专利名称：一种用于检测基因变异的pcr引物设计方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子诊断技术领域，具体 涉及一种全新的、高效易控的PCR引物设计方法，以及利用该方法设计引物参与的癌症基因检测试剂盒和耐药基因检测试剂盒，利用该方法生产的试剂盒灵敏度高、重复性好、非常稳定可靠，适用于临床癌症基因检测和筛查，以及耐药基因的检测。
背景技术：
基因变异在生物体中时刻发生，有的变异是无意义的，它不影响生物体正常生长，但是，有一些变异后果非常严重，给人类的生存带来威胁。现代分子生物学实验证实癌症的发生是由于基因重组、突变或缺失等变异造成的。也有充分证据证明，病原微生物在某些条件下基因变异可以获得某种耐药抗性，给临床治疗带来巨大麻烦。例如HBV拉咪呋啶耐药基因突变、HIV耐药基因变异、TB利福平耐药基因变异、TB异烟肼耐药基因变异、TB乙胺丁醇耐药基因变异等。癌症，也叫恶性肿瘤，它可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终可能由于器官功能衰竭而死亡。人体内存在原癌基因和抑癌基因。原癌基因主管细胞分裂、增殖，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等保守。抑癌基因负责控制细胞生长和增殖。平时，原癌基因和抑癌基因维持着平衡，但在致癌因素作用下，原癌基因的力量会变大，而抑癌基因却变得弱小，导致细胞癌变。每年，癌症在全球致死700万人，我国也有100万人因此失去生命。为了降伏这一绝症，科学家们付出了极大努力。但直到现在，还是没找到攻克癌症的办法。目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要作用靶点。EGFR的靶向药物包括EGFR抗单克隆抗体药爱必妥、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙和特罗凯。这些药物能通过抑制肿瘤发生发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。EGFR基因突变与酪氨酸激酶抑制类靶向药物Iressa(易瑞沙)和Tarceva(特罗凯)等的治疗疗效有显著相关性。大多数EGFR基因突变患者的靶向药物治疗效果显著。中国人非小细胞肺癌患者EGFR基因突变率为30%左右，为明确是否进行相应的靶向治疗，有必要进行EGFR基因突变的检测。非小细胞肺癌等肿瘤患者在进入个体化靶向治疗疗程之前应进行EGFR突变检测，可为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险、减轻患者负担。但是，临床试验表明这些靶向药物仅对部分病人有显著疗效。进一步的研究发现肿瘤组织中K-ras基因发生突变(体细胞突变)的病人对此类靶向药物存在完全耐药。因此，检测病人K-ras基因是否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种H_ras、K-ras和N_ras,分别定位在11、12和I号染色体上。作为原癌基因的ras基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因，ras基因通过突变而激活。其中，K-ras则对人类癌症影响最大，它好像分子开关当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则不受上游EGFR的信号影响，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。这也是具有突变型K-ras基因患者对抗EGFR药物治疗无效的理论基础。K-ras突变的最常见的方式就是点突变，多发生在N端第12、13和61密码子，占所有突变率的90%以上。K-ras基因的突变导致细胞逃逸凋亡，这种异常在胰肠癌、大肠癌、肺癌等肿瘤组织中发生率较高。据国外文献报道，最高为胰外分泌腺癌，达90%，结肠癌为
40% 50 %，肺癌和膀胱癌为40 %，而胃癌较低在10 %以下。因此这几种癌症中K-ras基因野生型患者使用易瑞沙的疗效也比较显著，特别是结肠直肠癌，美国癌症综合网络(NCCN)已把K-ras突变的检测列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。研究表明，BRAF基因突变的患者接受EGFR-TKI药物治疗的有效率低。而且，BRAFV600E突变可导致部分K-ras基因野生型患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感。因此检测肿瘤患者BRAF基因突变情况可用于指导EGFR-TKI的靶向用药。BRAF基因突变被 发现存在于黑色素瘤、大肠癌等多种恶性肿瘤中，可结合该患者EGFR、KRAS基因突变的检测信息制定出最为适合病人个体的肿瘤治疗方案。为临床医生用药提供用药科学依据，降低医生治疗风险以及患者经济负担。另外，随着抗生素药物滥用和个别病原微生物基因易变性，导致过去容易治疗的感染性疾病变成难以治愈的疾病，例如超级细菌、多耐药结核；还有一些病毒，如HBV、HIV,在用药数月，甚至有的数周就可产生耐药性。由于没有进行基因变异监测，传统的治疗方案面对基因变异时，不能及时改变治疗策略往往导致治疗效果差、病情持续恶化的情况出现。由于上述基因变异存在，极大的影响了患者的生存和生活质量。科学工作者发明了许多检测基因变异的方法，具体包括PCR-限制性酶切分析、PCR-SSCP分析、PCR-测序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-LDR、连接酶反应LDR、PCR-HRM分析、ARMS-PCR等。其中最为常用方法为PCR-限制性酶切分析、PCR-测序分析、PCR-基因芯片分析、PCR-HRM分析、ARMS-PCR。PCR-限制性酶切分析是针对位点明确、且突变型与野生型在序列上至少存在一种酶切位点差异。PCR完成后，用该酶进行酶切后，测序鉴定。耗时、繁琐，但灵敏度高。对于有些样品由于野生型和突变型之间无差异酶切位点，导致该方法不可用。PCR-测序分析是突变检测的金标准方法，可发现未知变异位点。实验周期久、灵敏度低(10%左右^PCR-基因芯片分析是针对大量已知突变位点的有效方法，但是其灵敏度仅能做到5% 10%，且成本较高。PCR-HRM分析成本低、通量大，由于不能自动化分析结果，需实验人员判读，仅在科研中有所应用。ARMS-PCR是目前开发基因变异最为常用技术，系统中包含通用引物和变异区域特异引物(以后简称“变异引物”)。通用引物可与野生型和突变型同时结合、变异引物与基因变异区域完全互补，与野生型仅在3端有I 5个碱基的差异，因此基因变异的检测完全依赖于变异引物的设计，变异引物的设计也决定了试剂盒的灵敏度和特异性(见图I)。由于变异引物与野生型模板仅有I 3个碱基不互补，也存在一定几率结合而发生错误引导的PCR合成，这种结合的概率很高，约为O. 1% 1%。一旦发生此类反应，则结果和试剂盒的可靠性将大大下降。影响此类反应的因素主要是核酸提取残留盐离子、模板浓度过高两个，这两个因素在实际应用中不是可控因素，因此无法在研究测试初期通过优化反应条件来降低。欧洲DXS基于ARMS-PCR/Scorpion系统开发的Κ-ras试剂已获得CE认证，并在SFDA提出注册申请。因此基于ARMS-PCR开发新的分子诊断试剂盒是一个较为可靠的方法。由于基因变异，面对复杂的基因变异，传统的分子诊断方法显得很无力，这是因为在此类基因变异样品中，含有大量的野生型背景，从而为鉴别这些重要基因是否发生后果严重的变异带来巨大麻烦。本发明旨在解决在大量野生型背景下，变异基因检测引物的设计方法和试剂盒，为肿瘤患者和病原微生物感染者提供可选的、有效的诊断手段。本发明在ARMS-PCR基础上开发新一代检测方法，与ARMS-PCR/Scorpion系统比较，本发明的优点具体为I.野生型背景是突变型1000倍以上，仍然可以检出突变型；2.本方法可与实时荧光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子杂交、PCR-基因芯片分析等技术联合，用于分子诊断领域。
发明内容
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种全新的、高效易控的PCR引物设计方法，以及利用该方法设计引物参与的癌症基因检测试剂盒和耐药基因检测试剂盒，利用该方法生产的试剂盒灵敏度高、重复性好，非常稳定可靠，适用于临床癌症基因检测和筛查，以及耐药基因的检测。本发明包含三项相互独立而又关联的内容1. 一种用于基因变异的PCR引物设计方法，其特点是易于设计，可控性高且扩增灵敏度高；2.提供了一种全新的基因变异检测试剂盒的设计理念；3.利用I和2所述内容开发的基因变异检测试剂盒，该试剂盒与传统测序检测基因变异比较，具有灵敏度高(100倍以上)、特异性强、时间短(3小时内完成检测)、操作步骤少的优点。本发明的基因变异的PCR引物设计方法，其特征在于ARMS-PCR引物设计中，在通用引物中附加一段与基因变异区域的野生型完全互补序列，该序列在PCR退火时，会优于针对变异基因设计的变异基因检测引物退火到野生型上。本发明的最终目的是通过设计引物扩增目标序列，并用测序方法检测K-ras密码子12/13和61的突变情况，结合两者突变的情况，指导肿瘤患者对易瑞沙、特罗凯等药物的治疗。根据本发明的基因变异检测PCR引物设计方法，其特征在于通用引物可以引导一个DNA链合成，当此次合成DNA链野生型时，“变性一退火”后，可发生自身引导合成的DNA链内折叠，阻碍变异引物与野生型模板结合，称之为阻遏ARMS-PCR系统。在此阻遏ARMS-PCR系统中，通用引物的5’端附加一段与变异引物高度同源、但与变异基因的野生型完全互补的寡核苷酸序列(见图2)，该序列在分子内优先与变异基因的野生型结合，从而抑制或阻碍了变异引物与野生型结合的几率(见图3)，解决了变异引物特异性问题，从而极大的提高了变异弓I物的灵敏度。具体而言,如图2所不,本发明的通用引物分为A、B两部分，B部分为正常的PCR引物，A部分为与变异引物C相互竞争结合位点的寡核苷酸序列。通用引物B段与野生型模板D段和突变型模板F段完全互补，是PCR合成的一个引导链；变异引物C与突变型模板G’完全互补，是PCR合成的另一个引导链。H与H’区是设计荧光探针和杂交探针的位置；E和E’是野生型发生基因变异的位置。G和G’是E和E’发生基因变异的新序列。在适当的条件下，A部分与野生型E’结合效率高于变异引物C ;变异引物C更易于G’结合。特别是，反应完成第I个循环后(如图3所示)，通用引物合成的野生型DNA链在“变性一退火”过程中，会自动形成发卡结构，从而屏蔽掉变异引物的结合位点。此类分子内折叠的效率通常比分子间结合效率高10倍以上，因此能取得较好的屏蔽效果。本发明公开的引物设计方法中引物设计参照通用的引物设计原则不允许引物间或/和引物内3’端出现5个以上碱基互补；变异引物的长度在15bp 25bp之间，退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在42摄氏度 60摄氏度之间；优选变异引物的长度在16bp 22bp之间,退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在48摄氏度 52摄氏度之间；通用引物B区的长度在15bp 25bp之间,退火温度(用软件Primer Express3. O计算)在42摄氏度 60摄氏度之间；优选通用引物B区的长度在16bp 20bp之间，退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在48摄氏度 52摄氏度之间；通用引物A区的长度在IObp 18bp之间,退火温度(用软件Primer Express 3. O计算)在37摄氏度 55摄氏度之间；可能发生变异的区域设计在通用引物A区的较中间的位置。 依据本发明的引物设计方法设计的引物，可用于实时荧光PCR、PCR_ELISA、PCR-反向分子杂交、PCR-基因芯片分析等实验中。与其他方法联用，可开发多种基因变异检测试剂盒。根据上述方法，本发明可以与实时荧光PCR技术设计各种用于基因变异(癌症基因、耐药突变等)检测PCR试剂盒，其中包括dNTPs、二价阳离子、耐热DNA聚合酶、缓冲体系、引物、探针等常规试剂，其特征在于、耐热DNA聚合酶使用量为(O. 5 1)U/测试、二价阳离子浓度在(O. 5 I. 5)mM、KCl浓度为30 50mM、引物和探针各IOP/测试、10% Gly0PCR循环参数中退火温度要高于变异引物Tm值10摄氏度 15摄氏度，保证变异引物的严谨性和封闭的效果。上述方法或应用，优先用于K-ras基因突变、EGFR外显子18 20基因变异、Braf基因突变等的分子诊断。上述方法或应用，也优先用于HBV耐药、HIV耐药、TB耐药等的分子诊断。
图I是通用ARMS-PCR工作原理；图2是本发明中阻遏ARMS-PCR中弓丨物设计原理；图3是阻遏ARMS-PCR工作原理。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I 一种鉴定K-ras密码子12/13突变情况的方法
I.提取肿瘤患者组织基因组DNA ;2.进行PCR扩增，20 μ I PCR反应体系如下待测肿瘤组织基因组DNA50 lOOng，Taq 酶 O. 125μ 1，上下游引物和探针(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，10XPCR 缓冲液(含Mg2+) 1.5 μ 1，甘油10%，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为95°C变性5min，随后95°C变性10sec，58°C退火延伸35sec，进行45个循环，最后37°C延伸Imin ;在58°C进行荧光信号收集。3. PCR结果分析a. CT < 40，判定为阳性；
d. CT > 40，判定为阴性。
权利要求
1.ー种用于检测基因变异的PCR引物设计方法，具体为在基因高度同源和保守的区域设计正向PCR通用引物，此通用引物的5’端附加一段与基因变异区域野生型完全互补的6 20个碱基的寡核苷酸；在变异基因的位置设计与变异基因完全互补的反向引物。
2.如权利要求I所述，正向PCR通用引物所附加的寡核苷酸更优选择为8 15个碱基。
3.如权利要求1、2所述，本方法可与现行用于临床检验的其它技术联合使用，这些技术包括但不限于实时荧光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子杂交、PCR-基因芯片分析等。
4.如权利要求1-3所述的应用，本方法适用于人癌症基因、耐药基因的检测，癌症基因包括但不限于EGFR 18密码子的突变基因(突变类型包括G719A、G719S、G719C)、EGFR19密码子的基因变异(基因变异类型包括2235-2249del、2235-2252 > AAT (complex)、2236-2253del、2237-2251del、2237-2254del、2237-2255 > T(complex)、2236_2250del、2238-2255del、2238-2248> GC(complex),2238-2252 > GCA(complex)、2239_2247del、2239-2253del、2239-2256del、2239-2248delTTAAGAGAAG> C(complex),2239-2258 >CA (complex)、2240-2251del、2240-2257del、2240-2254del、2239_2251 > C(complex)),EGFR 20密码子的基因变异(基因变异类型包括T790M、S768I、2307_2308ins9、2319-2320ins CAC、2310_2311insGGT)、EGFR 21密码子的基因变异(基因变异类型包括 L858R、L861Q)、K-ras 12 密码子突变(Glyl2Asp (GGT > GAT)、Glyl2Ala(GGT > GCT)、Glyl2Val (GGT > GTT)、Glyl2Ser (GGT > AGT)、Glyl2Arg (GGT > CGT)、Glyl2Cys (GGT> TGT))、K-ras 13 密码子突变(Glyl3Asp (GGC > GAC))、K-ras 61 密码子突变(Gln61Lys(CAA > AAA)、Gln61Lys(CAA > AAA)、Gln61Arg(CAA > CGA)、Gln61His(CAA >CAT)、Gln61Leu(CAA > TTA))、B-raf基因突变(基因变异类型包括V600E);耐药基因包括但不限于HBV拉咪呋啶耐药、TB利福平耐药、TB异烟肼耐药、TBこ胺丁醇耐药等。
5.ー种PCR扩增试剂盒，其中包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、引物，其特征在干对于野生型的扩增，其中所述正向通用引物附加寡核苷酸优于反向引物与野生型模板结合而阻止野生型扩增；对于突变型的扩增，由于所述正向通用引物附加寡核苷酸与之不完全配对，因此反向引物可以结合到突变基因模板上进行扩增。
全文摘要
本发明属于分子诊断技术领域，具体为一种用于检测基因变异的PCR引物设计方法及试剂盒。根据本发明提供的PCR引物设计方法，在大量野生型基因存在的情况下，可选择性扩增变异基因的目的片段，从而实现变异基因的检测。该方法解决了传统测序方法灵敏度高不足、基因芯片方法非特异性杂交的问题，大大提高了变异基因的检测灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK102816834SQ20121006383
公开日2012年12月12日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者楼敬伟, 李炳亮 申请人:上海宝藤生物医药科技有限公司