专利名称：膜醭毕赤酵母菌株在清除棒曲霉素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酵母菌株在清除棒曲霉素中的应用，特别涉及膜醭毕赤酵母 (Pichia membranaefaciens)在清除棒曲霉素中的应用。
背景技术：
棒曲霉素(Patulin)是部分青霉属和曲霉属真菌的次生代谢产物。它对人及动物具有广泛而强烈的毒性作用。急性毒性表现为抽搐、痉挛、皮下组织水肿、肺肠充血、肠炎、 无尿直至死亡；慢性毒性可导致胃溃疡，并具有抑制免疫、致畸性以及潜在的致癌性等，还有可能影响男性的生育能力。棒曲霉素能溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿，微溶于乙醚、苯，不溶于石油醚，在酸性条件下化学性质稳定。在具有棒曲霉素产生能力的真菌中，部分真菌是植物致病菌，其中最主要的一种是扩展青霉病菌(Penicillium expansum)。这种病原菌是世界范围内引起果实采后腐烂的最重要的病原菌之一，常见的寄主包括苹果、梨、葡萄、樱桃、桃、草莓等等。它在引起果实腐烂的同时，会向果实组织中分泌大量的棒曲霉素。在果汁加工产业中，如果腐烂的果实混入原材料中，那么生产出的果汁就会有不同程度的棒曲霉素残留，给消费者(特别是儿童)的身体健康带来危害。基于棒曲霉素对人体健康的潜在危害，世界上很多国家都对果汁产品中棒曲霉素的最大限量做了规定，EU、USFDA规定果汁产品中棒曲霉素的最大限量为 50 μ g/kg, WHO建议人每天棒曲霉素的摄入量不超过O. 4 μ g/kg体重。由于果汁通常为酸性，而棒曲霉素在酸性条件下性质稳定，因此果汁中一旦污染了棒曲霉素后很难自然分解。目前，主要通过吸附、微波处理等物理手段进行去除，但效果不是十分理想，亟需研发新型的棒曲霉素脱除手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)的新用途。本发明所提供的新用途具体为膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)在清除棒曲霉素中的应用。在本发明的一个实施例中，所述膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)具体为膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465。在所述应用中，所述膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465 和含有棒曲霉素的样品反应初始时，所述膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) MI382465与待清除棒曲霉素的配比范围为IOOOcfu I μ g至4000cfu I μ g，具体如 IOOOcfu : I μ g>2000cfu : I μ g 或 4000cfu : I μ g。所述含有棒曲霉素的样品为液体时，所述含有棒曲霉素的样品中棒曲霉素的浓度为 50-200 μ g/mL,如 50 μ g/mL、100 μ g/mL 或 200 μ g/mL。在所述应用中，所述膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465和含有棒曲霉素的样品在25-28°C反应，如26°C。
在本发明的一个实施例中，所述含有棒曲霉素的样品具体为含有棒曲霉素的培养液，如2XNYDB液体培养基。所述2XNYDB液体培养基的pH为5. 4，溶质为葡萄糖、大豆蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物，溶剂为水，所述葡萄糖的终浓度为20g/L，所述大豆蛋白胨的终浓度为10g/L，所述牛肉膏的终浓度为2g/L，所述酵母提取物的终浓度为15g/L。将所述膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465与所述含有棒曲霉素的样品反应的时间至少为2天。在本发明的一个实施例中，所述时间具体为2天、4天或 6天。在应用膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465清除棒曲霉素的过程中，涉及检测将所述膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465与所述含有棒曲霉素的样品反应后的反应液中是否有棒曲霉素残留的步骤。上述检测棒曲霉素残留的具体方法可为薄层层析法。在本发明的一个实施例中，所述薄层层析法所用层析板具体为预制板；所用的展开剂具体为甲苯、乙酸乙酯和90%甲酸(体积比为5 4 I)的混合液；所用的显色剂具体为O. 5% (O. 5g/100ml)的MBTH -HCl -H2O(3-甲基-2苯并噻唑酮腙水合盐酸盐)。判断所述培养液中是否有棒曲霉素残留的具体方法为若在所述层析板上出现橙黄色反应点， 则说明所述培养液中有所述棒曲霉素残留；反之，则说明所述培养液中没有所述棒曲霉素残留。实验证明，膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465可以在含有棒曲霉素的培养液中快速增殖，并可以将培养液中高浓度的棒曲霉素快速脱除。将浓度为 2X105cfu/ml 的膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465 细胞接种到含有100 μ g/ml棒曲霉素的培养液中培养，4天后即检测不到棒曲霉素残留，接种到含有 200yg/ml棒曲霉素的培养液中培养，6天后即检测不到棒曲霉素残留。因此，本发明所提供的应用将为果汁等食品中棒曲霉素残留的脱除提供新的解决方案。
图I为棒曲霉素对膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465生长影响的分析结果。其中，纵坐标为酵母菌株浓度。图2为膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465对培养液中棒曲霉素清除的分析结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。膜酸毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens) IMI 382465 :参考文献Fan Qing, Tian Shiping. Postharvest Biological Control of Rhizopus Rot of Nectarine Fruits by Pichia membranefaciens. Plant Disease 84 :1212-1216 (温馨提不请将附件中的保证函盖章后把扫描件发送给我们)。本发明所用的膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI382465 即为上述文献中所涉及的 Pichia membranefaciens (IMI 382465)。NYDA培养基(平板)葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏1，酵母提取物7. 5，琼脂18，单位g/L ；pH5. 5。NYDB液体培养基葡萄糖10，大豆蛋白胨5，牛肉膏I，酵母提取物7. 5，单位g/L ； pH5. 5。2倍浓度NYDB液体培养基葡萄糖20，大豆蛋白胨10，牛肉膏2，酵母提取物15， 单位g/L ；pH5. 4。实施例I、棒曲霉素对膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465生长的影响I、膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465 菌种的活化取_20°C 保存的膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465,将其在NYDA平板上划线培养。在26°C培养72小时后，从生长良好的膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465单菌落上挑取酵母菌细胞接种到NYDB液体培养基中振荡培养24小时，培养温度26°C，摇床转速200转/分钟。2、棒曲霉素标准品母液的配制所述棒曲霉素为棒曲霉素标准品，购于青岛生工公司，使用时配制成浓度为Img/ ml的母液。配制方法为准确称取IOmg棒曲霉素标准品,溶于IOml蒸懼水中，充分搅拌溶解，并使用O. 22 μ m微孔滤膜进行过滤灭菌。3、含有不同浓度棒曲霉素的培养液的配制使用2倍浓度的NYDB培养液、棒曲霉素标准品母液和无菌水，按照表I中的配比配制出分别含有O μ g/ml, 50 μ g/ml, 100 μ g/ml和200 μ g/ml的棒曲霉素的培养液。表I含不同浓度棒曲霉素的培养液的配方
棒曲霉素浓度(μ g/ml)O50100200棒曲霉素标准品母液(ml)OO. IO. 2O. 42倍浓度NYDB培养液(ml)IIII无菌水(ml)IO. 90.8O. 64、棒曲霉素对膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465生长影响的分析将经过活化的膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465接种到步骤 3配制的分别含有0μ g/ml, 50 μ g/ml, 100 μ g/ml和200 μ g/ml棒曲霉素的培养液中，使接种后膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465 的细胞浓度为 2X 105cfu/ml, 培养温度26°C，摇床转速200转/分钟，每个处理3次重复。接种后，分别在培养至第1，2， 3，4，5，6天时从各个处理中取出20 μ I细胞培养液，用无菌水稀释10倍后用血球计数板计算细胞数目，并经过换算获得各处理的细胞浓度。结果如图I所示，培养液中的棒曲霉素对膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465的增殖有一定影响，然而未改变膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465快速增殖的趋势。培养I天后,含棒曲霉素各处理的膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465 细胞浓度达到 3 X 108cfu/ml 以上；培养6 天后，各处理的细胞浓度均超过8X 108cfu/ml。实施例2、膜酸毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465对棒曲霉素的清除能力的检测
I、菌种的活化
同实施例I步骤I。
2、棒曲霉素标准品母液的配制
同实施例I步骤2。
3、含有不同浓度棒曲霉素的培养液的配制
同实施例I步骤3。
4、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465对棒曲霉素的清除能力的分析
将经过活化的膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465接种到步骤
3配制的分别含有50μ g/ml, 100 μ g/ml和200 μ g/ml棒曲霉素的培养液中，使接种后膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465 的细胞浓度为 2X 105cfu/ml,培养温度 26°C，摇床转速200转/分钟，每个处理3次重复。同时，每个不同浓度的棒曲霉素处理组均设置一个不加膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465的对照。接种后， 分别在培养至第2天，第4天和第6天时从各个处理中取出50 μ I细胞培养液，IOOOOg离心5分钟，取上清用薄层层析法(TLC)检测培养液中残留的棒曲霉素，同时使用浓度分别为50 μ g/ml, 100 μ g/ml和200 μ g/ml的棒曲霉素标准品水溶液作为对照,具体检测方法如下层析板的活化使用的层析板为预制板，规格为IOcmX 10cm。使用之前先用展开剂进行无样品展开，然后在120°C烘I小时。冷却后用铅笔在距上下边界各Icm处划出标记线。点样用玻璃毛细管点样于层析板上，点样基线距底边I. Ocm0展开使用的展开剂为甲苯、乙酸乙酯和90%甲酸水溶液的混合液，三者的体积比为5 : 4 : I。将点好样品的层析板放进已加入展开剂的层析缸的中，浸入展开剂的深度为距层析板底边O. 5cm左右，盖好玻璃板，待展开至所标记的划线位置处时，取出层析板， 晾干。显色使用的显色剂为O. 5% (O. 5g/100ml)的MBTH .HCl .H2O(3-甲基-2苯并噻唑酮腙水合盐酸盐)。先在层析板上均匀喷洒显色剂，然后在120°C烘烤15分钟，冷至室温后，棒曲霉素在层析板上的位置应呈橙黄色点。观察结果对照标准品，根据显色点的有无和大小评估膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465对棒曲霉素的清除能力。若橙黄色反应点出现,则说明对应样品中含有棒曲霉素，且橙黄色的反应点越大表明对应样品中棒曲霉素的含量越高。对于接种了酵母菌株的棒曲霉素培养液来说，橙黄色的反应点大小越接近相应未接种酵母菌株的对照组，贝1J说明该组中膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI382465对棒曲霉素的清除能力越差。结果如图2所不,在接种膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465后，各处理培养液中的棒曲霉素被逐渐清除。含有100 μ g/ml棒曲霉素的培养液组4天后， 检测不到棒曲霉素残留；含有200 μ g/ml棒曲霉素的培养液组6天后，检测不到棒曲霉素残留。而未接种膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens) IMI 382465的对照处理中却始终可以明显地检测到棒曲霉素的残留(各处理组所对应的标准品对照组也可以明显地检测到棒曲霉素的残留)。
权利要求
1.膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)在清除棒曲霉素中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于所述应用中，所述膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)和含有棒曲霉素的样品反应初始时，所述膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)与待清除棒曲霉素的配比为 IOOOcfu : I μ g 至 4000cfu : lug。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述含有棒曲霉素的样品中棒曲霉素的浓度为 50-200 μ g/mLo
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于所述应用中，所述膜醭毕赤酵母 (Pichia membranaefaciens)和含有棒曲霉素的样品在25-281反应。
全文摘要
本发明公开了一种酵母菌株在清除棒曲霉素中的应用。本发明所提供的应用为膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)在清除棒曲霉素中的应用。实验证明，膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)能够快速脱除培养液中高浓度的棒曲霉素，将浓度为2×105cfu/ml的膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)细胞接种到含有100μg/ml棒曲霉素的培养液中培养，4天后即检测不到棒曲霉素残留，接种到含有200μg/ml棒曲霉素的培养液中培养，6天后即检测不到棒曲霉素残留。本发明所提供的应用将为果汁等食品中棒曲霉素残留的脱除提供新的解决方案。
文档编号A23L2/84GK102578675SQ20121004492
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者宗元元, 徐勇, 李博强, 田世平, 秦国政 申请人:中国科学院植物研究所