专利名称：一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法和试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以对人类Duffy血型基因Fy (a)和Fy(b)进行大规模筛查。
背景技术：
Duffy抗原(⑶234)是一种位于红细胞表面的蛋白，根据首次发现时的患者(Duffy)而命名。该抗原是一种糖基化的膜蛋白及部分趋化因子的非特异性受体，由Duffy抗原趋化因子受体基因编码，该基因亦称为CC家族结合蛋白1、糖蛋白D、FY等。1950年在一名多次输血的血友病患者血清中首次发现了 Duffy血型,其血清中含有抗Fy (a)的抗体,次年在一多次生产的妇女血清内发现了抗Fy (b)抗体。运用这两种抗体确定了 4种表型:Fy (a+b+)、Fy (a+b_)、Fy (a-b+)及Fy(a_b_)。其中Fy(a_b_)被国际输血协会定义为稀有血型。Duffy血型抗原具有重要的生物学功能=Duffy是间日疟原虫、杂性趋化因子的受体，同时参与了多种疾病的发生与发展过程，如新生儿溶血病、HIV感染、炎症、肿瘤、自身免疫性疾病及移植排斥反应等。Duffy抗原基因位于人类染色体1.q22_l.q23,为含有两个外显子的单拷贝基因，根据其mRNA的简并与否，Duffy抗原肽可分为主要(336aa)和次要(338aa)两种形式，二者区别在于N-末端的氨基酸残基数目前者为6个后者为8个，但此两种形式均能很好结合抗Fy抗体和趋化因子。Duffy抗原具有7次跨膜结构域,含一胞外N-末端结构域和一胞内C-末端结构域。Fy (a) cDNA 131位碱基为鸟嘌呤(G)，Fy (b)为腺嘌呤(A)，造成Fy (a)和Fy (b)抗原在氨基酸序列上有I个氨基酸残基的区别，前者42位上为甘氨酸(Gly)，后者为天冬氨酸(Asp)。产生Duffy阴性表型Fy (a-b_)的原因主要有两种，较为常见的是由于Fy基因上游GATA-1结合位点突变引起，GATA-1是一种调节红系细胞基因表达的转录因子，此突变阻止Fy基因转录，Fy糖蛋白无法表达于红系细胞，但其余非红系细胞的表达不受影响，因此体内不产生抗Fy(b)或抗Fy-3抗体；产生Fy (a-b_)的另一原因是点突变导致编码序列中提前出现终止密码，并且截短的Duffy蛋白无法被运送至细胞表面，此类突变个体内所有组织中Duffy抗原表达缺失，因而可伴有抗Fy-3强抗体。红细胞上Duffy抗原在不同种族间的表达存在高度差异，黑人以Fy (a-b_)表型为主:78 %非裔美国人，47-90 %非洲黑人为此表型；白人Fya与Fyb等位基因的频率分别为
0.425和0.557 ;中国人群以Fy (a+b+)、Fy (a+b_)为主。临床输血中Duffy血型的鉴定逐渐引起人们的重视。Fya和Fyb抗原具有一定的免疫原性，相应的抗体可引起即发型或迟发型溶血性输血反应，必须输注Fya/Fyb阴性血，因此Duffy血型的鉴定对确保输血安全具有重要的临床意义和实用价值，同时对DufTy抗原的研究促进了对人类多种疾病本质与机理的认识。我国卫生部 于2008年启动了国家稀有红细胞血型库建设项目，其中包括Duffy稀有血型[Fy (a-b_)和Fy (a-b+)]的筛选与鉴定。该项目的实施，将满足临床上对稀有血型血液的迫切需求，减少输血不良反应的发生，提闻输血疗效。目前，DufTy血型抗原的检测主要有血清学和分子生物学方法等。前者主要是应用Fya、Fyb抗血清做间接抗人球蛋白实验，后者主要采用PCR-SSP进行基因分型。上述血清学检测试剂依赖进口，价格昂贵；而常规的基因分型检测过程复杂、操作繁琐、容易产生污染、试剂价格昂贵，不适合大规模的Duffy血型抗原的筛查与鉴定。因此，有必要建立简便、快速、准确而廉价的筛选方法。
发明内容
本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以检测人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy (b)。本发明所涉及的方法具特点成本相对低廉，能实现多重反应，产物分析在计算机上完成而避免了人为偏差、并能最大限度地避免常规PCR产物污染，每一反应孔均设内参照、便于对实验质量的监控等特点，从而实现对红细胞Duffy血型基因型快速、准确的大规模筛查。本发明采用以下技术方案。它包括下述步骤:(I)设计扩增引物，用于扩增内参照基因P-actin、Duffy血型Fy(a)以及Fy(b)基因;(2)制备人基因组DNA ;(3)常规PCR，对扩增引物的有效性和特异性进行初步确认；(4)单对引物实时 荧光定量PCR测定P-actin、Fy (a)以及Fy(b)基因扩增产物的熔链曲线，确定Tm值及峰形，对扩增引物的有效性和特异性进行确认；(5)建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定P -actin+Fy (a)，^ -actin+Fy (b)混合产物的熔链曲线，对照步骤(4)测得的Tm值及峰形确定反应的有效性及Fy (a)，Fy (b)的基因型。(6)应用本发明检测成都地区献血人群Fy(a)、Fy(b)基因型；(7)本发明与其他商品Fy-a/b试剂盒的比较研究。本发明另一个所要解决的问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案:它包括3对寡核苷酸扩增引物，用于扩增内参照基因P -actin、Duffy血型Fy (a)以及Fy(b)基因，其中Fy (a)、Fy (b)的上游扩增引物序列相同。所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下:& -actin 扩增引物:actb-F:5，-gatgagattggcatggcttt-3，actb-R:5，-caccttcaccgttccagttt-3’Fy (a)扩增引物:Fy:5' _ctctccccctcaactgagaa_3，Fy(a)-R:5' _agctgcttccaggttggcac_3，Fy(b)扩增引物:Fy:5' _ctctccccctcaactgagaa_3，Fy(b)_R:5' _agctgcttccaggttggcat_3，
附图1显示的是常规PCR结果，Fy(a)、Fy(b)及β-actin的PCR产物片段大小接近(Fy(a)、Fy(b):117bp, β-actin:1OObp),采用常规的琼脂糖凝胶不能区分二者，因此分别在独立的PCR管中扩增，再进行电泳分析，以确认引物的特异性。其中，M:DL2000DNAmarker, Takara ;1、3、5 泳道为 Fy (a)及 β-actin, 2、4、6 泳道为 Fy (b)及 i3_actin;l、2 泳道为#316标本，基因型为Fy (a+b+) ;3、4泳道为#317标本，基因型为Fy (a+b_) ;5、6泳道为#294标本，基因型为Fy (a-b+)。本发明设计的引物能够较好区分Fy (a)和Fy(b)，分型结果与国产秀鹏试剂一致。附图2显示的是单独扩增Fy (a)测定的熔链曲线，为单一峰形，无非特异性扩增，Tm 为 82 0C ο附图3显示的是单独扩增Fy (b)测定的熔链曲线，为单一峰形，无非特异性扩增，Tm 为 82 0C ο附图4显示的是单独扩增内参照β-actin测定的熔链曲线，为单一峰形，无非特异性扩增，Tm为77°C。
附图5显示的是多重PCR扩增β-actin和Fy (a)测定的熔链曲线。上图有两个熔链峰，说明有两条扩增产物，Tm为77°C的峰为β -actin，Tm为82V的峰为Fy (a)，该标本基因型为Fy (a+);下图Tm为77°C处有一个熔链峰，为β-actin扩增产物，而Tm为82°C处无熔链峰，该标本基因型为Fy (a-)。附图6显示的是多重PCR扩增β-actin和Fy (b)测定的熔链曲线。上图有两个熔链峰，说明有两条扩增产物，Tm为77°C的峰为β -actin，Tm为82V的峰为Fy (b)，该标本基因型为Fy (b+);下图Tm为77°C处有一个熔链峰，为β-actin扩增产物，而Tm为82°C处无熔链峰，该标本基因型为Fy (b-)。附图7显示的是多重PCR测定#316标本Duffy血型基因Fy (a)和Fy (b)的熔链曲线。其中兰色为Fy (a)孔的熔链曲线，紫色为Fy (b)孔的熔链曲线，Tm 77°C、82°C均有熔链峰，该标本基因型为Fy (a+b+)，熔链曲线分型结果与常规PCR —致。附图8显示的是多重PCR测定#317标本Duffy血型基因Fy (a)和Fy (b)的熔链曲线。其中兰色为Fy(a)孔的熔链曲线，Tm 77°C、82°C均有熔链峰；紫色为Fy(b)孔的熔链曲线，仅Tm 77°C有熔链峰。该标本基因型为Fy (a+b_)，熔链曲线分型结果与常规PCR —致。附图9显示的是多重PCR测定#294标本Duffy血型基因Fy (a)和Fy (b)的熔链曲线。其中兰色为Fy (a)孔的熔链曲线，仅Tm 77°C有熔链峰；紫色为Fy(b)孔的熔链曲线，Tm 77°C、82°C均有熔链峰。该标本基因型为Fy (a_b+)，熔链曲线分型结果与常规PCR—致。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明内容进行详细说明。实施例:包括引物设计，基因组DNA提取，常规PCR反应，单对引物实时荧光定量PCR测定熔链曲线，实时荧光定量多重PCR测定熔链曲线，应用本发明检测成都地区献血人群Fy (a)、Fy (b)基因型，本发明与其他商品试剂的比较研究。
(I)引物设计根据Gene Bank 中 P -actin (actb)，Fy_a 和 Fy-b mRNA 序列设计扩增引物，通过BLAST比对确认其特异性。actb引物序列为5，-gatgagattggcatggcttt-3J (F)和 5’ -caccttcaccgttccagttt-3’ (R),产物为 IOObp0 根据 Fy (a)、Fy (b) cDNA 131位碱基的不同(前者为G，后者为A)设计扩增引物，序列如下:Fy (a)引物序列为 5 ' -ctctccccctcaactgagaa-3，(F)和 5 ' -agctgcttccaggttggcac-3，(R)，产物为 117bp;Fy(b)引物序列为 5 ' -ctctccccctcaactgagaa-3J (F)和5' -agctgcttccaggttggcat-3’(R)，产物为 ll7bp。(2)基因组DNA提取采用天根公司的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)，按操作说明书从500 u L全血中提取基因组DNA。Nanodrop微量分光光度计(Thermo)测定DNA含量和纯度(260/280 比值彡 1.80)，-20°C保存 DNA 样品。(3)常规PCR反应采用本发明设计的引物扩增@-actin,Fy (a)和Fy(b)基因。采用Takara的Taq酶，按表I扩增体系进行操作:表I常规PCR扩增体系
权利要求
1.一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征在于它包括如下步骤 (1)设计扩增引物，用于扩增内参照基因P_actin、Duffy血型Fy (a)以及Fy(b)基因； (2)制备人基因组DNA； (3)常规PCR，对扩增引物的有效性和特异性进行初步确认； (4)单对引物实时荧光定量PCR测定P-actin、Fy(a)以及Fy(b)基因扩增产物的熔链曲线，确定Tm值及峰形，对扩增引物的有效性和特异性进行确认； (5)建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定P-actin+Fy-a，^ -actin+Fy-b混合产物的熔链曲线，对照步骤(4)测得的Tm值及峰形确定反应的有效性及Fy (a)，Fy (b)的基因型。
2.如权利要求I所述的一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征为步骤(I)中的3对寡核苷酸扩增引物，所述引物分别扩增参照基因P-actin、Duffy血型Fy (a)以及Fy(b)基因，其中Fy (a)、Fy (b)的上游扩增引物序列相同。
所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下 & -actin扩增引物actb-F :5，-gatgagattggcatggcttt-3，actb-R :5’ -caccttcaccgttccagttt_3’ Fy (a)扩增引物Fy :5, -ctctccccctcaactgagaa_3’Fy(a)-R :5, -agctgcttccaggttggcac_3， Fy (b)扩增引物Fy :5, -ctctccccctcaactgagaa_3’Fy(b)-R :5, -agctgcttccaggttggcat_3，
3.如权利要求I所述的一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征为步骤⑷中的单对引物实时荧光定量PCR熔链曲线法检测Duffy血型Fy (a)，Fy (b)基因型，其反应体系和反应程序如下 其特征在步骤(4)中,测定0-actin, Fy (a)和Fy(b)单一扩增产物的熔链曲线峰形及Tm值。扩增体系，以20 ii L计，包括2 X SYBR Premix Ex Taq II预混酶10 ii L，上、下游引物各I U L (终浓度均为0. 5 u mol/L)，50ng/ u L DNA模板I y L，余量以纯水补足。反应程序为95°C 30sec，30 个循环(95°C 15sec，60°C 30sec)，熔链曲线分析。
4.如权利要求I所述的一种检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，其特征为步骤(5)中的实时荧光定量多重PCR熔链曲线法检测Duffy血型Fy (a)，Fy (b)基因型，其反应体系和反应程序如下 其特征在步骤(5)中，在步骤⑷基础上，建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定& -actin+Fy-a, & -actin+Fy-b混合产物的熔链曲线,确定反应的有效性及Fy (a), Fy (b)的基因型。扩增体系，以20 ii L计，包括2 X SYBR Premix Ex Taq II预混酶10 U L，上游混合引物-actin+Fy (a)或 P-actin+Fy (b)) I ii L (终浓度均为 0. 5 ii mol/L),下游混合引物(3 -actin+Fy (a)或 3 -actin+Fy (b)) I u L (终浓度均为 0. 5 u mol/L)，50ng/ u L DNA 模板Iu L，余量以纯水补足。反应程序为95°C 30sec，30个循环(95°C 15sec，60°C 30sec)，熔链曲线分析。
全文摘要
本发明涉及一种能够检测人类Duffy血型基因型的熔链曲线方法，以及该方法所涉及的试剂，可以检测人类Duffy血型基因Fy(a)和Fy(b)。它包括下述步骤引物设计；制备人基因组DNA；常规PCR，初步确认扩增引物的有效性和特异性；单对引物实时荧光定量PCR测定β-actin、Fy(a)以及Fy(b)基因扩增产物的熔链曲线，确定Tm值及峰形；建立实时荧光定量多重PCR反应体系，测定β-actin+Fy(a)，β-actin+Fy(b)混合产物的熔链曲线，通过Tm值及峰形确定Fy(a)，Fy(b)的基因型。本发明所涉及的方法具有成本相对低廉，能实现多重反应，产物分析在计算机上完成而避免了人为偏差、并能最大限度地避免常规PCR产物污染，每一反应孔均设内参照、便于对实验质量的监控等特点，从而实现对红细胞Duffy血型基因型快速、准确的大规模筛查。
文档编号C12Q1/68GK103255199SQ20121003345
公开日2013年8月21日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者周昌华, 洪缨, 巩天祥, 王乃红, 杨群身, 傅雪梅 申请人:成都市血液中心