专利名称：大肠癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种大肠癌易感基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估大肠癌发病的风险级别与程度，并作为预防和治疗大肠癌的参考指南。
背景技术：
大肠癌为结肠癌和直肠癌的总称，是我国常见的肿瘤，其发病率已位居恶性肿瘤谱的第3 5位，且呈继续上升趋势.引起大肠癌的危险因素很多，我国20多年大肠癌的流行病学研究明确了引起中国人大肠癌的危险因素主有肠息肉史、慢性腹泻、慢性便秘、 粘液血便、精神刺激史、饮不洁水史、阑尾手术史和家族肿瘤史等，这些因素又可归为环境因素与遗传因素两大类。最近的研究表明，大肠癌的发生与CYP2E1、hMLHl、GSTMU GSTTU MTHFR五个遗传易感基因密切相关。CYP2E1又称细胞色素P4502E1，是细胞色素P450酶体系的一员，是药物代谢的核心体系成员。该酶主要分布于肝脏，其最适底物多为亲脂性小分子化合物，包括苯、乙醇、氯乙烯、亚硝胺等，其中大部分为前致癌物和前毒物。CYP2E1能够将这些前致癌物和前毒物活化，从而对机体带来伤害。目前研究表明，CYP2E1基因上多态现象能改变其编码酶的表达水平与活性，因而影响到机体对环境毒物的代谢能力，导致多种癌症的发生。CYP2E1存在RsaI多态性，影响了 CYP2E1基因的转录。研究发现，CYP2E1 RsaI等位基因在大肠癌病例组和对照组中的分布具有显著差异，是大肠癌发生的易感因素，特别是在与酒精协同作用下，患大肠癌的风险进一步上升。CYP2E1 RsaI单核苷酸多态性位点的基因型有C/C、C/T、T/T三种，其中T/T基因型与大肠癌密切相关，该风险基因型携带者，CYP2E1基因表达的蛋白将使苯、乙醇、氯乙烯、亚硝胺等前致癌物转化为致癌物质，使个体患大肠癌的风险骤然升高。因此，CYP2E1 RsaI单核苷酸多态性位点是可以用于大肠癌的遗传检测与风险评估。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)属于II相代谢酶，能促进各种亲电子的化合物(包括环境致癌物及其中间代谢产物)与谷胱甘肽结合，形成易溶于水的化合物排除体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类，已知人类GSTs家族中GSTMl和GSTTl与肿瘤发生的关系最为密切。GSTMl具有present和null两个等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指结构基因缺失的纯合子，又称为空白基因型，缺乏GSTMl酶活性。GSTTl基因多态现象与GSTMl类似，亦存在缺乏GSTTl酶活性的缺失型基因。正常的GSTMl和GSTTl酶活性可能通过促进致癌剂的亲电作用及从体内的排除而保护易感组织，防止体细胞的DNA突变，而GSTMl或GSTTl基因的纯和缺失可能会降低或丧失机体代谢及排出致癌物的功能，从而具有较大的肿瘤危险性。因此,GSTMl、GSTTI基因缺失可以作为大肠癌发生的重要危险因素。MTHFR 的全称为 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH),是亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因。MTHFR作为一种还原酶，可将叶酸代谢通路中的5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，从而有利于叶酸生物学功能的发挥。此外，由于叶酸代谢通路与同型半胱氨酸代谢通路耦联，因此，MTHFR酶活性的正常发挥有利于保持血液中的同型半胱氨酸水平，不至于出现高同型半胱氨酸血症，为DNA甲基化和蛋白质甲基化提供甲基。此外叶酸的中间代谢产物在核苷酸合成过程中也有重要的作用，通过一碳单位代谢为嘌呤环的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化途径的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA甲基化修饰等，由此将引发癌症、心脑血管等多种病症。研究发现，MTHFR C677T单核苷酸多态性位点与大肠癌患病风险有关，当叶酸摄入和吸收水平高时，677T/T和677C/T基因型人群患大肠癌风险较低，这两类基因型被视为大肠癌保护基因，而677C/C基因型人群在MTHFR酶耐热性较强，不利于dUMP转变为dTMP，容易造成DNA损伤，大肠癌发生风险明显增强。综上所述，鉴于CYP2E1、GSTMl、GSTTl、hMLHl和MTHFR基因与大肠癌的发生有着重要的关联关系，可以做为预测和筛查大肠癌的潜在指征，通过对这些大肠癌易感基因的检测，能在预测预防和指导治疗大肠癌方面起到重要作用，并能大大降低大肠癌在中国人群中的发病概率。
发明内容
本发明基于CYP2E1基因上单核苷酸多态性位点RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上单核苷酸多态性位点T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present) ,MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T (rsl801133)这5个多态性位点基因型可作为评估大肠癌发病的致病因素和危险因子的基础上，研制出一种大肠癌易感基因检测试剂盒。该试剂盒包括检测CYP2E1 RsaI (rsl051740) , hMLHl Tl 151A，GSTMl，GSTTl，MTHFRC677T(rsl801133)5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)； PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等);DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等)。本发明试剂盒的组分和含量包括PCR 反应体系10 X PCR 反应缓冲液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul TaqDNA聚合酶0. 125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 产物纯化体系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul ExoI 酶 0. 375ul ;ddH203. 875ul。测序反应体系25%BigDye mix Iul ；3. 2uM DNA 测序引物 Iul ;125mMEDTA 溶液Iul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例I.大肠癌检测试剂盒的使用I、抽提DNA模板刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对(1)CYP2E1 RsaI 正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'CYP2E1 RsaI 反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)hMLHl T1151A 正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'hMLHl Tll5IA 反向引物5/ TGTCTTATCCTCTGTGACAATG3'(3)GSTM1 (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3'GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'(5)MTHFR(C677T)正向引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'PCR扩增的反应体系为10 X PCR反应缓冲液2. 5 ill ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 I (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u I,ddH20 19. 175u I ；CYP2E1反应条件为94°C预变性5min，然后94°C变性30s，58°C 30s退火，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C延伸10分钟。hMLHl反应条件为94°C预变性5min，然后94°C变性40s，55°C 40s退火，72°C延伸lmin，35个循环后，72°C延伸10分钟。GSTTU GSTMl反应条件为94°C预变性5min，然后94°C变性50s，56°C 50s退火，72°C延伸40s，32个循环后，72 °C延伸10分钟。3、PCR扩增产物纯化使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去离子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA测序反应使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物(1)CYP2E IRsaI 测序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'(2)hMLHl T1151A 测序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(3)GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(4)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'
(5)MTHFR(C677T)测序引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物Iul，25% Bigdye mixlul，3. 2uMDNA测序引物Iul，去离子水2ul。在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C, 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。5、基因型分析 熟悉DNA测序技术的本领域技术工程师能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。实施例2.筛查大肠癌风险人群的基因无创检测服务I.无创采样
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔粘膜上皮细胞取样，样本用细胞保存液常温保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法对采集到的口腔粘膜细胞进行DNA抽提。3.基因型检测使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的CYP2E1基因上Rsal(rsl051740), GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present), hMLHl基因上T1151A，MTHFR基因上C677T (rsl801133)的5个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这5个SNPs位点的基因型。4.大肠癌发病高危人群生物信息学分析及风险评估通过对受检者SNPs基因型的生物信息学分析和风险评估模型鉴定，出具大肠癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者CYP2E1基因上RsaI (rsl051740)，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，hMLHl基因上T1151A，MTHFR基因上C677T (rsl801133)这5个SNP位点基因检测信息、大肠癌风险评估结果和防治方案。根据受检者的风险等级，由医师向受检者详细说明并解读大肠癌易感基因无创检测报告单。
权利要求
1.ー种检测大肠癌易感基因的无创检测试剂盒，其组成成分为检测CYP2E1基因上单核苷酸多态性位点RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上单核苷酸多态性位点T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T(rsl801133)基因型的PCR特异引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%こ醇溶液、100%こ醇溶液、HIDI 溶液、ddH20 等。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特点在于所述的特异性引物对是指针对CYP2E1基因上单核苷酸多态性位点RsaI (rsl051740)，hMLHl基因上单核苷酸多态性位点T1151A，GSTMl基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T (rsl801133)，能特异性扩增出包含5个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特点在于所述的DNA测序引物是针对CYP2E1基因上 RsaI (rsl051740)，GSTMl 基因是否缺失(Null/Present)，GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，MTHFR基因上单核苷酸多态性位点C677T(rsl801133)，能通过DNA测序技术特异性检测出上述5个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求I所示的试剂盒，其所含的5对特异性引物序列如下(1)CYP2E1RsaI 正向引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3; CYP2E1 RsaI 反向引物5' CATTGGACTGGATGGTGC3'(2)hMLHl T1151A 正向引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3' hMLHl T1151A 反向引物5' TGTCTTATCCTCTGTGACAATG3'(3)GSTMl (Null/Present)正向引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3' GSTMl (Null/Present)反向引物5' GTTGGGCTCAAATATACGGTGG3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3' GSTTl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3' (5)MTHFR(C677T)正向引物5'AGGGAGGCTTCAACTACGC3' MTHFR(C677T)反向引物5' GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所含的5条DNA测序引物序列如下(1)CYP2E1RsaI 测序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3;(2)hMLHl T1151A 测序引物5' ACAGACTTTGCTACCAGGACTTG3'(3)GSTMl (Null/Present)测序引物5' GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC3'(4)GSTTl (Null/Present)测序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3' (5)MTHFR(C677T)测序引物5'GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3'。
6.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 (1) 0 反应体系10父？0 反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 O. 2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶O. 125ul，20uM特异性引物对，每条引物各O. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 产物纯化体系川/111SAP 酶O. 75ul，10U/ul ExoI 酶0. 375ul，ddH20 3.875ul。
(3)测序反应体系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA测序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul，.100% こ醇溶液 15ul，70% こ醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
全文摘要
本发明提供了一种检测大肠癌易感基因的无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测5个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应体系、PCR产物纯化体系、DNA测序反应体系等。本发明的试剂盒通过检测与大肠癌发生密切相关的5个单核苷酸多态性位点的基因型来评估中国人群中大肠癌患病的风险级别与程度，并根据受检者基因检测结果从基因维度指导中国人群有针对性的预防大肠癌的发生，旨在降低大肠癌的发病概率。本发明所使用样本为口腔粘膜脱落细胞，采用口腔无创采样法采集样本，该法无痛、无创、并能避免交叉感染。基因测序过程采用ABI3730型测序仪，方法简便，结果准确，可靠，适合推广。
文档编号C12Q1/68GK102703581SQ20121005364
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者潘加奎, 郑俊斌 申请人:解码(上海)生物医药科技有限公司