNA ；
(2)往步骤(1)得到的RNA中分别加入引物MMWV RNAl FiPMMWVRNAl R、引物MMWV RNA2 F 和 MMWV RNA2 R, PCR 扩增后分别得到 MMWV RNAl cDNA 和 MMWV RNA2 cDNA ；(3)往 MMWV RNAl cDNA 中加入引物 MMWV RNAl F 币 MMWV RNA1R，进行 PCR 扩增得到扩增产物1;往MMWV RNA2 cDNA中加入引物MMWVRNA2 F和MMWV RNA2 R，进行PCR扩增得到扩增产物2 ；将两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物1在329bp出现明亮的条带，同时扩增产物2在364bp出现明亮的条带，则MMWV为阳性，说明待测植物样品中携帯薇甘菊萎蔫病毒；否则MMWV为阴性，表明待测植物样品没有携帯薇甘菊萎蔫病毒。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明的薇甘菊萎蔫病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以MMWVRNA1和MMWV RNA2的基因保守区域设计的两对特异性引物为主体而设计的。利用两对引物，可以特异性地扩增携帯MMWV病毒的待测样品的相关基因片段，所建立的PCR反应体系保证检测结果的快速性、稳定性和准确性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏地检测感染MMWV的样品，可以用于该病毒的跟踪检測，潜在寄主植物的检测，避免病毒的传播流行，加强对薇甘菊生物入侵的生态管理，具有广阔的应用前景。
图1是PCR扩增产物电泳结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进ー步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
薇甘菊萎蔫病毒的基因诊断试剂盒，包括以下组分
1).模板抽提液1，1瓶，内装Trizol ；
2).去蛋白液II，1瓶，内装氯仿；
3).RNA沉淀液III，1瓶，内装异丙醇；
4).洗涤液IV，1瓶，内装75%乙醇；
5).洗脱液V，1瓶，内装灭菌双蒸水；
6).反应液VI，1瓶，内装PCR反应液，包括ddH20、dNTP、含mg2+的IOXBuffer, TaqE,弓丨物 MMWVRNA1F 为5，-TGAGGAATTGGGAAGGTC 禾Π MMWVRNA1R 为
5，-CGACTCGGCGTCATAAAC ；7).反应液VII，1瓶，内装PCR反应液，包括ddH20、dNTP、含mg2+的 10XBuffer, TaqE,弓| 物 MMWVRNA2F 为5，-GGAATCCCTGAAACTATGC，MMWVRNA2R 为 5，-TGCTCCACCAATCACAACA ；8).阳性对照液VIII，1瓶，内装MMWV RNAl和MMWV RNA2相关基因片段的质粒 DNA ；9). ー块泡沫板，泡沫板上有不少于上述小瓶数量的圆孔，各小瓶可以分别置于相应的小孔中；10).盒子，可容纳上述所有试剂和材料等。
该试剂盒中的阳性对照液VIII是PCR扩增MMWV RNAl和MMWV RNA2后，分别得到 MMWV RNAl cDNA (序列为 SQE ID NO. 5)和 MMWV RNA2cDNA (序列为 SQE ID NO. 6) JfMMWV RNAl cDNA和MMWV RNA2 cDNA分别连接到pMD18_T载体上，转入大肠杆菌E. coli，经氨苄青霉素培养基平板培养，挑取阳性克隆，测序分析验证，提取其质粒DNA，溶于50 μ 1 ddH20 中即为阳性对照液。实施例2一种应用实施例1的试剂盒检测薇甘菊萎蔫病毒的方法，包括以下步骤1).取待测植物样品，加入适量液氮充分研磨至粉末状；2).将研磨好的粉末移至RNase-free的2ml灭菌离心管中，加入Iml模板抽提液 I液，充分混勻，室温静置6min ；3).加入200 μ 1去蛋白液II液，盖紧离心管，剧烈震荡30s充分混勻，室温静置 5min ；4) · 40C，12000r/min 离心 12min ；5).取上清液至另ー RNase-free的2ml灭菌离心管中，加入500 μ 1 RNA沉淀液 III液，轻轻混勻，室温下放置IOmin ；6) · 40C，12000r/min 离心 12min ；7).弃上清，加入Iml洗涤液IV冲洗，12000r/min离心12min，冲洗两次；8).弃上清，在超净工作台上吹干或室温下风干aiiin ；9).加入20 μ 1洗脱液V液重悬至充分溶解，得到待测植物样品的RNA ；10).在两个PCR管中分别加入步骤(9)待测植物样品的RNA 1μ 1和PCR反应液 VI 9 μ 1、步骤(9)待测植物样品的RNA 1μ 1和PCR反应液VII 9 μ 1，混勻后离心数秒，进行 PCR 扩增，37°C 20min，98°C 5min ;4°C 保存；分别得到 MMWVRNA1 cDNA 和 MMWV RNA2 cDNA ；11).取 2 μ 1 步骤(10)得到的 MMWV RNAl cDNA 与 PCR 反应液 VI 18 μ 1 混合； 取2 μ 1步骤(10)得到的MMWV RNA2 cDNA与PCR反应液VII 18 μ 1混合；进行PCR扩增， 940C 5min 预变性；94°C 30sec，57°C 30sec，72°C Imin ；；35 个循环，72°C 10min，4°C保存。扩增后分別得到扩增产物1和2。12).分別取5 μ 1扩增产物1、扩增产物2，加入1 μ 1溴酚蓝混勻，经1. 5%琼脂糖凝胶电泳25 40min，电泳结果如图1 (泳道1为扩增产物1 ；泳道3为扩增产物2 ；泳道2 和4分別为相应的阴性对照，即不加cDNA模板的扩增产物)所示，扩增产物1在329bp出现明亮的条带，同吋，扩增产物2在364bp出现明亮的条带，待测样品MMWV为阳性，说明待测植物样品中携帯薇甘菊萎蔫病毒。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、組合、简化， 均应为等效的置換方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒，其特征在于包含两对特异性引物，分别是MMWV RNAl F :5’ -TGAGGAATTGGGAAGGTC ；MMWV RNAl R :5’ -CGACTCGGCGTCATAAAC ；MMWV RNA2 F :5’ -GGAATCCCTGAAACTATGC ；MMWV RNA2 R :5’ -TGCTCCACCAATCACAACA。
2.根据权利要求1所述的薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒，其特征在于所述的薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒还包括dNTP混合物、含mg2+的10倍反应缓冲液和聚合酶。
3.根据权利要求2所述的薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒，其特征在于所述的聚合酶为iTaqE。
4.ー种应用权利要求1-3任一项所述的试剂盒检测薇甘菊萎蔫病毒的方法，其特征在于包括以下步骤(1)提取待测植物样品的RNA；(2)往步骤(1)得到的RNA中分别加入引物MMWVRNAl FiPMMWVRNAl R，引物MMWV RNA2 F 和 MMWV RNA2 R, PCR 扩增后分别得到 MMWV RNAl cDNA 和 MMWV RNA2 cDNA ；(3)往MMWVRNAl cDNA中加入引物MMWV RNAlF和MMWV RNA1R，进行PCR扩增得到扩增产物1 ；往MMWV RNA2 cDNA中加入引物MMWVRNA2 F和MMWV RNA2 R，进行PCR扩增得到扩增产物2 ；将两种扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物1在329bp出现明亮的条带， 同时扩增产物2在364bp出现明亮的条带，则MMWV为阳性，说明待测植物样品中携帯薇甘菊萎蔫病毒；否则MMWV为阴性，表明待测植物样品没有携帯薇甘菊萎蔫病毒。
全文摘要
本发明公开了一种薇甘菊萎蔫病毒基因诊断试剂盒及检测方法，该试剂盒包含两对特异性引物，分别是MMWV RNA1 F5’-TGAGGAATTGGGAAGGTC；MMWV RNA1 R5’-CGACTCGGCGTCATAAAC；MMWV RNA2 F5’-GGAATCCCTGAAACTATGC；MMWV RNA2 R5’-TGCTCCACCAATCACAACA。检测方法包括以下步骤(1)提取待测植物样品的RNA；(2)往RNA中分别加入两种引物，PCR扩增后分别得到两种cDNA；(3)往两种cDNA中分别加入两种引物，PCR扩增得到两种扩增产物；电泳，若扩增产物1在329bp出现明亮的条带，同时扩增产物2在364bp出现明亮的条带，则MMWV为阳性，说明待测植物样品中携带薇甘菊萎蔫病毒。本发明的试剂盒和方法可以特异性地扩增携带MMWV病毒的待测样品的相关基因片段，所建立的PCR反应体系保证检测结果的快速性、稳定性和准确性。
文档编号C12R1/94GK102534049SQ20121002797
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月9日 优先权日2012年2月9日
发明者宋圆圆, 曾任森, 梁笑婷, 王瑞龙, 苏贻娟, 辛效威, 骆世明 申请人:华南农业大学