专利名称：一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。
背景技术：
诺沃克病毒(Norwalk virus, NV)是一种直径27nm的小圆状结构病毒(SRSV),又被称为诺瓦克样病毒(Norwalk-like Viruses, NLVs),属于杯状病毒科诺沃克病毒属成员， 是一种分布很广泛的肠道腹泻病毒。1968年在美国Norwalk镇发生了一起胃肠炎爆发流， 该病毒是在这些患者的粪便中首次被发现，因此得名。NLV是在社区、学校、机关、军营和家庭中爆发流行的非细胞菌性胃肠炎的主要病原，感染对象主要是成人和学龄耳童，全年均有发生。诺沃克病毒的传播方式是通过粪-口途径传播，主要是通过污染的水源、食物和人-人密切接触传播；临床表现包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻(水样便)，可伴有头痛、低热、 乏力及食砍减退，病程一般2-3d，与轮状病毒等引起的其他病毒性腹泻相比，NLV引起的腹泻多伴有呕吐症状。因此，疾病预防控制机构以及医院急需特异性强，敏感性高，操作方便， 可用于胃肠炎等暴发疫情和临床病例的早期快速诊断的方法。诺沃克病毒(Norwalk virus, NV)的基因组为正单链RNA，全长7. 65Kb，编码3个开放读码框(open reading frames, ORFs),分别编码非结构蛋白、夕卜壳蛋白和一种功能还不清楚的蛋白0RFsl编码具有RNA多聚酶活性的非结构蛋白前体，为非结构蛋白；0RFs2 编码衣壳蛋白；0RFs3编码一种强碱性蛋白，与基因库中任何蛋白质的序列都无相似之处， 其功能尚不清楚。诺沃克病毒成员庞杂，目前已对其100多个分离株进行基因测序。根据 RNA聚合酶区域衣壳蛋白区核苷酸和氨基酸序列的同源性比较，将诺沃克病毒分为2个基因组基因组I，代表株NV，包括SV等、Desert Shield virus (DSV)等；基因II组，代表株 SMV,包括 HV、Mexio virus (MX)等。目前诺沃克病毒的常规检测方法主要是电镜法(EM)、放射性免疫试验(RIA)和酶联免疫法(ELISA)。诺沃克病毒被发现后很长一段时间内，电镜一直是检测的主要手段，具有直接、可靠的优点，但由于诺沃克病毒在电镜下缺乏显著的形态学特征，且敏感性低、价格昂贵、技术条件要求高，不适合检验检疫实际工作需求；用RIA法检测出急性期和恢复期之间抗体升高4倍以上，对流行病学调查更有意义，但RIA法实验时间需6d时间，同时还需要放射性同位素标记，对操作人员和环境造成不良影响；酶联免疫法(ELISA)特异性强，灵敏度高，诊断迅速，且较经济，是目前可广泛应用的检测方法，但由于诺沃克病毒体外培养还未成功，可用试剂的病毒抗原数量受到限制。传统的RI-PCR也被用于诺沃克病毒，但检测时间需要6小时，在热循环后要用电泳对扩增产物进行检测分析，步骤繁琐，还会在实验操作过种中有可能发生污染；实时荧光RT-PCR(real-time fluorescent RT-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、速度快、抗污染、高通量等优点逐渐取代了传统RT-PCR技术
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 2所示。一种检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 3所示；该探针的5’端标记有报告荧光染料，3’端标记有淬灭荧光染料。所述报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5，所述淬灭荧光染料为 TAMRA、ROX、DABCYl、BHQl 或 BHQ2。—种检测诺沃克病毒核苷酸的方法，该方法以样品RNA为模板,利用如序列表 SEQ ID No. 1,SEQ ID No. 2所示的引物以及序列表SEQ ID No. 3所示的探针进行实时荧光 RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后，若出现诺沃克病毒特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有诺沃克病毒核苷酸。所述实时荧光RT-PCR扩增的反应体系如下2. L IOXOne Step RNA PCR Buffer,终浓度为0. 4mM的dNTP，终浓度为400 y M的引物，终浓度为200 u M的探针，终浓度为2. 5U的Taq酶，终浓度为20U的RNase Inhibitor,终浓度为2. 5U的AMV RTase XL, 5u L 样品 RNA，10. 5u L RNase Free dH20。所述实时荧光RT-PCR扩增的反应条件如下50°C反转录20min ;95°C变性3min ； 以95°C 5s, 60°C 40s扩增45个循环。本发明根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记有两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记的探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’ 端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，在扩增延伸阶段将探针切断， 淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对诺沃克病毒的检测。本发明的有益效果本发明根据诺沃克病毒基因组序列设计的引物特异性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明的检测方法准确性高，灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有诺沃克病毒，为人腹泻、胃肠炎的病原学诊断及鉴别诊断提供了科学依据。
图I为实时荧光RT-PCR检测诺沃克病毒核酸的特异性实验结果图。图2是本发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。实施例I引物与探针的设计及合成通过分别对所有已知的诺沃克病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段(其序列见附录)，利用生物软件Primer Express3. 0针对该区段设计引物和Taqman探针，并通这NCBI数据库进行了 Blast同源性比对验证。引物序列为正向引物5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’ (SEQ ID No. I)；
反向引物5’-CCAATGTTCAGATGGATGAGATTCTC-3，(SEQ ID No. 2)；探针的序列为5’-AITGCGATCGCCCTCCCACGT-3’ (SEQ ID No. 3)；该探针的5’端用VIC荧光基团标记，3’端用淬灭荧光染料BHQ2标记。实施例2 Real-time RT-PCR(I)RNA 的提取病毒样品RNA的抽提用Roche High Pure viral RNA kit试剂盒提取,取0. 5克左右粪便标本，加TE 500 ii L制成10-20%的悬液，8000rpm离心5分钟;取200111标本上清加400 ii L结合液，混合均匀，加入纯化过滤管中，lOOOrpm，15s ;弃去过滤液，换一新的收集管，加入500ii L inhibitor removal buffer, IOOOOrpm离心I分钟；弃去过滤液,换一新的收集管，加入450 u L洗液，IOOOOrpm离心I分钟；重洗一次;最后离心，13000rpm, 10s,弃去残余的洗液；去掉收集管，换一个干净的无RNA的I. 5ml Eppendrof离心管,用50 y L洗脱液加入过滤管中，IOOOOrpm离心I分钟，将提取的RNA移到一个新的离心管中，于_80°C 保存。(2)扩增方法的建立实时荧光RT-PCR反应体系(表I):表I荧光定量RT-PCR反应体系
权利要求
1.一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 所示。
2.一种检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 3所示；该探针的5’端标记有报告突光染料,3’端标记有淬灭突光染料。
3.根据权利要求2所述一种检测诺沃克病毒核苷酸的探针，其特征在于，所述报告荧光染料为FAM、HEX、TET、JOE、VIC、FITC、CY3或CY5，所述淬灭荧光染料为TAMRA、R0X、 DABCYl、BHQ I 或BHQ2。
4.一种检测诺沃克病毒核苷酸的方法，其特征在于，该方法以样品RNA为模板,利用权利要求I所述的引物以及权利要求2所述的探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后，若出现诺沃克病毒特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有诺沃克病毒核苷酸。
5.根据权利要求4所述一种检测诺沃克病毒核苷酸的方法,其特征在于，所述实时突光RT-PCR扩增的反应体系如下2. 5 ii L IOXOne Step RNA PCR Buffer，终浓度为0. 4mM的 dNTP,终浓度为400 u M的引物，终浓度为200 U M的探针，终浓度为2. 5U的Taq酶，终浓度为 20U 的 RNase Inhibitor，终浓度为 2. 5U 的 AMV RTase XL，5 y L样品 RNA，10. 5 y L RNase Free dH20。
6.根据权利要求4所述一种检测诺沃克病毒核苷酸的方法,其特征在于，所述实时突光RT-PCR扩增的反应条件如下50°C反转录20min ;95°C变性3min ;以95°C 5s, 60°C 40s扩增45个循环。
全文摘要
本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种检测诺沃克病毒核苷酸的引物、探针及方法。其引物和探针的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。本发明检测诺沃克病毒核苷酸的方法以样品RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后，若出现诺沃克病毒特异性荧光扩增曲线则判定样品RNA中含有诺沃克病毒核苷酸。
文档编号C12Q1/68GK102605103SQ20121006811
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者余以刚, 刘建丽, 卢小雨, 赵丽, 邱杨, 陈进会, 黄伟 申请人:东莞出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心, 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心