专利名称：一种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法
技术领域：
本发明涉及，尤其涉及的是ー种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法。
背景技术：
霜霉菌是植物的重要病原菌，所致病害通称霜霉病。霜霉菌对寄主植物的破坏性强，危害性大，由霜霉菌引起的植物病害大多难以控制。尤其是果蔬及经济作物易受到霜霉菌侵染，其潜育期短，再侵染频繁，在植物的一个生长季节内病菌可迅速发展造成病害流行，导致农业生产的严重损失。目前，化学农药防治仍是主要防控手段，在霜霉病的防治中发挥着重要的作用。20 世纪70年代中期以前，用于霜霉病防治的药剂主要是ー些保护性杀菌剂如取代苯基类的百菌清、双ニ硫代氨基甲酸酯类的代森锰锌及一些铜制剂等广谱型保护性杀菌剂。自70年代后期开始，甲霜灵、霜霉威、烯酰吗啉、氟吗啉等内吸性杀菌剂的使用对该病害的防治取得了划时代的进展。但由于这些内吸性杀菌剂具有较单ー的作用位点，长期单一大面积使用后霜霉菌容易对这些杀菌剂产生抗药性，极大的降低了杀菌剂的防治效果，増加了生产成本和农药环境污染的风险。近年来，人们逐渐意识到病原菌抗药性产生的危害，提出了基于抗药性监测的杀菌剂使用策略。对于ー些能离体培养的病原菌通常先进行病原菌的采集、分离，然后測定病原菌群体对杀菌剂的敏感性，明确病原菌对某些杀菌剂的抗性频率，然后指导杀菌剂的合理选用。而霜霉病菌是专性寄生菌，在培养基上不能分离培养，限制了这种方法在霜霉病菌抗药性监测中的应用。我们也尝试从发病叶片上挑取单个孢子囊接种到离体植株叶片上进行病原菌的分离和纯化，但由于单个孢子的侵染效率极低，不能真实地反映病原菌群体对杀菌剂的抗药性情况。因此，迫切需要发明ー种简单易行的抗药性监测方法用于专性寄生霜霉病菌的抗药性监测，以科学合理地指导霜霉病的化学防治。
发明内容
本发明的目的是提供ー种用于霜霉病菌抗药性监测的简单、易行的方法。本发明克服了目前常规抗药性监测方法不能用于专性寄生霜霉菌分离、纯化的缺点，提供了ー种直接在离体叶片上测定霜霉病菌抗药性频率的方法。本发明的技术方案是利用植株离体叶片生物測定法监测霜霉病菌的抗药性频率。该方法的步骤为(I)在待监测区域采集霜霉病病样，带回室内将病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗脱，在19°C下暗培养诱导产生新的孢子嚢；(II)将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液(I. OX IO4个孢子囊/mL)分别将混合孢子悬浮液用液滴法(20iU/滴)接种到(I)无菌水浸泡30分钟和(2)用2X待侧杀菌剂最小抑制浓度浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面；(IV)将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19°C黑暗条件下保湿培养12h，再于19°C、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；(V)根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。上述方法中，所述的霜霉病样的采集在每块田间采用5点法取样，每点取10个发病叶片，然后将5个点采集的病叶一井装入保鲜袋中带回室内进行进一歩測定。所述孢子囊悬浮液的制备方法为室内将田间采集的病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗净后，在19°C下暗培养诱导产生新的孢子囊，再将各个叶片上新生孢子囊用4°C无菌水洗脱并混合成混合孢子悬浮液，并将孢子囊悬浮液的浓度用血球计数板调整为I. OXlO4个孢子囊/mL ；所述无菌水和杀菌剂处理叶碟的制备健康离体叶片优选为植株中部相同叶龄的叶片；叶碟的尺寸为￠2. 5cm;将制取的叶碟混匀后分为两份，每份50个叶碟。一份叶碟用无菌水浸泡30min，另ー份叶碟用2倍待侧杀菌剂对霜霉菌最小抑制浓度药液浸泡30min。两份处理浸泡过程中均含有0. 02%的吐温20和0. 1%的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。所述霜霉病菌混合孢子悬浮液的接种方法为取出晾干后叶背朝上整齐置于用吸水纸保湿的玻璃培养皿(415cm)中，在每个叶碟背面用量程50 iiL的移液器滴加20 iiL混合抱子囊悬浮液于叶蝶中央位置。所述离体叶碟的培养方法为装有接种叶碟的培养皿在19°C黑暗条件下保湿培养12h，使霜霉病菌孢子完成萌发和侵染过程，再于19°C、12h光暗交替条件下培养，待叶碟背面产生黑色霉层后，测定每个叶碟上的发病面积。所述抗药性菌株抗性频率的计算方法为抗药性菌株的频率)=(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)X100。本发明利用了霜霉病菌的敏感菌株和抗性菌株在带药叶碟上的生长与否来估算抗药性菌株的频率。通常在无药剂处理的叶碟上敏感和抗性菌株均能侵染致病，能代表抗药性菌株和敏感菌株群体的侵染情况；而在2X杀菌剂最低抑制浓度处理的叶碟上仅抗药性菌株能侵染而敏感菌株不能侵染，仅代表抗性菌株群体的侵染情況。因此，抗药性菌株的频率可以用药剂处理叶碟上的发病面积与未用药剂处理叶碟上的发病面积的比值估算得至IJ。这种方法有效地解决了专性寄生霜霉菌抗药性监测中不能分离培养的难点，提供了一种简单、易行的霜霉菌抗药性监测方法，为霜霉病的防治和抗药性治理提供了极大的便利。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例一、黄瓜霜霉病菌敏感菌株和抗性菌株混合培养多代后抗药性频率的变化监测。I、材料和方法(I)供试药剂96*%氟吗啉(fIumorph)原药。(2)供试植株将感病黄瓜品种长春密刺栽培于4 15cm，高12cm的育苗钵内，置于温室中培养，植株长到5叶期后采集第3叶位的叶片，用于叶碟的制作。(3)供试菌株黄瓜霜霉病菌菌株K-I (可以采用其他常见菌株替代)为实验室从 田间采集的对氟吗啉敏感的菌株，氟吗啉对该菌株的最小抑制浓度为0. 70 u g/mL ；RK-1为利用紫外线诱导法从亲本菌株K-I中诱导获得的对氟吗啉产生抗药性的突变体，该突变体在I. O g/mL氟吗啉处理过的叶碟上能正常生长。(4)抗药性频率测定方法(I)菌株产孢分别将亲本菌株K-I及抗药性菌株RK-I在健康离体黄瓜叶片上培
养产孢；(II)混合孢子悬浮液配制分别配制各供试菌株的孢子囊悬浮液(浓度为I. OX IO4个孢子囊/mL)，然后将抗药性菌株和亲本敏感菌株(R : S)按0 : 10 ;2 8 ；5 5；8 2；10 0的比例混合形成抗感菌株孢子悬浮液混合液；
(III)离体叶碟制作选择温室培养至5叶龄的黄瓜植株上第四叶位上的健康叶片，用打孔器制备直径15mm的黄瓜叶碟。随机混匀，分成2组，每组50个叶碟，分别于(I)无菌水浸泡30分钟和⑵用2X氟吗啉最小抑制浓度(I. 5 u g/mL)浸泡30分钟,然后将叶碟取出，用吸水纸洗干叶碟上的药液，叶背朝上置于培样皿内用相同药剂浓度润湿的吸水纸上。(IV)孢子混合液的接种将敏感菌株和抗性菌株制作的混合孢子悬浮液用40 U I移液枪取接种到分别采用无菌水浸泡30分钟和用2X氟吗啉最小抑制浓度(I. 5 u g/mL)浸泡30分钟的健康离体植物叶片制成的叶碟(直径2cm)背面，每个叶碟接种20 yl。(V)将接种的叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿(直径15cm)中，先于19°C黑暗条件下保湿培养12h，再于19°C、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积；(VI)根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。抗药性菌株的频率(％)=(药剂处理叶碟上的发病面积/未用药剂处理叶碟的发病面积)X100。(5)试验结果结果表明(表I)，亲本菌株K-I和抗药性菌株RK-I孢子囊悬浮液按照不同比例混合培养第I代后，抗药性菌株的抗药性频率和接菌前抗药性菌株与敏感菌株的混合比例基本一致，表明这种方法能正确反映霜霉病菌群体中抗性菌株的频率；混合培养第3代后抗药性菌株的频率略有降低。表I氟吗啉抗药性菌株k_l和敏感菌株混合培养后的抗性频率变化
权利要求
1.ー种用于霜霉病菌抗药性频率监测的方法，其特征是，包括以下步骤 Al、在待监测区域用五点法采集霜霉病病样，带回室内将病叶上的杂质和老熟的孢子囊用无菌水洗脱，在19°C下黑暗培养诱导产生新的孢子囊； A2、将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液，浓度为l.OX IO4-L 0X IO5 个孢子囊 /mL ； A3、分别将孢子囊悬浮液用液滴法接种健康离体植物叶片制成的叶碟背面，叶碟事先用无菌水浸泡30分钟和2 X (待侧杀菌剂最小抑制浓度)药液浸泡30分钟； A4、将接种叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿中，先于19°C黑暗条件下保湿培养12h，再于19°C、12h光暗交替条件下保湿培养5-7d，然后测量叶碟上的发病面积； A5、根据杀菌剂处理叶碟上霜霉病的发病面积与未用药剂处理叶碟上霜霉病的发病面积的比率来测算抗药性菌株的频率。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征是田间采用五点法采集霜霉病病样，室内将老熟孢子囊和杂质洗脱后在19°C下黑暗培养诱导产生新的孢子囊，再将所有采集的病样孢子囊洗脱混合形成混合孢子囊悬浮液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征是将混合孢子囊悬浮液接种叶蝶背面，每个叶蝶背面接种20 Ul孢子悬浮液，叶碟浸泡过程中无菌水和药液均含有0. 02%的吐温20和·0.1%的甲醇；浸泡过程中需经常搅动，以确保每个叶碟都被均匀的湿润。
全文摘要
本发明公开了一种用于植物霜霉病菌抗药性频率监测的方法，步骤为A1、在待监测区域采集霜霉病病样，带回室，在19℃下黑暗培养诱导产生新的孢子囊；A2、将所有采集病叶上的新生孢子囊洗脱并混合制成孢子囊悬浮液；A3、分别将孢子囊悬浮液用液滴法接种健康离体植物叶片制成的叶碟背面，叶碟事先用无菌水浸泡30分钟和2×(待侧杀菌剂最小抑制浓度)药液浸泡30分钟；A4、将接种叶蝶置于吸水纸保湿的培养皿中，保湿培养；A5、测算抗药性菌株的频率。该方法简单易学，容易操作，对实验仪器要求不高，且能较准确地反映田间霜霉病菌群体的抗药性情况，具有较高的实际应用价值。
文档编号C12Q1/18GK102643892SQ201210078708
公开日2012年8月22日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者何霞红, 朱书生, 朱有勇, 李成云, 杜飞, 杨敏, 梅馨月, 王海宁, 邓维萍 申请人:云南农业大学