专利名称：鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测试剂盒。
背景技术：
鸭新城疫病是由鸭源新城疫病毒(Duck Newcastle Diseases duck NDV)引起的一类急性、高度接触性和致死性的传染病。早期研究发现，鸭对致病性APMV-I具有极强的抵抗力，仅表现为健康带毒，即使强毒感染也不致病。但近年来发现引起高致病性和死亡性的鸭源新城疫病毒的自然流行，对养鸭业危害严重。河北、福州、浙江、山西、山东、河南等地陆续报道该病的发生和流行，上述研究表明，鸭源新城疫病毒的感染呈上升趋势，将对我国的养鸭业产生巨大危害。鸭圆环病毒(Duck circo virus, DuCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的一成员，首次在德国报道。近年来，相继有匈牙利、美国、中国台湾及我国山东、辽宁、福建、广东和广西等地发现有鸭圆环病毒造成鸭感染或发病的报道。DuCV造成鸭发病的主要临床表现为发育不良、体重下降及羽毛凌乱等，病理组织表现为法氏囊出现坏死淋巴细胞减少和组织细胞增多。织细胞增生现象感染动物的淋巴组织逐渐萎缩导致免疫功能下降或免疫反应抑制进而提高了二重或多重感染的几率是圆环病毒感染的特征与其它病原菌或病毒的混合感染情形非常复杂。柴同杰对山东的樱桃谷鸭群鸭圆环病毒及混合感染的调查表明，鸭圆环病毒与鸭I型肝炎、鸭疫里默氏杆菌及大肠杆菌的混合感染率较高。屈素洁等对广西部分地区鸭圆环病毒感染情况进行调查，结果表明存在与鸭疫里氏杆菌、新城疫病毒、禽流感病毒和鸭肝炎病毒等病原混合感染现象。水禽圆环病毒不能在细胞和禽胚上生长，而且该病毒多以亚临床感染形式出现，所以用传统的分离病毒、动物试验方法无法进行诊断。最初诊断圆环病毒主要靠病理组织和电镜观察，但这两种方法都需要专业的技能和敏感性不高。混合感染给鸭疾病诊断带来了许多困难，不能仅通过临床表现做出诊断，需要借助于分子诊断技术。病毒的分离、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等这些方法耗时，不利于病毒的防治。PCR方法具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点，已成为动物病原检测的重要方法。特别是多重PCR具有可同时检测、鉴别多种病原体突出的特点，在临床多种病原混合感染的鉴别诊断上具有独特的优势和很高的实用价值。但是在一个PCR体系中由于存在多种模板和引物，需要防止引物和模板之间的非特异性结合，避免非特性条带的出现，还要尽量避免引物二聚体的产生。同时，目的片段的大小有合适的梯度和各引物退火条件尽可能相同，以确保2种扩增产物量相对平衡，条件摸索十分重要。至今尚未见有应用二重PCR对新城疫病毒和鸭圆环病毒检测和诊断的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的引物组。
本发明提供的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；
所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物组中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为
0.1-0. 5 0. 1-0. 5:1:1;上述引物组中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为
0.2 : 0. 2 : I : I。本发明的另一个目的是提供一种检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR缓冲液和水组成；所述引物组中的引物I和引物2在所述PCR试剂中的终浓度均具体为0. Iumol/mL-0. 5 u mol/mL ;所述引物I和所述引物2在所述PCR试剂中的终浓度均进一步具体为
0.2 umol/mL ；所述弓丨物组中的引物3和引物4在所述PCR试剂中的终浓度均具体为0. 8 ii mol/mL-1.2umol/mL ;所述引物3和所述引物4在所述PCR试剂中的终浓度均进一步具体为Iu mol/mL。上述PCR缓冲液为2XTaq PCR Mix (购自天根 KT201)。本发明的第三个目的是提供一种检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的PCR试剂盒。本发明提供的PCR试剂盒，包括上述引物组或上述PCR试剂。上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和鸭圆环病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和鸭圆环病毒为用上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。上述应用中，所述二重PCR扩增的退火温度为50°C -65°C，所述二重PCR扩增的退火温度具体为55 °C。本发明的第四个目的是提供一种检测新城疫病毒的引物对A。本发明提供的引物对A，由上述的引物组中的所述引物I和所述引物2组成；本发明的第五个目的是提供一种检测鸭圆环病毒的引物对B。本发明提供的引物对B，由上述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。上述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；上述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。上述新城疫病毒可以为鸭源也可以为非鸭源。本发明的实验证明，本研究设计了 2对引物，建立了新城疫病毒和鸭圆环病毒的二重PCR的检测方法，可以同时检测和鉴别新城疫病毒和鸭圆环病毒两种病原体的二重PCR技术，具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。因此，本研究建立的鸭圆环病毒和鸭新城疫病毒的二重PCR的检测方法可用于鸭圆环病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭源新城疫病毒的混合感染，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
图I为二重PCR温度优化试验图2为二重PCR的优化结果图3为二重PCR特异性试验图4为二重PCR方法检测DuCV和DuNDV的灵敏性图5为二重PCR部分临床样品检测图6为常规PCR检测临床样品中DuCV病毒图7为常规PCR检测临床样品中NDV病毒
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的病毒、试剂具体如下鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所；新城疫病毒为鸭新城疫病毒、NDV-F48E9、NDV-Lasota，其中鸭新城疫病毒记载在“鸭源新城疫油乳剂灭活疫苗制备的研究”，山东农业大学硕士论文，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；NDV-F48E9和NDV-Lasota均购自中国兽医药品监察所；鸭I型肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHV I)购自中国兽医药品监察所；番鸭细小病毒(MDPV)记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18 (6) :5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010,37(11) : 156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯，2008，160 (06) :30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09) :858-860，公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得；禽多杀性巴氏杆菌记载在“应用聚合酶链反应检测禽多杀性巴氏杆菌的研究”，中国预防兽医学报，1999，(06)公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；大肠杆菌0157 :H7记载在“广西畜禽大肠杆菌0157 :H7流行病学调查”，中国人兽共患病学报，2011，27 (12) :1151-1155，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；鸭疫里默氏杆菌记载在“鸭疫里默氏杆菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究”，生物技术，2010，37 (10) :87-91，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；试剂2 X Taq PCR Mix购自北京天根生物技术公司；TIANamp血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒购自天根公司；RNA提取试剂TRIzol LS Reagent购自Invitrogen公司。 实施例I、引物的设计和合成 GenBank中新城疫病毒F基因和鸭圆环病毒的Vl/rep基因序列，利用Lasergene软件进行多序列比对，在保守区运用在线软件Primer Premier 5.0设计引物。引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列见表I。表I为二重PCR引物序列
权利要求
1.检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为0. 1-0. 5 0. 1-0. 5:1:1; 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为0.2 : 0.2 : I : I。
3.检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的PCR试剂，由权利要求I或2所述的引物组、PCR缓冲液和水组成； 所述引物组中的引物I和引物2在所述PCR试剂中的终浓度均具体为0. Iumol/mL-0. 5 u mol/mL ;所述引物I和所述引物2在所述PCR试剂中的终浓度均进一步具体为0.2 umol/mL ； 所述引物组中的引物3和引物4在所述PCR试剂中的终浓度均具体为0. 8iimol/mL-1. 2 u mol/mL ;所述引物3和所述引物4在所述PCR试剂中的终浓度均进一步具体为Iu mol/mL。
4.检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的PCR试剂盒，包括权利要求I或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂。
5.权利要求I或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和鸭圆环病毒产品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒和鸭圆环病毒为用权利要求I或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于 所述二重PCR扩增的退火温度为50°C _65°C，所述二重PCR扩增的退火温度具体为55。。。
8.—种检测新城疫病毒的引物对A，由权利要求I或2所述的引物组中的所述引物I和所述引物2组成； 或一种检测鸭圆环病毒的引物对B，由权利要求I或2所述的引物组中的所述弓丨物3和所述引物4组成。
9.权利要求8所述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有新城疫病毒产品中的应用； 或权利要求8所述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测试剂盒。本发明提供了一种检测新城疫病毒和鸭圆环病毒的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本研究设计了2对引物，建立了新城疫病毒和鸭圆环病毒的二重PCR的检测方法，可以同时检测和鉴别新城疫病毒和鸭圆环病毒两种病原体的二重PCR技术，具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。
文档编号C12N15/11GK102618668SQ201210084010
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 许宗丽, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所