专利名称：一种哲罗鲑体细胞体外培养方法
技术领域：
本发明涉及一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。
背景技术：
哲罗鲑(Hucho taimen)为我国珍贵、冷水性鱼类之一，主要分布在亚洲北部地区， 西至伏尔加河流域、东至伯朝拉河流域、南至黑龙江流域，北至勒拿河等流域。哲罗鲑大部分时间生活在水流湍急的溪水中，冬季在较深的水体如大江干流、湖泊中越冬，春季向溪流洄游产卵。由于繁殖期过度捕捞，使哲罗鲑补充群体数量大大减少，以及人为环境污染及生存环境条件破坏等原因，使哲罗鲑的自然资源量显著下降。目前，黑龙江的哲罗鲑数量较过去显著减少，在黑龙江省的渔获物中几乎不占比重。自2005年我国哲罗鲑人工繁殖和苗种驯化成功后，该鱼因其生长速度快、易驯养、营养价值高等优点，而被广泛养殖，涉及到全国 20几个省市县。近些年，随着哲罗鲑养殖规模的扩大、由于种质衰退和养殖环境恶化等原因，一些冷水性鱼类的暴发性疾病频频爆发，导致我国哲罗鲑等冷水性鱼类的养殖产量锐减。目前，国内外学者虽对哲罗鲑生态习性、生长繁殖、生化和遗传等方面进行了大量的研究，但对其细胞培养方面的研究还尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。本发明哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行一、断颈处死哲罗鲑；二、 采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块 将清洗后的组织剪碎至O. 8 I. 2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入O. 5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19°C的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL 细胞培养液，在19°C的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80% ;四、细胞的原代培养取O. 5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中， 在23°C下于50 IOOrpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入ImL 血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加 4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于lOOOr/min离心5min，取沉淀 A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至IO5个/mL，接种 8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80% 90% ； 五、体细胞传代培养然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于IOOOr/ min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至 IX IO4 5X IO4个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80%，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。冷水性鱼类因其具有独特的生长环境和代谢机制，其细胞培养一直以来是国内外鱼类细胞培养的技术难点。因此，为解决我国冷水性鱼类病毒性疾病检测和疫苗制备的迫切需要，本发明建立了哲罗鲑体细胞的体外培养方法，对促进我国冷水性鱼类的渔业健康、 稳定发展具有重要的实践意义。本发明方法培养的细胞生长状态良好。本发明方法可有效地增加细胞分裂次数，使得哲罗鲑体外细胞的实际分裂次数达到30次以上。
图I为具体实施方式
i^一中培养鉴定的活细胞在可见光下的形态图；图2为具体实施方式
十一中培养鉴定的活细胞PI染色后荧光下的形态图；图3为具体实施方式
十一中培养鉴定的活细胞hoechst33342染色后突光下的形态图；图4为具体实施方式
^ 中的死细胞在可见光下的形态图；图5为具体实施方式
十一中培养鉴定的死细胞PI染色后荧光下的形态图；图6为具体实施方式
^ 中培养鉴定的死细胞hoechst33342染色后突光下的形态图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行一、 断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL 链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、 原代培养组织块将清洗后的组织剪碎至O. 8 I. 2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入O. 5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19°C的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19°C的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80%;四、细胞的原代培养取O. 5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23°C下于50 IOOrpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入ImL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min 离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至 IO5个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80% 90% ;五、体细胞传代培养然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至IX IO4 5X IO4个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80%，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中断颈处死哲罗鲑的具体方法为选择体长为12 14cm的哲罗鲑，采用医用尖头镊子插入哲罗鲑口中， 另一只手握住其鱼体躯干部，采用背侧移位断颈处死。其它与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二所述哲罗鲑鱼体组织为肝脏、肾脏、鳍缘或吻端。其它与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤二中采集哲罗鲑鱼体组织的具体方法为采用碘酒擦拭哲罗鲑鱼体表一次，然后将哲罗鲑浸泡于体积浓度为75%的乙醇溶液中30秒，取出后用灭菌纱布吸干鱼体表面，取全部或部分组织。其它与具体实施方式
一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤三中第二次在19°C的培养箱中继续培养期间，每48小时更换细胞培养液一次。其它与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤三、步骤四和步骤五中所述细胞培养液为含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为 20%的胎牛血清的B2培养基。其它与具体实施方式
一至五之一相同。本实施方式所述B2培养基可替换为M199培养基、DMEM培养基、MEM培养基或者 F12培养基。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤四中所述胰蛋白酶消化液为含有质量浓度O. 25%的胰蛋白酶的D-Hanks缓冲液。其它与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤四中置于19°C培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。其它与具体实施方式
一至七之一相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤五中置于19°C培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。其它与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九之一不同的是步骤五中消化细胞培养瓶内细胞的方法为用D-Hanks缓冲液将细胞丰度达到80% 90%的细胞培养瓶冲洗2遍后，加入ImL O. 25%胰蛋白酶-O. 01 % EDTA消化液，5分钟后加入ImL血清终止消化。其它与具体实施方式
一至九之一相同。
具体实施方式
十一本实施方式哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行 一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体肝脏组织，将肝脏组织放入含有100 IU/mL青霉素和100 IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的肝脏组织；三、原代培养组织块将清洗后的肝脏组织用医用灭菌剪刀剪碎至O. 8
I.2mm3的块状，然后将剪碎的肝脏组织块移入细胞培养瓶中，使肝脏组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入O. 5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19°C的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19°C 的培养箱中继续培养至肝脏组织块长满细胞培养瓶底面积的80% ;四、细胞的原代培养 取O. 5mL步骤三得到的原代培养后的肝脏组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23°C下于 50rpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL上层消化液，移入预先加入ImL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向肝脏组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至IO5个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80% ;五、体细胞传代培养然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至I X IO4 5 X IO4个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80%，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。对本实施方式方法培养得到的肝脏细胞进行细胞形态学鉴定，具体方法为1、将所培养的肝脏细胞连同培养瓶在800倍微分干涉显微镜下观察，依据细胞的形状和大小区别细胞类型，将肝脏细胞为类成纤维型和类上皮细胞型以及其它细胞型。2、在培养瓶的细胞培养液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20%的胎牛血清的B2培养基)内加入I μ g/mL的Hoechst 33342和O. 5 μ g/mL的PI染色15分钟，用D-Hanks缓冲液洗两遍，再加入新细胞培养液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20% 的胎牛血清的B2培养基)，在800倍500nm荧光显微镜下观察，观察肝细胞核质比例、染色质和核仁大小及生长状态。其中，细胞核蓝染色，细胞质无色的为正常细胞，其细胞核与细胞质比例适当，而且生长状态良好；细胞核蓝染，细胞质红色的为死亡细胞；细胞核高度蓝染，伴有核仁分解，细胞质无色的为凋亡细胞。本实验培养鉴定的活细胞形态如图1-3所示，图I为可见光下的形态；图2为PI染色后荧光下的形态，活细胞不染色，死细胞发出红色荧光，图2中仅有一个细胞是死细胞， 见图2中右上角亮点；图3为hoechst33342染色后荧光下的形态，所有细胞核发出蓝色荧光。本实验培养鉴定的死细胞形态如图4-6所示，图4为可见光下的形态，图5为PI染色后荧光下的形态，活细胞不染色，死细胞发出红色荧光，图中仅有一个细胞是死细胞，图6 为hoechst33342染色后荧光下的形态，所有细胞发出蓝色荧光。说明本方法培养的细胞生长状态良好。对本实施方式方法培养得到的肝脏细胞进行细菌、真菌检测，具体方法为将培养瓶内培养48h的细胞培养液(含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20%的胎牛血清的B2培养基)以0. 5mL接种到IOmL大豆胰蛋白胨培养基(奥博星生物)和IOmL 麦芽汁培养液(奥博星生物)中，各2只，分别置于37°C和26°C的培养箱中培养两周，另外设立阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组将枯草芽孢杆菌186 (购自广州市微生物研究所)和白假丝酵母菌(为白假丝酵母菌标准菌株AX2. 2086，购自广州市微生物研究所)分别接种到大豆胰蛋白胨和麦芽汁培养液中，各2只，分别置于37°C和26°C的培养箱中培养两周；阴性对照组将大豆胰蛋白胨和麦芽汁培养液各2只，分别置于37°C和26°C的培养箱中培养两周。两周以后，阴性对照组4只培养基肉眼观察无明显变化，阳性对照组4只培养基肉眼观察均出现浑浊为实验有效。此时实验组4支试管的任何一支如果出现混浊，说明感染细菌。如果实验组4支试管均无明显变化则可以确定没有感染细菌。实验结果阴性对照组4只培养基肉眼观察无明显变化，阳性对照组4只培养基肉眼观察均出现浑浊，证明实验有效。实验组4支试管均无明显变化，可以确定没有感染细菌。
权利要求
1.一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于哲罗鲑体细胞体外培养方法，按以下步骤进行一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织，将组织放入含有100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的D-Hanks缓冲液中浸泡20秒，再用D-Hanks缓冲液冲洗3遍，得清洗后的组织；三、原代培养组织块将清洗后的组织剪碎至O. 8 I. 2mm3的块状，然后将剪碎的组织块移入细胞培养瓶中，使组织块均匀地平铺于细胞培养瓶的底部，向细胞培养瓶中加入O. 5mL细胞培养液，将细胞培养瓶倒置于19°C的培养箱中，培养4小时后将细胞培养瓶翻转，并向细胞培养瓶加入8mL细胞培养液，在19°C的培养箱中继续培养至组织块长满细胞培养瓶底面积的80%;四、细胞的原代培养取O. 5mL步骤三得到的原代培养后的组织块放入5mL胰蛋白酶消化液中，在23°C下于50 IOOrpm的摇床上消化，每5分钟收集4mL 上层消化液，移入预先加入ImL血清的离心管中，得消化液和血清混合物，共收集5次，并在每次收集后都向组织块中补加4mL胰蛋白酶消化液，然后将收集到的消化液和血清混合物于1000r/min离心5min，取沉淀A，向沉淀A中加入5mL细胞培养液，得悬浮液，调整悬浮液的细胞浓度至IO5个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80% 90% ;五、体细胞传代培养然后消化细胞培养瓶内细胞，收集细胞培养瓶内混合液体于1000r/min离心5min，取沉淀B，向沉淀B中加入细胞培养液得细胞悬液，调整细胞悬液浓度至I X IO4 5 X IO4个/mL，接种8mL到细胞培养瓶内，置于19°C培养箱中培养至细胞培养瓶内细胞丰度达到80%，再次传代，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。
2.根据权利要求I所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤一中断颈处死哲罗鲑的具体方法为选择体长为12 14cm的哲罗鲑，采用医用尖头镊子插入哲罗鲑口中，另一只手握住其鱼体躯干部，采用背侧移位断颈处死。
3.根据权利要求I或2所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤二所述哲罗鲑鱼体组织为肝脏、肾脏、鳍缘或吻端。
4.根据权利要求3所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤二中采集哲罗鲑鱼体组织的具体方法为采用碘酒擦拭哲罗鲑鱼体表一次，然后将哲罗鲑浸泡于体积浓度为75%的乙醇溶液中30秒，取出后用灭菌纱布吸干鱼体表面，取全部或部分组织。
5.根据权利要求4所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤三中第二次在19°C的培养箱中继续培养期间，每48小时更换细胞培养液一次。
6.根据权利要求5所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤三、步骤四和步骤五中所述细胞培养液为含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和质量浓度为20% 的胎牛血清的B2培养基。
7.根据权利要求6所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤四中所述胰蛋白酶消化液为含有质量浓度0. 25%的胰蛋白酶的D-Hanks缓冲液。
8.根据权利要求7所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤四中置于 19°C培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。
9.根据权利要求8所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤五中置于 19°C培养箱中培养期间每48小时更换细胞培养液一次。
10.根据权利要求9所述的一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，其特征在于步骤五中消化细胞培养瓶内细胞的方法为用D-Hanks缓冲液将细胞丰度达到80% 90%的细胞培养瓶冲洗2遍后，加入ImL 0. 25%胰蛋白酶-0. 01 % EDTA消化液，5分钟后加入ImL血清终止消化。
全文摘要
一种哲罗鲑体细胞体外培养方法，涉及一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。本发明提供了一种哲罗鲑体细胞体外培养方法。方法一、断颈处死哲罗鲑；二、采集哲罗鲑鱼体组织；三、原代培养组织块；四、细胞的原代培养；五、体细胞传代培养，即完成哲罗鲑体细胞体外培养。本发明方法培养的细胞生长状态良好。本发明方法可有效地增加细胞分裂次数，使得哲罗鲑体外细胞的实际分裂次数达到30次以上。
文档编号C12N5/071GK102604887SQ20121007853
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者刘红柏, 卢彤岩, 李绍戊, 王荻, 赵吉伟, 郭振华 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所