专利名称：Ha-ndv-f基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。
背景技术：
新城疫(ND)是由副粘病毒科的新城疫病毒(NDV)引起的一种禽类致死性传染病，是危害我国畜牧业的A类疾病之一。目前对新城疫的防治，普遍使用的是驯化或灭活的病原体制备的病毒疫苗，这些疫苗成本高、效价不稳定、具有一定毒性，并且新城疫病毒也经常出现新变种，致使现有疫苗易失效。因而，研制新型的基因工程疫苗具有重大意义。F蛋白是新城疫病毒主要结构蛋白之一，它能够诱导机体产生中和性抗体，在机体免疫中发挥重要作用。因此，以F基因为目的基因，利用基因重组技术研制新型疫苗成为国内外关注与研究的热点。
发明内容
本发明是要解决目前新城疫的病毒疫苗存在成本高、效价不稳定、具有一定毒性，并且新城疫病毒也经常出现新变种，致使现有疫苗易失效的问题，提供HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行一、以质粒pNDV-F-T为模板，YLl和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与PMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL-HA-F，然后用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F，获得HA-F片段；二、质粒 pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行 Sal I 单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD (-)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化；三、用T4连接酶将HA-F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL-LM、pYL-LM-ITRs, pYL-LM (-)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs 和 pYL-SD (-)；四、将六种重组转移载体分别转化E. coli DHlO Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL ；五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒 vYL-LM、vYL-LM-ITRs、vYL-LM(_)、vYL-SD、vYL-SD_ITRs 和 vYL-SD，即完成HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物YLl 序列为 5，-ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA-3’ ；引物 YL2 序列为 5’ -CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3’。
本发明通过构建了重组转移载体 pYL-LM、pYL-LM-ITRs, pYL_LM(_)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs和pYL-SD (-)，利用杆状病毒表达系统，使其直接在中国仓鼠卵巢细胞CHO-Kl内表达HA-F抗原蛋白。利用SDS-PAG与Western blot分析鉴定HA-F蛋白的抗原性，并比较含不同启动子和调控元件的重组转移质粒表达HA-F蛋白的差异。从而确定了重杆状病毒表达载体表达HA-NDV-F蛋白的强度，为制备鸡新城疫基因工程疫苗奠定了基础，以此制备的新城疫的病毒疫苗成本可有效降低，效价稳定、无毒性，且避免了疫苗失效的问题。
图I为具体实施方式
一步骤三中六种重组转移载体构建的流程图；图2为具体实施方式
一中SDS-PAGE鉴定HA-F蛋白的表达的电泳图，其中泳道1_6依次表示 vYL-LM、vYL-LM-I、vYL-SD、vYL-SD-I、vYL_LM(_)和 vYL-SD (-)。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行一、以质粒pNDV-F-T为模板，YLl和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与PMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL-HA-F，然后用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F，获得HA-F片段；二、质粒 pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行 Sal I 单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD (-)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化；三、用T4连接酶将HA-F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL-LM、pYL-LM-ITRs, pYL-LM (-)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs 和 pYL-SD (-)；四、将六种重组转移载体分别转化E. coli DHlO Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL ；五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒 vYL-LM、vYL-LM-ITRs、vYL-LM(-) ,vYL-SD,vYL-SD-1TRs 和 vYL-SD，即完成HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物 YLl 序列为 5’ -ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA-3’ ；引物 YL2 序列为 5’ -CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3’。本实施方式所述质粒pNDV-F-T购自大连宝生物工程有限公司；所述质粒pLM、pLM-ITRs> pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)均购自 Invitrogen 公司；本实施方式在具体操作中涉及使用的各种反应试剂或试剂盒均为购买得到(大连宝生物工程有限公司)，并按说明书操作。本实施方式步骤一中1%琼脂糖凝胶电泳检测的是大小为1709bp的HA-F片段。本实施方式步骤一中目的片段的TA克隆(即加“A”反应)目的片段的TA克隆反应体系为 25ii L，由 2. L IOXTaq Buffer,2u L 2. 5mM 的 dNTP Mixture、20 y L胶回收产物和0. 5 ii L 5U/ ii L的Taq DNA聚合酶组成，72°C反应15分钟，获得目的片段TA克隆产物。本实施方式步骤一中所得产物再与PMD18-T载体连接连接反应体系为5 y L，由0. 5u L pMD18-T 载体、L 目的片段 TA 克隆产物和 2. L Ligation solution 组成，16°C条件下连接过夜，获得质粒PTZF-HA-VP2 ;其中Ligation solution为pMD 18-T载体配套缓冲液，内含T4 DNA连接酶。本实施方式步骤一中连接产物经鉴定后获得质粒pTYL-HA-F :连接产物经鉴定后获得质粒PTZF-HA-VP2 :连接产物转化E. coli DH5 a感受态细胞；经蓝白斑筛选，以碱裂解法小量制备质粒，置_20°C保存备用；并对质粒进行PCR鉴定和Xho I与Sal I双酶切鉴定；将筛选出的阳性重组质粒送交北京英俊生物公司测序，测序引物为PMD18-T载体测序通用引物；将测序结果利用DNAStar生物学软件与原始序列进行比对分析，确定重组子序列无突变，最终命名为PTZF-HA-VP2。本实施方式步骤三中六种连接产物的鉴定连接产物转化E. coli DH5a感受态细胞，涂布于含卡那霉素和庆大霉素的双抗平板，37°C培养48h以上观察结果。随机挑取多个白色菌落，分别与3mL含卡那霉素(50 u g/mL)和庆大霉素(7 u g/mL)的LB培养基37 °C，180r/min培养24小时以上，将浑浊菌液分别提取质粒。本实施方式步骤三中六种重组转移载体构建的流程，见图I。本实施方式步骤四中提取九种重组Bacmid DNA的步骤(I)挑取白色单克隆于3mL LB液体培养基(额外添加50 u g/mL卡那霉素、7 y g/mL庆大霉素、10 u g/mL四环素)，37°C，250-300r/min条件下振荡培养24h以上；(2)将I. 5mL细菌培养液转移到I. 5mL离心管，13000r/min离心Imin,弃上清,沉淀重悬于0. 3mL预冷的Bacmid DNA提取溶液I中，振荡以分散沉淀；(3)加入0. 3mL新鲜配制的溶液II，混匀，室温静置5min ；(4)加入0.3mL溶液III，混匀，当蛋白质与E. coli基因组DNA形成浓厚的白色沉淀时，冰浴静置5-10min;(5) 14000g室温离心IOmin,期间另取2mL离心管,加入800 ii L异丙醇；(6)将上清液转入含异丙醇的离心管，不要将白色沉淀加进去，倒转离心管数次混匀液体，冰上放置5-10min ；(7) 13000r/min室温离心15min，移弃上清，沉淀用0. 5mL预冷75%乙醇洗涤I次，13000r/min 室温离心 5min ；(8)弃上清，沉淀置于室温IOmin自然干燥；(9)加入40 ii L无菌ddH20溶解沉淀，于4°C短期保存备用。以IOOng重组Bacmid DNA为模板，分别以M13为上游引物和YLl为下游引物，以YLl为上游引物和YL2为下游引物，对重组Bacmid DNA进行PCR鉴定；然后对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，通过观察3700bp和1704bp处是否有目的条带来判断是否重组成功。、
本实施方式步骤五中利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL转染sf9细胞的步骤(I)取生长状态良好的sf9细胞，800r/min离心5min ；(2)弃去上清液，用新鲜的sf900II完全生长培养液重悬细胞沉淀，调整细胞密度至4. 5 X IO5个/mL，以每孔2mL接于6孔细胞培养板内，细胞贴壁培养Ih后进行转染实验；(3)弃去sf9细胞的培养液，用2mL sf900II SFM培养液洗涤细胞，弃去洗涤培养液，重复操作两次；(4)向含有DNA-脂质体混合物的每个小清瓶内加入0. 8mL sf900II SFM培养液，温和混匀后分别加至6孔板的每个细胞培养孔中，其中有一个孔只含有转染试剂而不含有Bacmid DNA (rBac-TZF-X)作为对照孔，27°C培养 5h ;
(5)吸出DNA-脂质体混合物，向每个细胞孔中加入2mL sf900II完全生长培养液，27°C条件下培养至细胞出现明显病变效应。表达效果验证试验一、Pl代(第一代)重组杆状病毒rBV-TZF-X的收获与滴度测定(I)当Sf9细胞出现感染迹象时，将上层培养液(约2mL)转移到无菌带盖的I. 5mL离心管中，800r/min离心5min以去除细胞及细胞碎片；(2)将含重组杆状病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的I. 5mL离心管中，此时的病毒为Pl病毒储备(PI Viral Stock)；(3)将得到的病毒液体避光短期置于4°C冰箱；若长期保存，进行500 u L分装，避光储存于_80°C冰箱。；二、P2、P3代重组杆状病毒rBV-TZF-X的扩增与滴度测定选取处于对数生长期的sf9细胞，调整细胞密度至5 X IO6个细胞/mL，取50mL离心管加入12mL细胞悬液，800r/min离心5分钟后，加入20mL完全培养基悬浮细胞；将Pl代病毒以感染复数MOI = 0. 075接种于上述悬浮的细胞内，270C，70r/min培养72h，收获并保存含病毒的上清液即获得病毒P2储备，采用空斑分析法测定P2代病毒的滴度；继续扩增重组杆状病毒至P3代，测病毒滴度使其达到2 X IO8pfu/mL-3 X 108pfu/mL为止。三、重组杆状病毒对CHO-Kl细胞的侵染培养好的CHO-Kl细胞用胰酶消化吹散后以3X IO5个细胞/孔接种于六孔板，37°C培养12h，加入感染复数MOI为40的P3储备(同时混入IOmM的丁酸钠)，开始病毒侵染，37°C培养12h后吸出培养液，更换新的DMEM完全培养液，培养48h后收毒。四、重组杆状病毒对CHO-Kl细胞侵染后蛋白收获弃去六孔板内的培养液,用预冷的PBS洗细胞两次。将六孔板放于冰上，向每个孔内加入200 ii L预冷的western裂解液，冰上作用5min ;同时轻轻晃动细胞培养板，将裂解液与细胞充分接触；最后用细胞刮刀将细胞刮下，吸取裂解物于I. 5mL EP管中，-20°C短期保存。五、重组HA-F 蛋白的 SDS-PAGE 及 Western-blotting 鉴定用以下分离胶和浓缩胶对表达的重组HA-F蛋白进行SDS-PAGE鉴定。12%分离胶(IOmL)配方如表I :
权利要求
1.HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行 一、以质粒pNDV-F-T为模板，YLl和YL2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行I%琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与PMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒pTYL-HA-F，然后用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F，获得HA-F片段； 二、质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(_)分别进行 Sal I 单酶切，酶切后获得线性载体质粒pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD_ITRs、pSD (-)，然后在分别进行去磷酸化处理，获得去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)，再用PCR纯化试剂盒进行纯化； 三、用T4连接酶将HA-F片段与去磷酸化后线性片段pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行连接，六种连接产物经鉴定后获得六种重组转移载体，分别为pYL-LM、PYL-LM-ITRs, pYL-LM (-)、pYL-SD、pYL-SD-ITRs 和 pYL-SD (-)； 四、将六种重组转移载体分别转化E.coliDHlO Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL ； 五、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-YL转染sf9细胞，获得六种重组杆状病毒 vYL-LM、vYL-LM-ITRs、vYL-LM(_)、vYL-SD、vYL-SD_ITRs 和 vYL-SD，即完成HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建； 其中步骤一中引物 YLl 序列为 5，-ATATCGATATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGGCTCCAGACCTTCTACCAAGA-3’ ；引物 YL2 序列为 5’ -CGGGTCGACTCACATTTTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3，。
2.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为50 μ L反应体系，由下列成分组成 药品加入体积终浓度2xGC 缓冲液25μ IxdNTP Mixture(IOmM)4 μι0.8mM上游引物 YLl (20μΜ)Ιμ 0.4μΜ下游引物 YL2 (20μΜ)Ιμ 0.4μΜ 模板 pNDV-F-T4μLHS enzyme (2.5υ/μ )0.5μ 1.25U 无菌水余量 PCR扩增条件为:98°〇变性41^11，981变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸5min,4°C保温。
3.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中目的片段的TA克隆的反应体系为25 μ L，由下列成分组成成分用量IOxTaq Buffer2.5μι·2.5mM 的 dNTP Mixture2μL 胶回收产物20μ ·5υ/μ 的 Taq DNA 聚合酶0.5无菌水余量 目的片段的TA克隆条件为72°C反应15分钟。
4.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中连接的体系为5 μ L，由下列成分组成 成分用量 目的片段TA克隆产物 2μ pMD18-T 载体0.5μ Ligation solution2.5μ 连接反应条件为16°C连接过夜。
5.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中用限制性内切酶Xho I和Sal I双酶切pTYL-HA-F的体系如下成分用量pTYL-HA-F5μLXho I2.5μ Sal I2.5μ IOxMBuffer5μL无菌水35μ 酶切反应条件为37°C水浴2h。
6.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤二中质粒 pLM、pLM-ITRs、pLM(-)、pSD、pSD-ITRs、pSD(-)分别进行 Sal I 单酶切的体系如下 成分用量 质粒 pLM 、 pLM-ITRs、pLM(-)、I0MlpSD、pSD-ITRs、pSD(-) Sail5 μι IOxMBuffer5μL 无菌水30μ 酶切反应条件为37°C水浴2h。
7.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤二中去磷酸化处理的体系如下 (30υ/μ )2.5μ 无菌水补至终体积为50μ 去磷酸化处理的条件为37°C水浴30min后，50°C水浴15min。
8.根据权利要求I所述的HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下 连接反应条件为16°C连接过夜。
全文摘要
HA-NDV-F基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前新城疫的病毒疫苗存在成本高的问题。方法一、以pNDV-F-T为模板PCR扩增，目的片段进行TA克隆及连接，得pTYL-HA-F，酶切得HA-F片段；二、六种质粒分别单酶切及去磷酸化处理，然后进行纯化；三、连接后得六种重组转移载体；四、转化感受态细胞，经提取后得Bacmid-YL；五、转染sf9细胞，得六种重组杆状病毒即完成。本发明利用杆状病毒表达系统，使其直接在中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1内表达HA-F抗原蛋白；为制备鸡新城疫基因工程疫苗奠定了基础，以此制备的新城疫病毒疫苗成本可有效降低。
文档编号C12N15/866GK102703487SQ20121009307
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者凌宏志, 叶磊, 唐晓艳, 安琪, 宋刚, 平文祥, 楼庄伟, 葛菁萍, 金丽颖, 高冬妮 申请人:黑龙江大学