专利名称：用于生产脂肪酶的方法、能产生所述脂肪酶的转化解脂耶氏酵母细胞以及它们的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过使用产生耐酸的重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母(YairowiaIipolytica)细胞来生产脂肪酶的方法，该方法允许生产能用作药物的脂肪酶；本发明还涉及一种过度产生耐酸重组体脂肪酶的解脂耶氏酵母菌株及其应用。
背景技术：
人类每日摄取的食品主要由脂类、蛋白质和糖组成。在它们被吸收之前，所有这些组成要经受消化道内的酶的催化水解。这些酶中任何一种的缺乏可以因此引起消化紊乱， 并且导致相当严重的营养不良。即，例如，在一些病态情况的病例中，比如囊性纤维化或外分泌胰腺的不足与胰脂酶缺乏有关。为校正这些缺乏，通常建议口服给药胰腺提取物。然而，这些疗法的效率受限于如下事实这些提取物中所含的酶(脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)会因胃介质的酸性而快速失活。因此，有人建议使用抗胃环境的脂肪酶制剂，比如，其例子有通过基因工程生产的哺乳动物胃脂肪酶制剂，比如申请人为于文尼尔研究股份公司(INSTITUT DE RECHERCHEJOUVENIAL SA)的法国专利申请公开2699179描述的制剂、或者在酸性介质中具有适当活性的微生物脂肪酶制剂[ZENTLER-M0NR0 等，Pancreas, 7，311-319 (1992)]。在酸性介质中有活性的微生物脂肪酶中，可能会尤其提到真菌脂肪酶，比如来自欧诺比假丝酵母(Candida ernobii) [Y0SHIDA 等,Biochim. Biophys. Acta. ； 154,586-588(1968)]、来自星状丝孢酵母(Trichosporon asteroid)[DHARMSTHITI 等，Biotechnol. Appl. Biochem.，26,111-116 (1997)]、来自爪睡根霉(Rhizopus javanicus)[UYTTENBR0ECK 等，Biol. Chem. Hoppe Seyler, 374, 245-254, (1993)]、或来自解脂耶氏酵母[HADEBALL，Acta Biotechnol.，2，159-167(1991) ;NOVOTNY 等，J. Basic Microbiol. 28,221-227(1988)]的那些真菌脂肪酶。除了它们在酸性pH下的活性之外，这些脂肪酶当它们的底物存在时，具有通常的抗蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶)消化的特性，并且具有抵抗胆盐作用的特性(当存在IOmM牛磺胆酸钠时它们的活性可保持)。已经有人描述了解脂耶氏酵母用于生产所研究基因的应用。因此，申请人为INRA和CNRS的专利申请EP 1108043描述了包含所研究基因的表达盒和Zeta序列(zetasequences)的整合载体的应用，该整合载体对应于解脂耶氏酵母Ylt逆转录转座子的LTR序列。这样的表达载体允许将插入所研究基因的数个拷贝非同源地并且分散地整合入缺乏Zeta序列的解脂耶氏酵母菌株的基因组DNA中。该系统尤其已经用于将编码脂肪酶的LIP2基因整合入解脂耶氏酵母DNA，并且已经允许在培养基条件(未详述)下，与未转化的菌株相比，转化菌株分泌的脂肪酶量高出10至15倍。
其他研究描述了如专利申请EP 1108043所述的相同表达载体用于在解脂耶氏酵母中产生重组体脂肪酶的应用(国际申请WO 01/83773 ;PIGNEDE等，Journal ofBacteriology, vol. 182，No. 10，p. 2802-2810(2000)以及 PIGNEDE 等，Applied andEnvironmental Microbiology, vol. 66, No. 8, p. 3283-3289 (2000))。具体为-国际申请TO01/83773，申请人为法国米奥里大药厂(Laboratoires MAYOLYSPINDLER)，描述了解脂耶氏酵母MS4克隆(CNCM 1-2294)的产生，该MS4克隆包含被整合入其DNA的10个拷贝的LIP2基因表达盒、并且描述了其用于生产脂肪酶的应用，产率为每升培养液上清液含有0. 5g左右的脂肪酶、以及使用橄榄油作为底物测得的12，000U/ml的催化活性，其中一个活性单位对应于每分钟能够催化释放I U mol脂肪酸的酶量，即，超过原始菌株200倍。然而，该申请所述的产生脂肪酶的方法的主要缺点在于其使用了含有细菌用蛋白胨(bactopeptone)或细菌用胰胨(bactotryptone)的培养基。这些未被表征并且含有各种蛋白质水解物的产物通常用作氮源和碳源。因此，该申请所述的方法不可能得到可以直接用作药物的脂肪酶。
-PIGNEDE 等(Journal of Bacteriology, 2000)更具体地表征了被解脂耶氏酵母(POld菌株)LIP2基因编码的胞外脂肪酶。在本文中描述了下面的研究内容 从各种野生型菌株(缺乏Yltl的POld和含有Yltl的E150)以及从包括JMY184(P01d-6-15)和JMY279(P01d-6-17)在内的各种重组菌株分泌脂肪酶的情况，以及 转化体JMY184的脂肪酶过度产生情况。PIGNEDE等的文章比较了被野生型菌株、突变株和根据如上所述方法(国际申请W001/83773)得到的重组菌株的脂肪酶生产情况。野生型菌株分泌的脂肪酶为30 50U/mL，而在N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NNNG)的作用下得到的突变株在优化培养条件下产生的脂肪酶多出25倍，即1200U/mL的脂肪酶，该优化的培养条件涉及含有蛋白胨的培养基(预培养培养基)和含有乳清的培养基(发酵培养基)(也请参见DESTAIN等，1997)。借助于该表达盒中的包含受P0X2启动子和非同源整合调节的LIP2基因的呈多拷贝和呈分散方式的构造，得到了重组菌株。PIGNEDE等得到了稳定的转化体(例如菌株JMY184)，其在未优化的条件下，即在YPDH培养基(包含10g/L酵母浸膏、10g/L细菌用蛋白胨、10g/L的葡萄糖和10g/L的橄榄油)中产生2000U/mL的脂肪酶，相当于约0. 5g脂肪酶/L上清液。以如上所述相同的方式，PIGNEDE等和DESTAIN等描述的脂肪酶制剂不适用于医疗用途，并且尤其不适合于临床批量的制备，因为它们的生产需要使用含有蛋白胨或乳清的培养基。-在其文献中，PIGNEDE的研究小组(Applied and Environmental Microbiology,2000)研究了用包含LIP2基因表达盒的载体转化的解脂耶氏酵母菌株。该作者发现，对于8种这样的转化体，LIP2基因表达盒的拷贝数在6和16之间(平均10个拷贝)，这导致在不同的基因座处所述表达盒发生2至15次整合。该JMY184菌株因此包含12个拷贝的在4个不同的基因座处整合的LIP2基因表达盒。此外，该作者更具体地研究了该JMY184转化体。他们确认，JMY184菌株在丰富的YPDH培养基(含有细菌用蛋白胨)上培养会产生0. 5g脂肪酶/L上清液，使用橄榄油作为底物进行测量时，该上清液的活性为1500U/mL (相对地，野生型菌株POld为50U/mL)。根据这些数值可以推定脂肪酶的比活性为约3000U/mg。该作者另外报告到，优化JMY184菌株在发酵罐中的脂肪酶生产可以得到活性高达10，000U/mL的制品。然而，作者未公开得到该结果的培养条件。在该文献中，作者另外研究了这些转化体在培养基中的稳定性，尤其是JMY184克隆的稳定性，并且显示它们的稳定性为120代。PIGNEDE等认为，为了优化脂肪酶的生产，待考虑的因素是转化体的稳定性和培养条件。此外，他们显示，在整合的LIP2基因的拷贝数和脂肪酶的过度产生之间有强相关性。然而，对于脂肪酶的生产，在该文献中公开的仅有的培养基是含有蛋白胨的培养基，比如丰富的YPDH培养基。生产脂肪酶的现有技术方法，即使它们使得到提高的脂肪酶产率成为可能，也不适用于适合医疗目的的脂肪酶的生产。实际上，通常使用的培养基全部含有未被表征的动物来源的混合物和/或产物，比如蛋白胨、胰胨或乳清。因此需要开发允许生产适合医疗使用的重组体脂肪酶制品的体系。
发明内容
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为了解决该问题，本发明人开发了用于生产脂肪酶的方法，其与现有技术生产的方法相比能更好地满足这些需要。更具体地讲，本发明人开发了一种用于生产脂肪酶的方法，其中使用的培养基不含上述产物，即，培养基不包含动物来源的产物并且不包含未被表征的混合物比如蛋白胨、胰胨或乳清。本发明人另外还筛选出一种新颖的用于生产脂肪酶Lip2的重组体解脂耶氏酵母菌株，该菌株与所述方法相结合可以显著地提高脂肪酶的产率。因此，本发明的主题是一种使用被载体转化的解脂耶氏酵母菌株用于生产脂肪酶的方法，该载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒，其特征在于，使用的培养基不包含动物来源的产物或未被表征的混合物，比如蛋白胨、胰胨或者乳清。更具体地说，本发明的主题是一种用于生产脂肪酶的方法，该方法包括a)在允许脂肪酶产生的条件下用于培养使用表达载体转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤，所述载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒；b)用于回收由所述培养基的上清液产生的脂肪酶的步骤；该方法的特征在于，用于培养的步骤a)是在不含由动物来源的蛋白质材料(例如乳清)或它们的酶消化产物(例如胰胨或蛋白胨)所组成的动物来源的产物或未被表征的混合物的培养基中进行。根据所述方法的优选实施方式，根据步骤a)的所述培养基包含-作为氮源的无机氮，并且优选硫酸铵；-碳源，其选自于碳水化合物来源的碳源，多元醇例如甘油、以及脂类来源的碳源例如脂肪酸和甘油酯；以及-无机盐、微量元素和维生素。根据所述方法的另一个优选的实施方式，步骤a)包括al)用于在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中预培养如上限定的转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤；以及a2)所述细胞的发酵步骤，包括在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中的细胞生长期，以及在含有选自短链、中链或长链三酸甘油酯的脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶合成期。于是，发酵在允许细胞生长的第一种情况下进行，例如在存在碳水化合物来源的碳源时进行，以及在允许生物合成所述脂肪酶的条件下的第二种情况下进行，例如在存在脂肪酸型的化学诱导剂作为唯一碳源时进行，该化学诱导剂包括比如短链三酸甘油酯(例如三丁酸甘油酯)、中链三酸甘油酯(比如三辛酸甘油酯)或长链三酸甘油酯(例如橄榄油或者三油酸甘油酯)。优选进行发酵时，常数p02为15% 25%，并且优选pH小于6. 5。例如发酵可以在下述条件下进行空气流量约为Ivvm,其中一个vvm单位是每液体体积每分钟I体积的空气(例如，对于一个30升的发酵罐，Ivvm等于301/min ;而对于一个5升的发酵罐，Ivvm等于 51/min)。根据本实施方式的优越特征，进行预培养步骤al)直至OD6tltlnm值为3 10每lmL，并且在发酵步骤a2)中，当培养液的OD6tltlnm值达到60 70每ImL时开始所述脂肪酶合成期。、根据本实施方式的另一个优越特征，当OD6tltlnm值达到300 350每毫升时启动步骤b)。另外步骤b)可以包括bl)从所述培养液上清液中分离脂肪酶；b2)在步骤bl)中得到的脂肪酶的纯化。这两个步骤按本领域已知的传统方法进行物理分离(过滤、层析、离心法)或者物理化学分离法(沉淀法)。从上清液中分离脂肪酶可以由本领域的技术人员进行，例如通过选自中空纤维切向过滤、正面过滤以及连续式或分批式离心法的技术进行。脂肪酶的纯化尤其包括降低生物载荷(bioload)，S卩，微生物的存在，并且可以通过本领域的技术人员所熟知的任何合适的纯化技术进行，例如选自过滤、分级沉淀、离子交换层析、疏水作用层析和凝胶过滤层析的技术。任选地，用于生产根据本发明的脂肪酶的方法也可以包括浓缩或富集步骤，该步骤包括提高制品中脂肪酶的浓度。这样的步骤例如可以在提纯步骤之后进行。也可以与该提纯步骤同时进行。根据本发明的生产方法尤其有可能以约I至3g的纯化脂肪酶每升培养液上清液的量生产出重组体脂肪酶。在特别优越的方式中，根据本发明的方法允许生产催化活性大于培养液上清液的15，000U/mL的重组体脂肪酶制品。优选所述制品的活性大于培养液上清液的20，000U/mL。在pH 6时通过使用三辛酸甘油酯作为底物测定这些数值。脂肪酶制品的该活性值对于本申请上下文的药剂开发尤其重要。实际上现在可以给药剂量降低的根据本发明方法生产的脂肪酶，同时保持足够的效力以得到欲期的治疗效果，例如可以是与脂肪酶缺乏有关的胰腺不足相关的脂肪吸收障碍的矫正。现在根据本发明的方法，在无需动物来源的产物的情况下通过使用重组体解脂耶氏酵母菌株可以生产出脂肪酶Lip2，该事实成为重要的优势，并且大大地促进了脂肪酶用于医疗目的的应用。用于获得在本发明的方法中使用的重组体解脂耶氏酵母细胞的表达载体是一整合载体，其具有至少一个拷贝的LIP2基因和用于调节表达的元件。然后该载体可以被整合入质粒DNA或者整合入酵母的基因组DNA。整合载体的一个尤其优选的例子是如国际申请WO 01/83773所述的载体JMP6或载体JMP10。载体JMP6包含有LIP2基因的表达盒，其编码解脂耶氏酵母Lip2脂肪酶的Lip2p前体，其上游设置用于酰基CoA氧化酶AC02的称为P0X2的解脂耶氏酵母启动子。载体JMPlO也包含LIP2基因，其上游是用于Lip2脂肪酶的解脂耶氏酵母启动子。这两种启动子可被三酸甘油酯和脂肪酸诱导。在这些载体中的各个中，表达盒和启动子被设置在如上所述Zeta序列之间。该整合可以是靶向整合，即针对某位点，或者是随机的整合。因此，当转化的解脂耶氏酵母菌株不含Zeta序列时(例如，POld菌株的情形)，表达盒的整合分散于所述菌株基因组DNA中。另一方面，当解脂耶氏酵母菌株包含Zeta序列(例如，E150菌株的情形)时，整合主要针对这些序列。根据所述方法的另一个优选的实施方式，转化的解脂耶氏酵母菌株优选是称为YL-LIP2-6C的菌株，该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,C. N. C. M.,法国巴黎道可图罗斯大街28号，企业邮递特投15，邮编75724)，保藏编号为1-3542。该YL-LIP2-6C菌株遗传学稳定。 为本发明的目的，在此使用的术语“稳定”、“遗传学稳定”、“基因稳定”及其变化表述是指，对于将所研究的核酸整合入克隆的DNA而言相同数量的基因座至少保持30代。选用30代这一数量作为计算遗传稳定性的基础，是因为本发明人注意到该数量对应于细胞群的许多次复制，足以允许使用一方法进行脂肪酶的生产，所述方法包含至少一个预培养重组体解脂耶氏酵母细胞的步骤和一个在适当的发酵条件下生产脂肪酶的步骤。为本发明的目的，世代被定义为细胞群的复制，并且可以根据公式Y = XX 2g计算，其中Y是在时间t时的细胞群(例如，表示为细胞密度)；X是在时间h时的启始细胞群，并且g代表细胞群从数值X至数值Y所必需经过的传代数。优选在至少30代以后，当至少90%的被分析菌落含有与起始克隆相同数量的所研究基因的基因座时，克隆被认为是遗传学稳定的。因此，作为明显的例子，克隆YL-LIP2-6C被认为是稳定的，这是因为在100代后，几乎100%的被分析菌落含有6个LIP2基因的基因座(一个基因座对应于用于整合LIP2基因的表达盒的内源性LIP2基因+5个基因座)。令人惊讶的是，当根据本发明的方法使用这一特殊的菌株时，本发明人成功地大量地生产出重组体脂肪酶，并且在整个所述生产期间进行较好的控制。本发明人的确成功地提高了脂肪酶的产率，并且尤其能够得到I 3g纯脂肪酶每升培养液上清液的产率。他们也能得到活性接近20，000U/mL的脂肪酶制品。为本发明的目的，脂肪酶的活性对应于其酶催化活性。脂肪酶溶液的催化活性表示为单位(U)每毫升分析溶液。比活力表示为单位(U)每毫克纯化蛋白质(脂肪酶)。一个单位相当于每分钟能够催化释放I y mol脂肪酸的酶量。脂肪酶的比活力根据用作底物的三酸甘油酯的性质变化。除提高脂肪酶的产率之外，本发明人也能提供生产方法较好的再现性，提高最终产品的均一性，并且改善用于纯化脂肪酶的条件。因此，这些各种改进可以获得满足医疗用途所需条件的脂肪酶。事实上，在他们的研究的上下文中，本发明人现在已经观察到，Lip2脂肪酶在pH值大于3并且直至pH值接近8的范围内具有活性，最优的活性在pH 5 6之间。另一方面，其在pH 3或者pH 8.5下保温2小时会不可逆地失活。经分析，Lip2脂肪酶的比活力也与不同的底物有关，并且本发明人因此测定在pH 4下纯化脂肪酶对于短链三酸甘油酯(三丁酸甘油酯)、中链三酸甘油酯(三辛酸甘油酯)和长链三酸甘油酯(橄榄油)的比活力值分别为约10，760U/mg、约16，920U/mg和约12，260U/mg。最后，本发明人惊讶地观察到，Lip2脂肪酶在胆盐存在时具有活性，并且该活性随着胆盐的浓度而增加。直到现在，仅仅发现与辅助脂肪酶相结合的胃脂肪酶和胰脂酶在胆盐存在时具有这种活性。因此，具有较高比活性的Lip2脂肪酶的应用不需要辅助脂肪酶的存在。克隆YL-LIP2-6C含有数个拷贝的该Lip2脂肪酶的表达盒，导致在不同的基因座处产生5次LIP2基因的整合。当置于适合产生脂肪酶的条件下时，相比现有技术领域的转化解脂耶氏酵母菌株，克隆YL-LIP2-6C生产出更多的脂肪酶。脂肪酶的产率大于lg/L培养液上清液，即，大于如上所述观察到的现有技术领域克隆的产率。
本发明的主题还涉及脂肪酶制品，其可以通过根据本发明的方法而得到。根据所述脂肪酶制品的优选实施方式，当按如上所指出的方法测定时，其活性至少等于 15，000U/ml，优选大于 20，000U/ml。另外，本发明的主题还涉及根据本发明的脂肪酶制品用于制备药物的应用，其目的在于治疗与脂肪(例如短链、中链或长链脂肪酸)吸收失调有关的疾病，尤其是与胰腺不足、特别是外分泌胰腺不足相关的疾病。本发明的主题还涉及一种药物，其特征在于，其包含如上限定的脂肪酶制品。本发明的主题还涉及一种用载体转化的解脂耶氏酵母菌株，所述载体用于表达酵母耐酸脂肪酶，其特征在于，该菌株是称为YL-LIP2-6C的克隆，其于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C. N. C. M.，法国巴黎道可图罗斯大街28号，企业邮递特投15，邮编75724)，保藏编号为1-3542。另外，本发明的主题还涉及如上限定的细胞用于生产酵母耐酸脂肪酶的应用。
除前述特征外，本发明还包括如下说明书中出现的其他特征，下面参照实施本发明方法的实施例和下述附图，对这些特征进行描述-图I显示了用于在生产脂肪酶的方法期间控制YL-LIP2-6C克隆的遗传稳定性的总体方法。-图2显示了在发酵工艺期间，在600nm下光密度(OD6tltol，左侧Y轴)的变化(- -)和生长速率0T1，右侧Y轴)的变化(-■-)与时间(小时，X轴)的关系。箭头显示了诱导脂肪酶的产生。-图3显示了在不同的基因座处将LIP2基因整合入23个菌落的基因组(车道24至43)的整合次数的Southern blot分析,菌落收集时间点T33对应于发酵结束，即在发酵开始后约100小时。拷贝数I 6 :6个LIP2基因的基因座(5个用于整合LIP2基因表达盒的基因座+1个用于内源性LIP2基因的基因座)。M :大小标记。-图4显示了在T16至T33的生产期间YL-LIP2-6C克隆产生重组体脂肪酶的SDS-PAGE监测情况。箭头显示了诱导产生脂肪酶(T17，发酵48小时)。M :分子量梯度；右手部分凝胶中的五个泳道对应于已知量(2. 5 g至20 g)的纯化Lip2脂肪酶。-图5显示了在时间点T33(发酵工艺终点)处上清液中脂肪酶纯度的SDS-PAGE分析情况。MW :分子量梯度；参照Lip2F5 :Lip2脂肪酶范围I至IOii g ;YL_LIP2_6C上清液被分析的上清夜的体积为U L0-图6显示了通过MALDI-T0F型质谱分析法测定的YL-LIP2-6C克隆生产的重组体脂肪酶的质谱。
具体实施例方式实施例I—材料和方法I)使用的培养基显示的最终浓度是母液中的浓度。未富集的基础培养基02130S
权利要求
1.一种用于生产重组体脂肪酶的方法，其包括 a)培养用载体转化的解脂耶氏酵母细胞的步骤，所述载体包含用于表达酵母耐酸脂肪酶的表达盒，所得到的解脂耶氏酵母细胞是名为YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为1-3542 ;以及 b)从培养液上清液中回收用所述YL-LIP2-6C细胞生产的所述重组体脂肪酶的步骤， 该方法的特征在于， 用于培养的步骤a)是在不含由动物来源的蛋白质材料或它们的酶消化产物所组成的动物来源的产物或未被表征的混合物的培养基中进行的；并且所述培养基包含 -作为氮源的无机氮； -碳源，其选自于碳水化合物来源的碳源、多元醇、以及脂类来源的碳源；以及 -无机盐和维生素；并且 所述步骤a)包括 al)在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中预培养所述YL-LIP2-6C细胞；a2)发酵步骤，包括在含有碳水化合物来源的碳源的培养基中的细胞生长期，以及在含有脂肪酸作为唯一碳源的培养基中的脂肪酶生产期。
2.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述无机氮是硫酸铵。
3.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述脂肪酸是油酸。
4.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，所述发酵在15% 25%的恒定p02和PH小于6. 5的条件下进行。
5.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，进行用于预培养的步骤al)直至OD6tltol值为3 10每lmL，在用于发酵的步骤a2)中，当所述培养液的OD6tltol值达到60 80每ImL时，开始所述脂肪酶生产期。
6.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，当所述OD6tltlnm值达到300 350每ImL时，进行收集所述脂肪酶的步骤b)。
7.如权利要求I所述的生产方法，其特征在于，步骤b)包括 bl)从所述培养液上清液中分离所述脂肪酶；以及 b2)纯化步骤bl)中得到的脂肪酶。
8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于，采用从中空纤维切向过滤、正面过滤、和连续式或分批式离心中选出的技术来进行所述分离，采用从过滤、分级沉淀、离子交换层析、疏水交互作用层析、和凝胶过滤层析中选出的技术来进行所述纯化。
9.一种被载体转化的解脂耶氏酵母细胞，所述载体包含酵母耐酸胞外脂肪酶的表达盒 其特征在于，所述细胞是名为YL-LIP2-6C的克隆，所述克隆于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C. N. C. M.)，保藏编号为1-3542。
10.如权利要求9所述的细胞用于生产所述酵母耐酸脂肪酶的应用。
全文摘要
用于生产解脂耶氏酵母耐酸重组体脂肪酶的方法，该方法利用的培养基除其使用的物质外不含任何动物来源的产物或未表征的混合物比如胰胨、蛋白胨或抗乳血清。可以生产过多量的脂肪酶Lip2的解脂耶氏酵母的重组菌株被称作YL-LIP2-6C，该菌株于2005年12月15日保藏在法国培养物和微生物国家保藏中心(C.N.C.M.)，保藏编号为I-3542，本文还涉及其应用。
文档编号C12N9/20GK102703404SQ20121006738
公开日2012年10月3日 申请日期2006年6月15日 优先权日2006年6月15日
发明者伊夫·勒布隆, 尼古拉斯·穆兹, 让·路易·乌里韦拉雷亚, 阿兰·马蒂 申请人:法国米奥里大药厂