专利名称：一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法
—种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法
技术领域：
本发明涉及菠萝蛋白酶的提取方法，特别涉及一种用壳聚糖羧化衍生物提取果菠萝蛋白酶的方法。
背景技术：
菠萝蛋白酶(简称菠萝酶)是从菠萝植株中提取的一类多肽水解酶的总称，主要存在于菠萝茎和果实中。根据提取部位的不同，分为茎菠萝蛋白酶(EC3. 4. 22. 32)和果菠萝蛋白酶(EC 3. 4. 22. 33)。从菠萝皮、果中提取的为果菠萝蛋白酶，从菠萝茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。本发明是针对果菠萝蛋白酶的分离提取。菠萝蛋白酶属于巯基蛋白酶，具有很强的水解活性，在食品、生物化学领域有广泛应用。同时，由于其能加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝块溶解，促进药物对病灶的渗透和扩散，且不破坏凝血所必需的纤维蛋白原，因而在医药领域也有很好的应用前景。目前，受酶活力低和原料供应不稳定的限制，其在医药领域的应用还未完全开发。目前提取菠萝蛋白酶的方法可归为三类，即盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法。盐析法，如张桂香(张桂香，王元秀，矫强，等.盐法提取菠萝蛋白酶的研究.食品工业科技，2004，(6) :103-104.)报道了用(NH4)2SO4沉降提取菠萝蛋白酶的方法。其提取菠萝蛋白酶的工艺步骤为菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加苯甲酸钠-io°c加白陶土 _吸附沉降_收集沉淀物_复溶_加(NH4) 2SO4-洗脱-粗酶液_调节pH-精酶液。简化的盐析法在小型企业中比较常见，具体步骤为菠萝皮-清洗-榨汁-过滤-收集滤液-加 (NH4)2SO4-收集沉淀-干燥。盐析法所得酶的活力低，盐使用量多、如(NH4)2SO4的添加量一般为菠萝汁体积的20-25%，(NH4)2SO4F易回收，菠萝汁也不能回用，工艺比较落后。有机溶剂沉淀法，如中国专利CN101696404A提供了一种通过有机溶剂沉降来提取菠萝蛋白酶的方法。菠萝经清洗榨汁后，滤液用聚丙烯酸吸附沉降，沉淀物用醋酸钙溶液处理，使菠萝蛋白酶游离出来，得到菠萝蛋白酶粗酶液，再经透析、冷冻干燥后，得到菠萝蛋白酶干粉。这种方法操作简单、快速、高效、分离量大、聚丙烯酸原料来源广泛，但实际操作中，聚丙烯酸受其单体制备方法的影响，其中常残留丙烯酰胺，这是一种有毒有害成分，在食品等行业中是限制使用的，且聚丙烯酸具有成膜性，能快速地在溶液中形成分子膜，阻碍透析的进行，不利于菠萝蛋白酶的纯化。超滤法，如中国专利CN1908165A提供了一种超滤法提取菠萝蛋白酶的方法。它包括以下步骤原料-清洗-粗粉碎-细粉碎-预处理-榨汁-离心-冷冻-过滤-超滤-干燥-成品，该工艺依靠先进分离提取手段，所用人工较少，酶活力也较高，缺点是菠萝汁不经去糖、去杂碎细胞处理，直接超滤，超滤膜易被污染，每次使用前后都要进行清洗，清洗时间超过生产时间，而且重复使用效果差，需频繁更换膜块，生产成本较高。因此，目前还需要提供一种提取菠萝蛋白酶的方法，该方法能够解决盐析法、有机溶剂沉淀法和超滤法提取菠萝蛋白酶存在的不足。
发明内容本发明的目的在于提供一种原料是纯天然产物、无毒无害、来源广泛，工艺操作简便、生产效率高，产品纯度好、活力高的菠萝蛋白酶的提取方法。具体地说，本发明提供了一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法。该方法包括如下步骤(I)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥。该方法可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝汁两种产品，二者的生产互不干涉，且菠萝汁透明澄清，无需离心等处理，可直接回收再利用.本发明的具体实施方案如下(I)壳聚糖羧化衍生物的制备称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；(2)菠萝汁预处理将菠萝果皮清洗后榨汁,过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于适当温度下的冷藏罐中，向其中加入适量的粉末NaHSO3、半胱氨酸和 EDTA (乙二胺四乙酸)，缓慢搅拌均匀；(3)菠萝蛋白酶的吸附称取适量的步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物， 加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈；回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物；(4)菠萝蛋白酶的洗脱配制适量的一定浓度和pH的NaHCO3溶液，将步骤(3)得到的复合物溶于NaHCO3溶液中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至一定的范围，再向其中加入适量的一定浓度的CaCl2溶液，搅拌均匀后静置一定的时间，然后在3000rpm条件下，离心10 分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥配制一定浓度和pH的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释一定的倍数，在一定的温度条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为IOK的超滤浓缩一定的倍数，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶， 盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于一定的温度下，调节溶液PH值至一定的范围，边缓慢搅拌边向其中均匀地加入适量粉末(NH4)2SO4，然后静置一定的时间，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉。本发明所述的用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，作为步骤(I)，所述的壳聚糖异丁醇悬浮液的浓度，可优选的以质量浓度计为O. 8 I. I %，最优选的为1% ;所述饱和NaOH溶液的用量，可优选的是其溶质质量为壳聚糖的O. 65 O. 80倍，最优选的为
O.75倍；所述的固体氯乙酸的用量,可优选的为壳聚糖质量的I. I I. 3倍,最优选的为I.2倍；所述的反应温度，可优选的为65 75°C，最优选的为70°C ;所述的反应时间，可优选的是2. 5 3. O小时，最优选的为2. 7小时；所述的烘干温度，可优选的为60 70°C，最优选的为65°C。作为步骤(2)，所述的滤液置于的温度，可优选的为8 14°C，最优选的为 I TC ;所述的单位体积菠萝汁中粉末NaHSO3的加入量，可优选的为3X 10_4 4X 10_4g/L， 最优选的为3. 5X 10Vl ;所述的单位体积菠萝汁中粉末半胱氨酸的加入量，可优选的为
5.5 X 10_5 6. 5 X 10_5g/L，最优选的6. O X 10_5g/L ;所述的单位体积菠萝汁中粉末EDTA (乙二胺四乙酸)的加入量，可优选为4. 5X10—4 5. 5X10_4g/L，最优选的为5.0X10_4g/L。作为步骤(3)，所述的单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的加入量，可优选的为I 3. 5g/ L，最优选的为2. 5g/L。作为步骤(4)，所述的NaHCO3溶液的浓度，可优选的为O. 05 O. 12mol/L，最优选的为O. IOmoI/L ;所述的NaHCO3溶液的pH值，可优选的为7. 8 8. 5，最优选的为8. O ;所述的NaHCO3溶液的用量，可优选的以质量计为菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物的7. 5 9倍，最优选的为8倍；所述的用饱和Na2CO3溶液调节壳聚糖-羧化衍生物复合物复溶后的溶液的pH值，可优选的为6. 5 7. 0，最优选的为6. 8 ;所述的CaCl2 溶液的浓度，可优选的以质量浓度计为5. O 7. O %，最优选的为5. 5%所述的CaCl2溶液的用量，可优选的为每千克菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物加入CaCl2溶液O. 5 O. 75L，最优选的为O. 64L ;所述的加入CaCl2后静置一定的时间，可优选的为10 20分钟，最优选的为12分钟。作为步骤(5)所述的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度，可优选的为
O.03 O. 07mol/L,最优选的为O. 05mol/L ;所述的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的pH值，可优选的为6. 5 7. 0，最优选的为6. 8 ;所述的菠萝蛋白酶溶液的稀释倍数，可优选的为4 8 倍，最优选的为5倍；所述的超滤过程的控制温度，可优选的为8 14°C，最优选的为11°C; 所述的超滤的浓缩倍数，可优选的为4 6倍，最优选的为5倍；所述的盐析过程控制温度， 可优选的为12 18°C，最优选的为15°C ;所述的盐析时，溶液pH值调节至一定的范围，可优选的为4 5，最优选的为4. 5 ;所述的粉末(NH4)2SO4的用量，可优选的以质量-体积百分浓度计为18 25%，最优选的为20% ;所述的(NH4)2SO4加完后，静置一定的时间，可优选的为8 16小时，最优选的为12小时。因此，本发明所述的用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，优选采用如下实施方案(I)壳聚糖羧化衍生物的制备称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为O. 8 I. I %的悬浮液，边搅拌边向其中加入含有溶质质量是壳聚糖O. 65 O. 80倍的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液；将该溶液置于 65 75°C水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入质量是壳聚糖I. I I. 3倍的固体氯乙酸,反应2. 5 3. O小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在60 70°C下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。(2)菠萝汁预处理将菠萝果皮清洗后榨汁,过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积，然后将其置于8 14°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，单位体积菠萝汁中的加入量分别为3 X 10_4 4 X 10_4g/L、5. 5 X 10_5
6.5 X l(T5g/L 和 4. 5 X I(T4 5. 5 X l(T4g/L，缓慢搅拌均匀。(3)菠萝蛋白酶的吸附按照单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的用量I 3. 5g/L，称取步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物，称好后用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀地加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈。回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物。(4)菠萝蛋白酶的洗脱配制浓度为O. 05 O. 12mol/L、pH7. 8 8. 5的NaHCO3溶液，使其质量为菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物的7.5 9倍，将步骤(3)所得的复合物溶于NaHCO3溶液中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至6. 5 7. O范围内，然后向其中加入质量浓度为5. O 7. O %的CaCl2溶液，加入量为每千克菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物O. 5 O. 75L，搅拌均匀后静置10 20分钟，在3000rpm条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液。(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥配制浓度为O. 03 O. 07mol/L、pH值为6. 5 7. O 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释4 8倍，8 14°C 的条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为IOK的超滤浓缩4 6倍，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液， 经盐析收集蛋白酶，盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于12 18 V的温度下，调节溶液pH值至4 5，然后边缓慢搅拌边均匀地加入粉末(NH4)2SO4，其用量以质量-体积百分浓度计为 18 25%，静置8 16小时，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物， 真空冷冻干燥，得干酶粉。本发明的技术关键点在于(I)甲壳素是虾、蟹和昆虫等外壳的重要成分，其脱乙酰基后得到壳聚糖。壳聚糖学名聚脱乙酰氨基葡萄糖，是一种高分子多糖，也是良好的阳离子絮凝剂。壳聚糖是天然产物，安全无毒，无刺激、无热源，可溶于水或弱酸，对化合物有良好的吸附和离子交换性能。 改性后的壳聚糖，由图I可以看出，在HOOcnT1波长处有明显的特征峰，说明羧基已经链接到壳聚糖的分子链中，其不仅可增强壳聚糖的水溶性，而且可与菠萝蛋白酶的氨基结合，形成菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物。(2)用壳聚糖羧化衍生物吸附菠萝蛋白酶时，单位菠萝汁中加入的壳聚糖羧化衍生物不能超过3. 5g/L，否则将对菠萝蛋白酶起到分散的作用。(3)菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物溶于NaHCO3溶液后，溶液的pH值须在6. 5
7.O范围内，若超出此范围，则用饱和Na2CO3溶液调节，否则会影响壳聚糖羧化衍生物的洗脱效果。本发明用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，具有如下优点(I)壳聚糖是天然产物，安全无毒，无刺激、无热源，具有良好的水溶性、吸附性，非常适合具有热敏性的菠萝蛋白酶的提取，所得酶纯度好、活力高、安全可靠；(2)经过吸附沉降、洗脱和pH调节后，菠萝蛋白酶溶液中只含微量的糖分和胶质， 超滤提纯和浓缩时，对滤膜污染小、通量大，膜块使用寿命长、生产效率高；(3)经壳聚糖羧化衍生物吸附沉降后，每吨菠萝汁可产菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物约8kg，该复合物可冷冻保存6个月，因而在收获季节可大量进行沉降处理， 待到菠萝淡季时，再行提酶，可大大提高产值；(4)可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝清汁两种产品；
(5)完成上述步骤(4)后，可由超滤法或盐析法收集菠萝蛋白酶，若用盐析法，菠萝蛋白酶溶液的体积只有原菠萝汁的1/20，所用盐量大大减少，又可节约超滤设备的投入， 适合小型企业生产。
图I为壳聚糖及其羧化衍生物的红外图谱，改性后的壳聚糖在HOOcnT1波长处有明显的特征峰，说明羧基已经链接到壳聚糖的分子链中。
具体实施方式实施例I (超滤收集菠萝蛋白酶)(I)将质量为IOOg的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为O. 8%的悬浮液，边搅拌边向其中加入含65g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液；将该溶液置于65°C水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入固体氯乙酸110g，反应2. 5小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在60°C下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。(2)称取20kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁11L，将其置于8°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0033g、半胱氨酸O. 0006g、EDTA (乙二胺四乙酸)O. 0049g,缓慢搅拌均匀。(3)取步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物llg，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁9. 3L，取下层溶液，在 3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物 85g0(4)配制O. 05mol/L pH 7. 8的NaHCO3溶液640mL,将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至6. 5，再向其中加入质量浓度为5%的CaCl2溶液43mL，搅拌均匀后静置10分钟，在3000rpm的条件下，离心10 分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液710mL。(5)制备 O. 03mol/L pH 6. 5 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液 3. 2L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，8°C的条件下，先后经分子截留量为100K和IOK的膜进行超滤，待其体积减少到约O. 8L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉9g，经测其酶活力为 L 72X 106U/g。实施例2 (超滤收集菠萝蛋白酶)(I)将质量为IOOg的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为I. I %的悬浮液，边搅拌边向其中加入含80g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于75°C水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入固体氯乙酸130g，反应3. O小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在70°C下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。(2)称取30kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁16L，将其置于14°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0064g、半胱氨酸O. OOlOg, EDTA O. 0088g,缓慢搅拌均匀。(3)取步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物56g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁12. 6L，取下层溶液，在 3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物 134g0(4)取O. 12mol/L pH 8. 5的NaHCO3溶液1200mL，将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至7. 0，再向其中加入质量浓度为7%的CaCl2溶液IOOmL,搅拌均匀后静置20分钟，在3000rpm的条件下，离心10 分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1340mL。(5)制备 O. 07mol/L pH 7. O 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液 9. 1L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，14°C的条件下，先后经分子截留量为IOOK和IOK的膜进行超滤，待其体积减少到约I. 5L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉18g，经测其酶活力为 1.85X 106U/g。实施例3 (超滤收集菠萝蛋白酶)(I)将质量为IOOg的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为O. 9%的悬浮液，边搅拌边向其中加入含70g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于70°C水浴中，向其中缓慢搅拌加入固体氯乙酸120g，反应2. 8 小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在65°C下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。(2)称取50kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁28L，将其置于10°C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0098g、半胱氨酸O. 0017g、EDTA O. 014g，缓慢搅拌均匀。(3)取步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物76g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁25. 2L，取下层溶液，在 3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物 220g。(4)取O. 08mol/L pH 8. 2的NaHCO3溶液1800mL,将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至6. 8，再向其中加入质量浓度为6%的CaCl2溶液135mL，搅拌均匀后静置15分钟，在3000rpm的条件下，离心10 分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1960mL。(5)制备 O. 05mol/L pH 6. 8 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液 12L，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，10°c的条件下，先后经分子截留量为IOOK和IOK的膜进行超滤，待其体积减少到约2. 4L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉39g，经测其酶活力为 2. 25X 106U/g。实施例4 (超滤收集菠萝蛋白酶)(I)将质量为IOOg的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为I. O %的悬浮液，边搅拌边向其中加入含75g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于70°C水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入固体氯乙酸120g，反
9应2. 7小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在65°C下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。(2)称取40kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁24L，将其置于11 °C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0085g、半胱氨酸O. 0014g、EDTA O. 012g，缓慢搅拌均匀。(3)取步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物60g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁21. 2L，取下层溶液，在 3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物 203go(4)取O. IOmoI/L pH 8. O的NaHCO3溶液1620mL,将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至6. 8，再向其中加入质量浓度为5. 5%的CaCl2溶液130mL，搅拌均匀后静置12分钟，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1800mL。(5)制备O. 05mol/L pH 6. 8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液9L，用其将步骤⑷所得的菠萝蛋白酶溶液稀释，ll°c的条件下，先后经分子截留量为100K和IOK的膜进行超滤，待其体积减少到约I. 8L时，停止超滤，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得到干酶粉43g，经测其酶活力为 3. 12X106U/g。实施例5 (盐析收集菠萝蛋白酶)(I)将质量为IOOg的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成质量浓度为I. O %的悬浮液，边搅拌边向其中加入含75g溶质的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液。将该溶液置于70°C水浴中，向其中缓慢搅拌加入固体氯乙酸210g，反应2. 7 小时后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在65°C下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物。(2)称取40kg菠萝果皮，清洗后压榨，过滤除去大颗粒杂质后，得菠萝汁24L，将其置于11 °C的冷藏罐中，向其中加入粉末NaHSO3O. 0085g、半胱氨酸O. 0014g、EDTA O. 012g，缓慢搅拌均匀。(3)取步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物60g，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)中所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，得澄清的菠萝汁21. 2L，取下层溶液，在 3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物 203go(4)取O. IOmoI/L pH 8. O的NaHCO3溶液1620mL,将步骤(3)所得的菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物溶于其中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至6. 8，再向其中加入质量浓度为5. 5%的CaCl2溶液130mL，搅拌均匀后静置12分钟，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液1800mL。(5)将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液置于15°C的温度下，调节溶液pH至4. 5， 边缓慢搅拌边均匀地加入粉末(NH4)2S04360g，然后静置12小时，取下层溶液，在3000rpm 的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉46g，经测其酶活力为
I.41X106U/g。
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权利要求
1.一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)壳聚糖羧化衍生物的制备称取适量的壳聚糖溶胀在异丁醇中，制成一定浓度的悬浮液，边搅拌边向其中加入适量的饱和NaOH溶液，加完后在室温下继续搅拌30分钟，得到壳聚糖原料溶液，将该溶液置于一定温度下的水浴中，边缓慢搅拌边向其中加入适量的固体氯乙酸，反应一定的时间后，过滤，收集沉淀物，用乙醇反复洗涤后，在适当的温度下烘干，得到壳聚糖羧化衍生物；(2)菠萝汁预处理将菠萝果皮清洗后榨汁，过滤除去大颗粒杂质后，测量滤液体积， 然后将其置于适当温度下的冷藏罐中，向其中加入适量的粉末NaHSO3、半胱氨酸和EDTA(乙二胺四乙酸)，缓慢搅拌均匀；(3)菠萝蛋白酶的吸附称取适量的步骤(I)所得的壳聚糖羧化衍生物，用少量菠萝汁溶解，缓慢搅拌步骤(2)所得菠萝汁，向其中均匀加入溶解后的壳聚糖羧化衍生物，加完后继续搅拌5分钟，然后静置，直到上层溶液十分清澈，回收上清液，即是澄清的菠萝汁，可直接利用，取下层溶液，在3000rpm条件下,离心10分钟，收集沉淀物，得到菠萝蛋白酶-壳聚糖羧化衍生物复合物；(4)菠萝蛋白酶的洗脱配制适量的一定浓度和PH的NaHCO3溶液，将步骤⑶得到的复合物溶于NaHCO3溶液中，用饱和Na2CO3溶液调节pH至一定的范围，再向其中加入适量的一定浓度的CaCl2溶液,搅拌均勻后静置一定的时间，然后在3000rpm条件下,离心10分钟， 收集上清液，得到菠萝蛋白酶溶液；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥配制一定浓度和pH的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，用其将步骤(4)所得的菠萝蛋白酶溶液稀释一定的倍数，在一定的温度条件下，先由分子截留量为100K的超滤除去大分子杂质，再经分子截留量为IOK的超滤浓缩一定的倍数，收集浓缩液，真空冷冻干燥，得干酶粉；或将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析时，将菠萝蛋白酶溶液置于一定的温度下，调节溶液PH至一定的范围，边缓慢搅拌边向其中均匀地加入适量粉末(NH4)2SO4，然后静置一定的时间，取下层溶液，在3000rpm的条件下，离心10分钟，收集沉淀物，真空冷冻干燥，得干酶粉。
2.根据权利要求I所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(I)所述的壳聚糖异丁醇悬浮液的质量浓度在O. 8 I. I %的范围内；饱和NaOH溶液的用量在其溶质质量为壳聚糖的O. 65 O. 80倍范围内；固体氯乙酸的用量在壳聚糖质量的I. I I. 3倍的范围内；反应温度在65 75°C的范围内；反应时间在2. 5 3. O小时的范围内；烘干温度在60 70°C的范围内。
3.根据权利要求I所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(2)所述的菠萝汁预处理，过滤后的菠萝汁需置于8 14°C的冷藏罐中，单位体积菠萝汁中粉末NaHSO3、半胱氨酸和EDTA (乙二胺四乙酸)的加入量分别在3X 10_4 4Xl(T4g/L、5. 5Χ1(Γ5 6. 5Xl(T5g/L 和 4. 5Χ1(Γ4 5. 5Xl(T4g/L 的范围内。
4.根据权利要求I所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(3)所述的单位体积菠萝汁中壳聚糖羧化衍生物的加入量在I 3. 5g/L的范围内。
5.根据权利要求I所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤⑷所述的NaHCO3溶液的浓度在O. 05 O. 12mol/L的范围内，NaHCO3溶液的pH值在7. 8 8. 5的范围内，NaHCO3溶液的用量以质量计为菠萝酶_壳聚糖羧化衍生物复合物的7. 5 9倍的范围内，用饱和Na2CO3溶液调节壳聚糖-羧化衍生物复合物复溶后的溶液的pH值在6. 5 7. O的范围内，CaCl2溶液的质量浓度在5. O 7. 0%的范围内，CaCl2溶液的用量在每千克菠萝酶-壳聚糖羧化衍生物复合物加入CaCl2溶液O. 5 O. 75L的范围内，加入CaCl2溶液后需静置的时间在10 20分钟的范围内。
6.根据权利要求I所述的一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，步骤(5)所述的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度在O. 03 O. 07mol/L的范围内， Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的pH值在6. 5 7. O范围内，菠萝蛋白酶溶液的稀释倍数在4 8倍的范围内，超滤过程的控制温度在8 14°C的范围内，超滤的浓缩倍数在4 6倍的范围内；所述的将步骤(4)所得菠萝蛋白酶溶液，经盐析收集蛋白酶，盐析过程控制温度为 12 18°C，溶液pH值调节至4 5，盐析时粉末(NH4)2SO4的用量以质量-体积百分浓度计在18 25%的范围内，加完后静置的时间在8 16小时的范围内。
全文摘要
本发明提供了一种用壳聚糖羧化衍生物提取菠萝蛋白酶的方法，包括如下步骤(1)壳聚糖羧化衍生物的制备；(2)菠萝汁预处理；(3)菠萝蛋白酶的吸附；(4)菠萝蛋白酶的洗脱；(5)菠萝蛋白酶的精制和干燥；本发明的优点在于(1)所得酶活力高、安全可靠；(2)工艺对超滤膜污染小，同时生产效率高；(3)使菠萝蛋白酶的生产不受菠萝采收期的限制；(4)可以同时得到菠萝蛋白酶和菠萝清汁两种产品；(5)工艺灵活，可选超滤或盐析收集菠萝蛋白酶，使用盐析法时，菠萝蛋白酶溶液的体积只有原菠萝汁的1/20，所用盐量大大减少。
文档编号C12N9/50GK102586213SQ20121004782
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日 公开号201210047823.0
发明者李普旺, 韩志萍, 黄茂芳 申请人:中国热带农业科学院农产品加工研究所