专利名称：一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法
技术领域：
本发明涉及一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法。
背景技术：
经典的基因克隆以及重组实验是以II型限制性内切酶以及T4DNA连接酶为基础的。利用限制性内切酶特异性地识别并酶切DNA，然后用T4DNA连接酶将不同DNA片段连接在一起，从而达到基因克隆和重组的目的。这种方法存在着一些问题首先，并不是所有的基因都存在合适的酶切位点，尤其是有些载体的克隆位点只有少数几个内切酶可供选择的情况下；其次，用限制性内切酶克隆或重组后，会留下不必要限制性内切酶序列痕迹，多数情况下这些限制性内切酶的识别序列随后也会导致我们目的蛋白上多出一些氨基酸序列， 这些多余的氨基酸可能会改变目的蛋白的结构以及活性，进而影响实验结果。
发明内容
本发明目的是提供一种不依赖酶切位点和连接酶的克隆及重组DNA的方法。本发明采用的技术方案是一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法，所述方法是在待插入的目的基因两端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10 30bp(15bp左右为宜) 的DNA片段后与载体DNA在外切核酸酶作用下进行重组，即在制备目的基因片段时，在扩增引物的5’端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10 30bp(15bp左右为宜)的DNA片段。所述方法包括(I)载体DNA制备以目的基因插入位点对应的限制性内切酶对纯化的克隆载体质粒进行酶切；或者以稀释的克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，上游引物记为primerl (约15bp),下游引物记为primer2 (约15bp),进行 PCR扩增；(2)目的基因制备在目的基因原始扩增引物的5’端分别加上primerl和 primer2的反向互补序列，所得引物以含有目的基因的DNA为模板进行PCR扩增，得到目的
基因;(3)基因重组将步骤(I)载体DNA和步骤⑵目的基因混合，加入Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶或λ Exonuclease，进行反应获得重组DNA。(4)转化将步骤(3)所得的重组DNA转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因质粒的大肠杆菌克隆。优选的,步骤(3)所用聚合酶为T4DNA聚合酶。具体的，以所述目的基因为SGK2 (serum/glucocorticoid regulated kinase 2) 基因的0RF，所述克隆载体为pBlueScript II KS (-)，插入位点为EcoR V酶切位点为例，所述方法如下
(I)载体DNA制备以稀释的克隆载体质粒为模板，以引物primerl. I和 primer2. I进行PCR扩增，得到载体DNA ；引物primerl. I 序列如下5’ -ATCGAATTCCTGCAGCC-3’ ；引物primer2. I 序列如下5’ -AATCAAGCTTATCGATACCG-3’ ；(2)目的基因制备以小鼠脊髓cDNA为模板，用引物SGK2F和SGK2R进行PCR扩增，得到目的基因；弓丨物SGK2F序列如下5’ -GGCTGCAGGAATTCGATGGCCTCCAGCCCAGTTG-3’弓丨物SGK2R序列如下5’ -CGGTATCGATAAGCTTGATCAAGAGTCCAAAATGTCATCATC-3，(3)基因重组将步骤(I)载体DNA和步骤⑵目的基因混合，加入T4DNA聚合酶， 在20°C进行2min，然后70°C IOmin使酶失活，再50°C温浴30min进行退火；或加入Pfu DNA 聚合酶，在50°C温浴30min进行酶切及退火；或加入λ Exonuclease,在37°C进行5min,然后70°C IOmin使酶失活，再在50°C温浴30min进行退火；即得重组DNA。(4)转化将步骤(3)所得的重组DNA转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因质粒的大肠杆菌克隆。本发明原理示意图见图I。T4、Pfu DNA聚合酶等酶具有3’ 一 5’外切核酸酶活性(3，—5，Exonuclease activity,图 1A)，而 λ Exonuclease (Lambda exonuclease)具有5’一 3’外切核酸酶活性(图1B)。在这些外切核酸酶活性作用下，双链DNA的末端会形成单链区，当不同DNA片段间的末端具有相同序列时(图I中分别用红色及蓝色表示)，单链区域就能够按照碱基互补配对的原则特异性退火，转化到细菌后就能达到无痕重组的目的。这种克隆方法要求设计PCR引物时，在引物的5’末端要分别增加与载体上的克隆位点两端序列相同的一段DNA碱基(图IC中SGK2F和SGK2R)。载体可以用酶切(如EcoR V) 获得，此外也可以用PCR方法扩增载体获得。本发明的有益效果主要体现在(I)目的基因或DNA片段不需要酶切，不必考虑其内部的酶切位点，也不受载体上限制性内切酶识别位点的限制；(2)目的片段连接到载体时避免了引入不必要的序列，即无痕克隆。
图I为利用外切核酸酶活性的无痕克隆方法的原理及引物设计示意图；图2 为 Pfu polymerase、T4DNA polymerase 和 AExonuclease 的外切酶活性；M, 500bp Marker ；C, Control,未加酶；Pfu DNA polymerase 的反应温度为 50 °C， T4DNApolymerase 和 AExonuclease 的反应温度为 37°C。图3为插入片段检测结果；M为marker ;泳道I 8为8个随机挑选的白斑用PCR 检测插入片段；挑选泳道2 4及6 8所代表的细菌克隆做测序鉴定，其中泳道2、4、6及 8所代表的细菌克隆均包含目的基因SGK2的完整0RF，而泳道3的克隆则包含了 SGK2基因的不同转录本(variant transcript),只有泳道7的克隆为非目的基因片段。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :利用外切核酸酶活性无痕克隆SGK(serum/glucocorticoid regulated kinase 2)基因的编码区(open reading frame, ORF) 7· I、检测 Pfu、T4DNA 聚合酶和 λ Exonuclease的外切酶活性在10 μ I反应体系中将IOOng DNA片段分别用IU的Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶以及 λ Exonuclease (表 I)反应 5min, IOmin 和 30min 后，加 2 μ I 50mM EDTA 终止反应， 进行电泳。表I :外切核酸酶活性检测
权利要求
1.一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法，其特征在于所述方法是在目的基因两端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10 30bp的DNA片段后与载体DNA在外切核酸酶活性作用下进行重组，即在制备目的基因片段时，在扩增引物的5’端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10 30bp的DNA片段。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述方法包括 (1)载体DNA制备以目的基因插入位点对应的限制性内切酶对纯化的克隆载体质粒进行酶切；或者以稀释的克隆载体质粒为模板，以目的基因插入位点两端的序列为结合位点设计引物，上游引物记为primer I,下游引物记为primer2,进行PCR扩增；(2)目的基因制备在目的基因原始扩增引物的5’端分别加上primerl和primer2的反向互补序列，所得引物以含有目的基因的DNA为模板进行PCR扩增，得到目的基因；(3)基因重组将步骤(I)载体DNA和步骤⑵目的基因混合，加入PfuDNA聚合酶、 T4DNA聚合酶或λ Exonuclease，进行反应获得重组DNA。(4)转化将步骤(3)所得的重组DNA转化入大肠杆菌感受态细胞之后，即可筛选获得含有目的基因质粒的大肠杆菌克隆。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)所用酶为T4DNA聚合酶。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述目的基因为SGK2(serUm/ glucocorticoid regulated kinase 2)基因的 ORF,所述克隆载体为 pBlueScript II KS(-)，插入位点为EcoR V酶切位点，所述方法如下(1)载体DNA制备以稀释的克隆载体质粒为模板，以引物primerl.I和primer2. I进行PCR扩增，得到载体DNA ；引物 primerl. I 序列如下5’ -ATCGAATTCCTGCAGCC-3’ ；引物 primer2. I 序列如下5’ -AATCAAGCTTATCGATACCG-3’ ；(2)目的基因制备以小鼠脊髓cDNA为模板，用引物SGK2F和SGK2R进行PCR扩增，得到目的基因；引物SGK2F序列如下、5，-GGCTGCAGGAATTCGATGGCCTCCAGCCCAGTTG-3，引物SGK2R序列如下、5，-CGGTATCGATAAGCTTGATCAAGAGTCCAAAATGTCATCATC-3，(3)基因重组将步骤(I)载体DNA和步骤(2)目的基因混合，加入T4DNA聚合酶，在 20°C进行2min，然后70°C IOmin使酶失活，再50°C温浴30min进行退火；或加入Pfu DNA聚合酶，在50°C温浴30min进行酶切及退火；或加入λ Exonuclease,在37°C进行5min,然后 70°C IOmin使酶失活，再在50°C温浴30min进行退火；即得重组DNA ；(4)转化将步骤(3)所得的重组DNA转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选获得含有目的基因质粒的大肠杆菌克隆。
全文摘要
本发明提供了一种利用外切核酸酶活性的无痕克隆及重组方法，所述方法是在目的基因两端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10～30bp的DNA片段后与载体DNA在外切核酸酶作用下进行重组，即在制备目的基因片段时，在扩增引物的5’端分别加上与克隆载体插入位点两端序列相同的长度为10～30bp的DNA片段。本发明的有益效果主要体现在(1)目的基因或DNA片段不需要酶切，不必考虑其内部的酶切位点，也不受载体上限制性内切酶识别位点的限制；(2)目的片段连接到载体时避免了引入不必要的序列，即无痕克隆。
文档编号C12R1/19GK102604982SQ201210070600
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者孙淑慧, 戴忠敏, 邱猛生, 黄浩 申请人:杭州师范大学