专利名称：鹅过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ基因的单核苷酸多态性检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是鹅过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR Y基因的单核苷酸多态性检测方法及其在畜禽育种中的应用。
背景技术：
基因突变是指基因的核苷酸顺序或数目发生改变。涉及DNA分子中单个碱基改变者称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),包括单碱基的转换、颠换、插入和缺失等。目前对SNP进行检测的方法较多，而大多数实验室采用的是成本相对较低、技术易掌握、检出率较高和操作步骤简单的PCR-SSCP技术。该方法原理经PCR扩增的DNA片段在变性剂(如甲酰胺)或低离子浓度下经高温处理使之解链并保持在DNA单链状态下，然后在一定浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象，这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同，PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因靶DNA中发生单碱基置换，或个别碱基插入或缺失时，因迁移产生变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，其在凝胶中泳动速度不一样，从而显示出带型的差异，即多态型。PPARy是过氧化物酶体增殖物激活受体家族(PPARs)的成员之一。是一种由配体激活的核转录因子，属于II型核受体超家族成员，是影响脂肪细胞分化、内分泌功能的重要调节因子，是噻唑烷二酮类药物(TZDs)作用的靶分子，TZDs通过与PPAR Y结合而发挥降低血糖、血脂及增加胰岛素敏感性的作用，人的PPARy基因常见的多态与胰岛素敏感性、肥胖和心血管发病有关。常见多态Prol2Ala变异即使对肥胖有作用，需要与其他基因的相互作用表现出来，如Prol2Ala与0肾上腺素能受体(P 3-adrenergic receptor, BAR3)基因的Trp64Arg突变的相互作用，在墨西哥美国人中PPAR Y Ala等位基因携带者比Pro个体更肥胖，但这些个体需携带BAR3Arg64等位基因[1]。PPARy在脂肪和免疫器官表达。PPARy过表达可以诱导成纤维细胞和脂肪细胞间的转化，与C/EBP a协同作用，可以诱导成肌细胞向脂肪细胞转化。孟和等已经克隆出鹅PPAR Y基因的⑶S区，并证实基因在肝脏和肌肉中无表达，高表达于脂肪，其次是脑和肾脏，低量表达于脾脏、心脏、肺脏、胃和小肠。王娉等构建PPARy基因的真核表达载体免疫小鼠使其产生抗体，获得的重组蛋白和抗血清。苏胜彦等研究朗德鹅填饲后不同组织PPAR Y基因表达量差异结果显示，肝脏组织中， 填饲组PPARy基因表达量极显著高于对照组中该基因的表达量(P < 0.01)，且表达量与肝脏指数、血清谷丙转氨酶含量呈显著正相关(P < 0. 05)，说明肝脏、皮下脂肪、腹脂组织PPARy基因的表达水平与朗德鹅肥肝形成有一定的关系。韩清等构建了鸡PPARy基因5’侧翼区的3个多态性位点单倍型，证明对鸡脂肪性状和骨骼性状有一定的影响[5]。PPARy可由多种脂肪酸及其衍生物激活，是脂肪细胞分化、脂质代谢重要调节因子。Koutnikova等研究表明，肌肉中PPARy主要负责协调能量利用，而不是单纯的控制糖稳态或胰岛素敏感性。Verma等证实PPAR y对肌肉分化有调节作用，PPAR y活性对C2C12肌细胞分化具有重要作用，上调 和下调PPAR Y蛋白水平均能抑制肌细胞分化。Cock等证实在脂肪组织中抑制PPARy表达，可以抑制间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)向脂肪细胞分化，促进MSC向成骨干细胞分化，进一步研究发现可能是由于PPARy表达量下降，限制了脂肪细胞分泌瘦素等抗成骨信号因子的能力，从而提高骨骼强度并增加骨量。迄今为止，国内外均未见鹅PPAR Y基因遗传变异的研究，由于中国地方鹅PPAR Y基因遗传变异领域的研究匮乏，该基因位点的功能研究及其遗传变异与屠宰性状(如屠体重、胸肌重、腿肌重等)关联的研究仍是空白。
发明内容
本发明目的在于提供一种鹅过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR Y基因的单核苷酸多态性检测方法及其本发明的技术方案如下一种鹅过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR Y基因的单核苷酸多态性检测方法，包括提取鹅血样基因组DNA，对基因组DNA进行PCR扩增，使用的上游引物序列为CCAITTGTTAITTATGACATGAACT，下游引物序列为GATCAITCAGGTCAAGAITCACA，PCR 扩增产物经双向测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现存在A/G多态性。所述的检测方法，其中PCR扩增体系2 X Taq PCR MasterMix 5 U L, ddH20
3.6 u LUOpmol/u L 引物各 0. 3 u L,50ng/mL 模板 DNA0. 8 u L ;PCR 扩增参数94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；35 个循环，72°C 8min。所述的检测方法，PCR扩增片段长度为205bp。鹅PPAR Y基因位点A/G多态性在畜禽育种中的应用，用于筛选屠宰性能高的鹅。采用上述方案，本发明利用PCR-SSCP技术检测鹅PPAR Y基因的多态性，并将其与屠宰性状进行关联分析，验证表明其可以作为鹅分子育种中辅助选择的分子标记。检测鹅PPAR y编码区存在I个SNP，呈现两种基因型(AA、AG)，对浙东白鹅腿肌率的遗传效应达到显著水平(P < 0. 05)，AG基因型个体的腿肌率显著地高于AA型个体。选出的单核苷酸多态性位点可以辅于育种，从而加快畜禽育种进程。。
图I :PCR扩增产物的凝胶电泳图；图2 :PCR扩增产物的测序图；图3 =PCR扩增产物的SSCP电泳图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
(I)特定引物的设计
针对鹅PPARY基因发生密码子突变而可能引起剪接位点的活性进而影响基因功能的单核苷酸多态性，以NCBI公布的鹅序列(Gene ID AF481798. I)为参考，利用Primer5. O设计PCR引物，其引物序列为上游引物CCATTTGTTATTTATGACATGAACT，下游引物GATCATTCAGGTCAAGATTCACA。扩增片段长度为205bp。对浙东白鹅的血样提取DNA为模板，应用该对引物进行扩增，得到与目的片段大小一致的片段(图1)，经双向测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现存在A/G多态性。(2)鹅样本的采集以浙东白鹅为检测对象，具体采集样本见下表。
品种样品数样品名称样品来源采样方式
浙东白鹅I 172个 I血样上海市农业科学院畜牧兽医研究所翅下静脉采血(3)鹅血样基因组DNA的提取①冷冻血液在室温融化以后，取150 μ L移至离心管中，加入100 μ L盐酸胍缓冲液(O. 47g/ml)和 400 μ L 裂解液(Tris 碱 O. 6057g ；Nacl 4. 383g ；EDTA 0. 29225g ；SDS 5g ;定容至500ml，NaOH调pH值至8· 0)，加入20 μ L蛋白酶K (浓度为100mg/mL)，上下颠倒试管充分混合，55 °C水浴过夜。②加入600 μ L氯仿抽提两次,每次振荡混勻15min, 12000r/min。③取上清至另一洁净离心管中，加入等体积异丙醇,沉淀数小时,4°C，12000r/min离心15分钟，弃上清。④取上清，加入2倍体积的预冷_20°C冰乙醇洗涤沉淀DNA。⑤将DNA置于室温下自然风干干燥(注意不能太干燥)，根据沉淀的量加入适量(100-200 μ L) TE (ρΗ8. O)缓冲液溶解，置4°C冰箱溶解过夜；溶解后的DNA可贮于_20°C中备用。(4) DNA浓度和纯度的检测用I. 2 %的琼脂糖凝胶检测总DNA，并用DNA定量仪测定浓度及纯度。①琼脂糖凝胶电泳检测取5 μ L待测DNA溶液和I μ L溴酚蓝置入混匀，上样于I. 2%的琼脂糖凝胶，电泳检测，观察电泳条带，无明显拖尾，条带明亮则符合实验要求。②分光光度法测定取6 μ L待测DNA溶液稀释500倍至3mL，分别在紫外分光光度计260nm和280nm处测定OD值。DNA 浓度(ul/ml) = 0D260X 稀释倍数 X 50 ；DNA 纯度=0D260/0D280 ；(5) PCR 扩增PCR 扩增体系2XTaq PCR MasterMix 5 μ L、ddH20 3· 6 μ L、引物(lOpmol/μ L)各 O. 3μ L、模板 DNA(50ng/mL)0. 8μ Lo PCR 扩增参数:94 °C 4min ；94 °C 30s, 55 °C 30s,72°C Imin ；35 个循环，72°C 8min。(6)电泳及基因型判定和测序图将扩增产物99°C变性5min后于12%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，电泳完毕后进行硝酸银染色拍照。根据电泳结果直接判定个体基因型，引物的扩增产物在12%的聚丙烯酰胺凝胶上分别呈现两种带型，见图2、图3。(7)鹅PPAR Y基因SNP位点的基因和基因型频率统计分析①基因型频率指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。由于PCR-SSCP方法的检测结果为共显性等位基因，因此，表型频率即为基因型频率。基因型频率=基因型个数/检测群体总数②等位基因频率记为Pi，表示在一个群体中某一等位基因的数量与占据同一基因座位的全部等位基因总数的比例，取值0-1之间。Pi = [2(ii) + (ijl) + (ij2)+......(ijn)]/2NPi :第i个等位基因的频率i :纯合复等位基因jl、j2、......jn :与i共显的第I到第η个等位基因计算PPARy基因不同位点的基因型频率和等位基因频率，结果见表。SNP的AA基因型和A等位基因频率明显闻于AG基因型和G等位基因。表PPAR Y基因各位点在浙东白鹅群体中的基因型和基因频率
权利要求
1.一种鹅过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR y基因的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，包括提取鹅血样基因组DNA，对基因组DNA进行PCR扩增，使用的上游引物序列为CCAITTGTTAITTATGACATGAACT，下游引物序列为GATCAITCAGGTCAAGAITCACA，PCR 扩增产物经双向测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现存在A/G多态性。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，其中PCR扩增体系2XTaqPCRMasterMix 5 u L, ddH20 3. 6 u LUOpmol/u L 引物各 0. 3 y L、50ng/mL 模板 DNA0. 8 y L ；PCR扩增参数94°C 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ;35 个循环，72°C 8min。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，PCR扩增片段长度为205bp。
4.鹅PPARy基因位点A/G多态性在畜禽育种中的应用，用于筛选屠宰性能高的鹅。
全文摘要
本发明公开了鹅过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ基因的单核苷酸多态性检测方法及其在畜禽育种中的应用，包括提取鹅血样基因组DNA，对基因组DNA进行PCR扩增，使用的上游引物序列为CCATTTGTTATTTATGACATGAACT，下游引物序列为GATCATTCAGGTCAAGATTCACA；PCR扩增产物经双向测序鉴定后，与NCBI公布的序列进行比较发现存在A/G多态性。检测鹅PPAR γ编码区存在1个SNP，呈现两种基因型(AA、AG)，对浙东白鹅腿肌率的遗传效应达到显著水平(P＜0.05)，AG基因型个体的腿肌率显著地高于AA型个体。选出的单核苷酸多态性位点可以辅于育种，从而加快畜禽育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102643900SQ20121007128
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者何大乾, 刘毅, 吴华莉, 朱庆, 胡耀东 申请人:上海市农业科学院