专利名称：一种聋病易感基因12S rRNA 1555A>G荧光检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测聋病易感基因12S rRNA 1555A > G及Amelogenin基因座的荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
世界范围内对听力语言残疾者进行的致病因素研究表明，约60-80%患者的病因与遗传因素有关，其中发达国家的临床研究数据表明，遗传性耳聋在耳聋患者中约占80%。因此近十几年来，遗传性耳聋的发病机制及其分子流行病学的研究成为了聋病研究最重要的内容之一。随着人类基因组计划完成，聋病基因的定位和克隆取得了巨大的进步，聋病的 分子遗传学研究和分子流行病学的数据使研究者们逐步认识到聋病易感基因突变在维护听力健康和发现听力异常中的重要性。药物的耳毒性是导致语前听力损失的一个重要因素，部分与线粒体12S rRNA基因1555A> G突变有关，该突变可以增加耳蜗对氨基糖甙类药物的敏感性。在美国，耳毒性药物相关的听力损失患者中，10%的具有12S rRNA基因1555A > G突变，美国语前听力损失患者中，1555A > G突变患者的发病率约为1/20000-1/40000。在西班牙，12S rRNA基因1555A > G突变与15-20%的家族性非综合征型听力损失有关，许多年老的家族成员即使没有使用氨基糖甙类药物也可发生因此突变导致的听力下降。而在中国，药物性耳聋的发病率超出了原有的想象，在一系列的文章报道中，发现在门诊散发的耳聋患者中，约5%的患者是由于12S rRNA基因1555A > G突变导致的，而在聋哑学校这样一个特殊群体，则高达12%的患者是由于12S rRNA基因1555A > G突变接触氨基糖甙类药物而致聋。1555A >G突变者在出生时往往听力正常，很难通过听力筛查而被提前发现和预测，却存在因耳毒性药物的使用而发生听力损失的隐患。目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing，DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restrictionfragment lengthpolymorphism, RFLP)、变性高效液相色谱分析(denaturing highperformance liquidchromotography, DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。
发明内容
本发明目的是提供一种聋病易感基因12S rRNA 1555A > G荧光检测试剂盒。为了实现上述目的，采取的技术方案一种聋病易感基因12S rRNA 1555A > 6荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，2对引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括用于基因分型的对应于12S rRNA 1555A>G检测和Amelogenin性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标R0X-300 ；使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件PCR扩增体系的pH值为8. 0-9. 0，镁离子浓度为1.5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300iiM，Taq酶的用量为0. 1-0. 4U/ uL,2对引物混合物中的单对引物终浓度为0. 2-0. 4 u M0使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增 12S rRNA 1555A > G 和 Amelogenin 基因座。用于12S rRNA 1555A > G 突变检测的引物为=SEQ NO. I 和 SEQ NO. 2。
SEQ NO. 02为掺入了 LNA核苷的引物(LNA核苷以黑体字表示)SEQ NO. 01 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3’SEQ NO. 02 :5’ -GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3’用于Amelogenin基因座检测的引物为SEQ NO. 3 5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’、SEQ NO. 4 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ;所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行，扩增程序:94-980C l-5min ;26_32 个循环的 94-98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15-60 ；60 °C 30-60min。对于12S rRNA 1555A > G突变的检出，使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。对于Amelogenin的检出，一方面是内参的作用指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
图I是经修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度DNA的分型结果。图2是未修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度DNA的分型结果。图3是经修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度DNA的分型结果。图4是未修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度DNA的分型结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。实施例I聋病易感基因12S rRNA 1555A > G荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因12S rRNA 1555A > G检测的引物、用于Amelogenin基因座扩增的引物均采用黄色荧光染料TAMRA标记；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。其中，用于聋病易感基因12S rRNA 1555A > G检测的引物使用经过LNA核苷单体掺入修饰的引物(SEQ NO. 02 :5，-GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3，)和普通引物(SEQ NO. 02. 0 5’ -GTACGCATTTATATAGAGT AGC-3’ )进行扩增效果的比较，斜体为LNA核苷单体。I、待测样本100份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对12SrRNA1555位点进行过测序检测，其中突变样本5份。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下I 3mm血斑置于I. 5mL离心管中，加入sdH201mL,振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5% Chelex-IOO震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 u L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min,上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析3. IPCR 扩增体系
组分__休积(叫)组分说明_
Reaction Mix 10 含 pH 为 8.3 的 2.5；<PCR 缓冲液、7.5 mM 的 MgCl2、750 ^iM___dNTP Mix_
Taq酶
I
.(5U/|止)___
52组引物对(0.3uM):
SEQNO.015，-TAMRA
-AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3，
PrimersSEQ NO.02 5’-GrACGCATTTATATAGAGTAGC-3’ or
SEQ NO.02.0 5，-GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3，
SEQ NO.03 5，-TAMRA-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，
___SEQ NO.04 57-GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-37
模板__0.2-5ng 分别为 0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0 ng_
补足至
SdH2O
_ 25.O^L _3. 2PCR 扩增程序
权利要求
1.ー种聋病易感基因12S rRNA 1555A > G荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA聚合酶及其缓冲溶液、扩增12S rRNA 1555A > G及Amelogenin基因座的引物、及基因突变位点12S rRNA 1555A > G和Amelogenin基因座的基因分型标准物和内标。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于突变热点12SrRNA 1555A>G检测的引物为SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 2 ；SEQ N0.01 :5’ -AGTGGGTTTGGGGCTAGGTTTAG-3，SEQ NO. 02 :5’ -GTACGCATTTATATAGAGTAGC-3’ 其中LNA核苷以斜体字表示。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述Amelogenin基因座检测的引物为SEQ NO. 03 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3’SEQ NO. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3’。
4.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于所述12SrRNA 1555A > G和Amelogenin检测的引物，每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述12SrRNA 1555A>G检测的引物和用于Amelogenin基因座检测的引物可以米用相同或不同的突光染料标记；内标选用不同于上述的突光染料标记。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述12SrRNA 1555A > G和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
7.应用权利要求I所述试剂盒检测聋病易感基因12SrRNA 1555A > G的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测聋病易感基因12S rRNA1555A>G及Amelogenin基因座;用于12S rRNA 1555A>G突变检测的引物为=SEQ NO. I和SEQ NO. 2所示；用于Amelogenin基因座检测的引物如SEQ NO. 3, SEQ NO. 4所示;所述12S rRNA 1555A> G和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现,采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种检测聋病易感基因12S rRNA 1555A＞G的荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增12S rRNA 1555A＞G及Amelogenin基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明以12S rRNA 1555A＞G、Amelogenin基因座为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；在耳聋基因筛查领域中首次复合采用了荧光标记技术、LNA核苷单体掺入-引物修饰技术、毛细管电泳技术实现对耳聋基因位点12S rRNA1555A＞G的高灵敏度特异性检测。
文档编号C12Q1/68GK102660636SQ201210033190
公开日2012年9月12日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者万戈江, 夏子芳, 步讯, 魏宏泉 申请人:北京科聆金仪生物技术有限公司