专利名称：4个聋病易感基因联合检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测4个聋病易感基因荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80%患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80%。 因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。
在目前已经定位和克隆的耳聋相关基因中，GJB2是最常见的易感基因，在先天性重度耳聋患者中约占30-50%。目前，在该基因已经发现了 100多种突变类型，然而，不同种族GJB2基因常见的突变形式不同。在中国常见的突变形式为235delC，其在所有致病性突变中约占74. 14%，约22. 2%的中国耳聋患者与该突变有关。
药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A> G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10%的具有12S rRNA基因1555A > G突变，美国语前听力损失患者中，1555A > G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因 1555A > G突变与15-20%的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊散发的耳聋患者中，约5%的患者是由于12S rRNA基因1555A > G突变导致的，而在聋哑学校这样一个特殊群体，则高达 12%的患者是由于12SrRNA基因1555A > G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。同时在中国群体中还发现了 12S rRNA基因1494C > T突变与药物性耳聋的关系，目前至少已经发现了三个大的家系是由于1494C > T突变导致的。1555A > G突变和1494C > T突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。
SLC26A4基因与弧立的大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。通过颞骨CT扫描可以得出结论，但目前由于设备和专业人员的限制，中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨CT扫描，导致许多地区无法诊断大前庭水管综合征。通过对SLC26A4基因的检测，则可以在全国范围内实现对80 %以上大前庭水管综合征的准确诊断，并先于CT检查发现和确诊大前庭水管综合征，这一方法可以避免放射线检查的辐射问题，更易为患者家属接受，并且由于基因诊断操作能够批量进行， 可以在大标本范围内进行筛查。大量研究表明，存在于中国人群突变热点区域为SL(^6A4基因外显子8的侧翼序列的IVS7-2A > G0
目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、变个生高效液才目色 i普分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。
采用荧光标记技术、毛细管电泳技术、多重PCR复合扩增，通过带不同荧光标记物的多对引物同时对 GJB22!35delC、12S rRNA 1555A > G 突变、1494C > T 突变、IVS7-2A > G 特异性的扩增，并在这些引物中掺入核酸类似物以提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对这4个耳聋基因位点的同时检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确、采样方便，并能实现一次性获得4个关键位点诊断结果的高通量筛查流程，大大节约了人力物力和时间、防止多步操作而产生污染。发明内容
本发明目的是提供一种同时检测4个聋病易感基因GJB2235delC、12S rRNA 1555A > G突变、1494C > T突变、IVS7-2A > G及Amelogenin基因座荧光检测试剂盒。
为了实现上述目的，采取的技术方案一种同时检测4个聋病易感基因荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；
所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，5对引物混合物以及超纯水；
所述扩增后试剂包括内标R0X-300和用于基因分型的各基因突变位点对应的基因分型标准物；
使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为 8. 0-9. 0，镁离子浓度为1.5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μΜ，Taq酶的用量为 0. 1-0. 4U/ μ L，5对引物混合物中的单对引物终浓度为0. 2-0. 4 μ M0
使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增 GJB2235delC、12S rRNA 1555A > G 突变、1494C > T 突变、IVS7-2A > G 及 Amelogenin 基因座。
用于GJB22;35delC检测的引物为
SEQ NO. 1 :5，-CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3，
SEQ N0. 2 :5，-GCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC-3，
用于12S rRNA 1555A > G突变检测的引物为
SEQ N0. 3 5' -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3，
SEQ NO. 4 5，-G T ACGCATTTATATAGAGTAGC-3，
用于12S rRNA 1494C > T突变检测的引物为
SEQ N0. 5 5' -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3，
SEQ N0. 6 :5，-G A CACACCGCCCGTCTCT-3，
用于IVS7-2A > G检测的引物为
SEQ N0. 7 5' -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3，
SEQ NO. 8 5' -QT TTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3，
其中LNA核苷以黑体字表示。
用于Amelogenin基因座检测的引物为
SEQ NO. 9 :5，-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，
SEQ NO. 10 :5，-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。
所述的5对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料为不同的荧光素。
所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ；所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。
使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行， 扩增程序:94-980C l-5min J6-32 个循环的 94_98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15-60 ； 60 °C 30-60min。
使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。
对于Amelogenin的检出，一方面是内参的作用指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
图1是本发明的试剂盒对12S rRNA 1494C >T突变个体血斑来源 DNA (2. 0ng/25uL体系)扩增后的分型结果；
图2是本发明的试剂盒对GJB2235delC突变个体血斑来源DNA(0. 2ng/25uL体系) 扩增后的分型结果；
图3是本发明的试剂盒对12S rRNA 1555A > G突变的个体血斑来源 DNA(1. 0ng/25uL体系)扩增后的分型结果；
图4是本发明的试剂盒对IVS7-2A > G突变个体血斑来源DNA (0. 5ng/25uL体系) 扩增后的分型结果；
图5是本发明的试剂盒对正常个体血斑来源DNA (5. 0ng/25uL体系)扩增后的分型结果；
图6是未经修饰的引物对同一浓度(5. 0ng/25uL体系)的正常个体血斑来源DNA 样本的分型结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
本发明的试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本。用于聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A > G检测的引物采用蓝色荧光染料标记，GJB2235delC检测的引物采用绿色荧光染料标记，用于Amelogenin基因座、12S rRNA 1494C > Τ、1555A > G突变检测的引物采用黄色荧光染料标记，内标采用红色荧光染料标记。
1、待测样本1000份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对各位点进行过测序检测。其中，IVS7-2A > G突变样本10份，GJB2235delC突变样本10份， 12SrRNA 1555A > G突变样本10份，1494C > T、突变样本1份。
2、检材的基因组DNA提取
Chelex提取法剪下1 3mm血斑置于1. 5mL离心管中，加入SdH2O lmL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5 % Chelex-IOO震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴 IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3. IPCR 扩增体系
组分体积(μ )组分说明Reaction Mix10含 pH 为 8.3 的 2.5xPCR 缓冲液、7.5 mM 的 MgCl2,750 μΜ dNTP MixTaq 酶(5 U^L)0.5Primers5本发明的5组引物对C0.2uM；)模板0.2-5.OngSdH2O补足至 25.0|iL
3. 2PCR 扩增程序初始变性热循环终延伸95 "C 5min30个循环 98"C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s60 °C 60min
4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔(0. 2 μ L分子量内标)X (进样数)+ (9. 8 μ L去离子甲酰胺)X (进样数)〕。将10 μ L上样混合物与1 μ L扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95°c变性5min，冰浴5min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。
5、结论
使用本发明测试1000份样本的结果和使用测序方法的结果完全一致。本发明图例为结果举例
图1 :12S rRNA 1494C > T确诊病例，女。1494C > T位点判读位置(170bp)出现峰值3700H的检测峰；性别判读位置出X单峰(105bp)，峰值4000H ；G2位置(238bp)出现峰值8000的检测峰。
图2 :GJB2235delC确诊病例，女。235delC位点判读位置Q37bp)出现峰值400H 的检测峰，G2位置Q38bp)出现峰值400H的检测峰，性别出X单峰，峰值1400H。
图3 :12S rRNA 1555A > G确诊病例，男。1555A > G判读位置Q25bp)出现峰值 1900H的检测峰；G2位置(238bp)出现峰值1800H的检测；性别出X、Y双峰:105bp,峰值 1600H 和 lllbp，峰值 1600H。
图4 JVS7-2A > G确诊病例，女。IVS7-2A > G判读位置(88bp)出现峰值1800H 的检测峰，G2位置(238bp)出现峰值MOOH的检测峰，性别判读位置出X单峰(105bp)，峰值 2300H。
图5 正常个体，男。各位点判读位置不出峰，G2位置Q38bp)出现峰值8000H的检测；性别出X、Y双峰l(^bp，峰值2400H和lllbp，峰值2450H。
与测序方法相比较对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的。
实施例2
未经修饰的引物对同一浓度(5. 0ng/25uL体系)的正常个体血斑来源DNA样本进行检测。标记引物同实施例1。用于聋病易感基因位点检测的非标记引物分别为实施例1 中各引物对应的未经LNA修饰的普通引物。
1、待测样本同实施例1中的正常个体血斑。
2、检材的基因组DNA提取
采用Chelex法进行基因组DNA的提取。
3、扩增和扩增产物的检测分析
3. IPCR 扩增体系
权利要求
1.4个聋病易感基因联合检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增各易感基因及Amelogenin基因座的引物、及内标和各基因突变位点对应的基因分型标准物，所述鸯病易感基因位点为 GJB22!35delC，12S rRNA 1555A > G、1494C > Τ,和 IVS7-2A > G0
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于 用于GJB2235delC检测的引物为SEQ NO. 1 :5’ -CGCATTATGATCCTCGTTGTGG-3’SEQ NO. 2 :5，-GCTTGATGAACTTCCTCTTCTTCTC-3，；用于12S rRNA 1555A > G突变检测的引物为SEQ NO. 3 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3’SEQ NO. 4 :5’ -G T ACGCATTTATATAGAGTAGC-3‘；用于12S rRNA 1494C > T突变检测的引物为SEQ NO. 5 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3，SEQ N0.6 :5’ -G Λ CACACCGCCCGTCTCT-3‘；用于IVS7-2A > G检测的引物为SEQ NO. 7 :5’ -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’SEQ N0.8 :5， -G TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3‘；其中LNA核苷以斜体字表示。用于Amelogenin基因座检测的引物为SEQ NO. 9 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，SEQ NO. 10 5' -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述GJB2235delC，12SrRNA1555A > GU494C > Τ, IVS7-2A > G及Amelogenin基因座的检测引物，每对引物中有一条引物的 5’端进行荧光染料标记。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述GJB2235delC、12SrRNA1555A > G、1494C> T，IVS7-2A > G及Amelogenin基因座的检测引物与内标采用不同的荧光染料标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述GJB2235delC，12SrRNA1555A > G、1494C > Τ, IVS7-2A > G及Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现， 采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
6.权利要求1所述试剂盒应用于聋病易感基因GJB2235delC，12SrRNA 1555A > G突变、1494C > T，IVS7-2A > G及Amelogenin基因座检测的方法，其特征在于通过荧光引物 PCR及毛细管电泳特异性检测聋病易感基因及Amelogenin基因座；用于GJB2235delC检测的引物如SEQ NO. USEQ NO. 2所示；用于12S rRNA 1555A>G突变检测的引物为=SEQ NO. 3 和SEQ NO. 4所示；用于12S rRNA 1494C > T突变检测的引物如SEQ NO. 5,SEQ NO. 6所示； 用于SLC26A4基因IVS7-2A > G位点突变检测的引物为=SEQ NO. 7和SEQ NO. 8所示；用于 Amelogenin基因座检测的引物如SEQ NO. 9.SEQN0. 10所示；所述各基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测4个聋病易感基因荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增GJB2235delC，12S rRNA 1555A＞G突变、1494C＞T突变、IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明首次复合采用了荧光标记技术、LNA核苷单体掺入-引物修饰技术、毛细管电泳技术实现对耳聋基因位点GJB2235delC、12S rRNA 1555A＞G突变、1494C＞T突变、IVS7-2A＞G的高灵敏度特异性同时检测，大大节约了人力物力和时间、防止多步操作而产生污染。
文档编号C12Q1/68GK102534030SQ201210033159
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者万戈江, 夏子芳, 步讯, 魏宏泉 申请人:北京科聆金仪生物技术有限公司