专利名称：具有多个除草剂抗性ahasl1等位基因的除草剂抗性向日葵植物及使用方法
技术领域：
本发明涉及农业领域，尤其涉及包含向日葵乙酰羟酸合酶大亚基I(AHASLl)基因的两种不同除草剂抗性等位基因的除草剂抗性向日葵植物。发明背景 乙酰羟酸合酶(AHAS ；EC4. I. 3. 18，也称为乙酰乳酸合酶或ALS)是催化支链氨基酸缴氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物化学合成的第一个酶(Singh(1999) " Biosynthesisof valine,leucine and isoleucine," in Plant Amino Acids,Singh,B. K. ,ed. ,MarcelDekker Inc. New York, New York, pp. 227-247)。AHAS是四种结构上和化学上不同的除草剂家族的作用位点，所述除草剂家族包括磺脲类(Tan等，(2005)Pest Manag. Sci. 61 246-57 ;Mallory-Smith and Retzinger(2003)Weed Technology 17 :620-626 ;LaRossaand Falco (1984) Trends Biotechnol. 2 :158-161)、咪唑啉酮类(Shaner 等(1984) PlantPhysiol. 76 :545-546)、三唑并卩密唳类(Subramanian 和 Gerwick(1989) " Inhibition ofacetolactate synthase by triazolopyrimidines, " in Biocatalys in AgriculturalBiotechnology, Whitaker, J. R. and Sonnet, P. E..eds. , ACS Symposium Series,American Chemical Society, Washington, D. C. , pp. 277-288)、和卩密唳基氧基苯甲酸酯类(Subramanian 等(1990)Plant Physiol. 94 :239-244)。由于它们在非常低的应用程度下的有效性以及在动物中的相对无毒性，咪唑啉酮和磺脲类除草剂被广泛用于现代农业。这些除草剂家族通过抑制AHAS活性阻止了包括多种杂草种类在内的敏感植物的生长和发育。商业上可获得的咪唑啉酮除草剂的几个例子有PURSUIT (咪草烟)，SCEPTER (灭草喹)和ARSENAL· (灭草烟)。磺脲类除草剂的例子有绿黄隆、甲黄隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻吩磺隆、苯黄隆、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺磺隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆、啶咪黄隆、吡啶磺隆和吡氯黄隆。由于它们的高效性和低毒性，偏向于将咪唑啉酮除草剂通过喷雾法应用于大范围植物的顶部。能够将除草剂喷于大范围植物的顶部降低了与植物建立和维护相关的费用，并降低了在使用此类化学试剂之前准备场所的需要。由于缺乏竞争种类，在目标耐受种类顶部的喷雾也致使获得了目标种类的最大产量潜力的能力。然而，使用此类喷雾技术的能力依赖于喷雾区域中目标植物的咪唑啉酮抗性种类的存在。在主要的农业作物中，一些豆科种类(例如大豆)由于其能够快速代谢除草剂化合物，对咪唑啉酮除草剂具有天然抗性(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci. 33 469-471)。其它作物例如玉米(Newhouse 等(1992) Plant Physiol. 100 :882-886)和稻(Barrett等(1989)对咪唑啉酮除草剂是有些敏感的。对咪唑啉酮除草剂的差异敏感性取决于特定除草剂的化学性质和化合物在每种植物中从毒性至非毒性形式的差别代谢(Shaner 等(1984)Plant Physiol. 76 :545-546 ;Brown 等(1987)Pestic. Biochem.Physiol. 27 :24-29)。其它植物生理学差异例如吸收和转移也在敏感性中发挥着重要作用(Shaner 和 Robinson(1985) Weed Sci. 33 :469-471)。在玉米、拟南芥、油菜(即芸苔)、大豆、烟草、甜菜(甜萝卜)和稻中，利用种子、小孢子、花粉和愈伤组织诱变作用已经成功生产出了对咪唑啉酮、磺脲类、三唑并嘧啶和嘧啶基氧基苯甲酸酯有抗性的植物(Sebastian等(1989)Crop Sci. 29 :1403-1408 ;Swanson 等，1989 Theor.Appl. Genet. 78 :525-530 ；Newhouse 等(1991)Theor. Appl.Genet. 83 :65-70 ;Sathasivan 等(1991) Plant Physiol. 97 1044-1050 ;Mourand 等(1993)J. Heredity 84 :91-96 ；Wright 和 Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96 :612-620 ;美国专利号5，545，822)。在所有的情况下，单一的、部分显性的核基因赋予了抗性。先前也在小麦Fidel栽培种种子诱变之后分离到了四种咪唑啉酮抗性小麦植物(Newhouse等(1992)Plant Physiol. 100 :882-886)。遗传研究确认单一的部分显性基因赋予了抗性。基于等位 基因研究，作者推断出四种所鉴定的品系中的突变位于同一基因座。将Fidel栽培品种抗性基因之一命名为 FS-4 (Newhouse 等(1992) Plant Physiol. 100 :882-886)。也已经将被发现对于咪唑啉酮和/或磺脲类除草剂具有抗性的天然存在的植物种群用于开发除草剂抗性向日葵育种品系。最近，利用来自于普通向日葵野生品系(向日葵)的种质作为除草剂抗性性状的来源开发了对磺脲类除草剂具有抗性的两种向日葵品系(Miller 和 Al-Khatib (2004) CropSci. 44 :1037-1038)。从前，White 等((2002) WeedSci. 50 =432-437)已经报道过，来自美国南达科他的普通向日葵种群的个体对咪唑啉酮和磺脲类除草剂具有交叉抗性。对该种群个体的乙酰羟酸合酶大亚基(AHASL)基因的部分编码区域的分析揭示出，向日葵AHASL蛋白质中导致Ala置换成Val氨基酸的点突变对应于野生型拟南芥AHASL蛋白质中的Ala2tl5 (White等(2003) Weed Sci. 51 :845-853)。更早地，Al-Khatib和Miller ((2000) Crop Sci. 40 :869)报道了四种咪唑啉酮抗性向日葵育种品系的产生。对AHAS抑制剂复合体三维构象的计算机建模预示，在作为引入突变的位点的建议的抑制剂结合袋中的几个氨基酸可能提供对咪唑啉酮类的选择抗性(Ott等(1996)J. Mol. Biol. 263 :359-368)。在AHAS酶建议的结合位点中具有一些这些合理设计的突变的烟草植物实际上显示出对单一种类除草剂的特异抗性(Ott等(1996) J. Mol. Biol. 263:359-368)。对咪唑啉酮除草剂的植物抗性也已在下列一些专利中有所报告美国专利号4, 761, 373,5, 331, 107、5，304，732、6，211，438、6，211，439 和 6,222，100 通常描述了使用改变的AHAS基因引起植物中的除草剂抗性，并特别公开了特定的咪唑啉酮抗性玉米品系。美国专利号5，013，659公开了因在一个或多个保守区的至少一个氨基酸的突变而显示除草剂抗性的植物。其中所述的突变编码对咪唑啉酮和磺脲类的交叉抗性，或者磺脲类特异抗性，但未描述咪唑啉酮特异抗性。美国专利号5，731，180和美国专利号5，767，361讨论了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单个氨基酸替换的分离基因，其导致了咪唑啉酮特异抗性。另外，对干扰AHAS的除草剂具有抗性的稻类植物已经通过突变育种并另外通过从花药培养所产生的稻类植物库中筛选除草剂抗性植物而得以开发。参见，美国专利号 5，545，822,5, 736，629,5, 773，703,5, 773，704,5, 952，553 和 6，274，796。在植物中，如同在所有其它有机体中所检测到的，AHAS酶由两个亚基组成大亚基(催化作用)和小亚基(调节作用)(Duggleby 和 Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33 1-36)。AHAS大亚基(本文也称作AHASL)在拟南芥和甜菜中可由单个基因编码，在玉米、芸苔和棉花中通过多基因家族成员编码。大亚基中特异性单个核苷酸置换赋予了该酶对一类或多类除草剂的一定程度的不敏感性(Chang和Duggleby (1998)Biochem J. 333 765-777)。例如，面包小麦(Triticum aestivum L.)含有三种同源乙酰轻酸合酶大亚基基因。每种基因显示出基于除草剂反应的显著表达，以及来自三种基因的每个中突变的生物化学数据(Ascenzi 等(2003) International Society of Plant Molecular BiologistsCongress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17)。所有三种基因的编码序列在核苷酸水平上享有广泛的同源性(W003/014357)。通过对来自小麦的几个品种的AHASL基因的测序，发现大多数頂I-耐受(咪唑啉酮耐受)品系中除草剂耐受的分子基础是突变S653(At) N，表明在等同于拟南芥中653位氨基酸的丝氨酸的位置上丝氨酸向天冬酰胺的置换(W003/01436 ；W0 03/014357)。该突变是由于编码AHASL蛋白的DNA序列中的单核苷酸多态性(SNP)。也已知多种AHASL基因存在于双子叶植物种类中。最近，Kolkman等((2004)Theor. Appl. Genet. 109 :1147-1159)报道了来自除草剂抗性和野生型基因型的向日葵(Helianthus annuus L.)的三种 AHASL 基因(AHASL1、AHASL2 和 AHASL3)的鉴定、克隆和测序。Kolkman等报道了除草剂抗性是因为AHASLl蛋白中Pix)197LeU置换(利用拟南芥AHASL氨基酸位置命名法)或Ala205Val置换，以及这些置换中的每种均提供对咪唑啉酮和磺脲类除草剂的双重抗性。由于其高效性和低毒性，咪唑啉酮除草剂被喜欢用于农业用途。然而，在特定农作物生产系统中使用咪唑啉酮除草剂的能力取决于目标农作物植物中咪唑啉酮抗性品种的存在。为生产此类咪唑啉酮抗性品种，植物育种者需要开发具有咪唑啉酮抗性特征的育种品系。因此，需要作物植物另外的咪唑啉酮抗性育种品系和品种，以及生产和使用咪唑啉酮抗性育种品系和品种的方法和组合物。发明概述本发明提供新的、除草剂抗性向日葵植物，其包含向日葵乙酰羟酸合酶大亚基I (AHASLl)基因的两个不同的除草剂抗性等位基因。特别是，当与野生型向日葵植物相比时，本发明的向日葵植物具有对乙酰羟酸合酶(AHAS)抑制性除草剂增加的抗性。本发明的除草剂抗性向日葵植物包含第一 AHASLl等位基因和第二 AHASLl等位基因，其中第一和第二 AHASLl等位基因分别编码第一和第二除草剂抗性向日葵AHASLl蛋白质。第一 AHASLl等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白质。第二 AHASLl等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白质。还提供了包含第一和第二 AHASLl等位基因的向日葵植物部分、组织、细胞和种子。本发明进一步提供了生产包含对至少一种AHAS抑制性除草剂有抗性的杂种向日葵植物的方法。该方法包括将第一向日葵植物与第二向日葵植物异花授粉从而产生杂种向日葵种子，可种植该种子并允许其生长成杂交向日葵植物，特别是Fl代杂交向日葵植物。第一向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASLl基因的第一等位基因，第二向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASLl基因的第二等位基因。优选地，第一向日葵植物是第一等位基因纯合型的，第二向日葵植物是第二等位基因纯合型的。第一等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白。第二 AHASLl等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白。本发明另外提供用于控制本发明的向日葵植物附近的杂草或不需要的植物的方法。一种方法包括对杂草和向日葵植物应用有效量的AHAS抑制性除草剂，特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂。另一方法包括在播种之前和/或催芽之后使本发明的向日葵种子与有效量的AHAS抑制性除草剂特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂接触相接触。本发明另外提供了用有效量AHAS抑制性除草剂处理的本发明的向日葵种子。用于这些方法的向日葵植物和种子在其基因组中包含第一 AHASLl等位基因和第二 AHASLl等位基因。第一 AHASLl等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白质。第二 AHASLl等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白质。
本发明另外提供了控制受感染的向日葵植物上的寄生杂草Orobanche cumana和弯管列当(Orobanche cernua)(也称为列当)的方法。该方法包括对杂草和本发明的除草剂抗性向日葵植物，特别是包含两种A122T等位基因的向日葵植物、或包含一种AHASL1A122T等位基因和一种A205VAHASL1等位基因的向日葵植物使用有效量的咪唑啉酮除草剂。本发明提供鉴定个体向日葵中AHASLl基因的等位基因的诊断方法。该诊断方法包括利用经设计与AHASLl基因内特定位点(例如，位于AHASLl基因中突变或其附近的位点)退火的引物对向日葵AHASLl基因特定区域进行聚合酶链反应(PCR)扩增。另外提供了用于这些方法中的引物或完成这些方法的试剂盒。附图简述图I是在处理突变事件A122T和A205V的纯合型材料以及杂合基因型A205+A122T的材料之后14天，叶部施用灭草烟对植物高度的影响的图示。平均高度(未处理样地的％)通过标记来表示，误差线表示平均值的标准差。图2是处理突变事件A122T和A205V的纯合型材料以及杂合基因型A205+A122T的材料之后14天，叶部施用灭草烟对植物毒性指数(PI)的影响的图示。平均PI由标记来表述，误差线表不平均值的标准差。图3在处理突变事件A122T和A205V的纯合型材料以及杂合基因型A205+A122T的材料之后14天，叶部施用灭草烟对生物量积累的影响的图示。平均干生物量(未处理样地的％ )通过标记来表示，误差线表示平均值的标准差。图4是利用引物p-AHAS18/pAHAS-19进行PCR扩增反应的产物在琼脂糖凝胶电泳后的照片示例。第I道GM40 (A122T突变)，第2道LI (A205V突变)，第3和4道H3，第5和6道H4，第7和8道H1，第9和10道L2。图5是用BmgB I对PCR扩增产物进行限制酶消化的产物在琼脂糖凝胶电泳之后的照片示例。M道分子量标准 ’第I道BTK47(野生型)，第2道GM40(A122T)，第3道来自 cmsBTK47XGM40 杂交的 Fl 代植物，第 4 道cmsGM40 (A122T)。图6是利用p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU组合所获得的PCR扩增产物的照片示例。第I道分子量标准(25bp标记)，第2道分子量标准(IOObp标记)，第3道122纯合子个体，第4道205纯合子个体，第5道197纯合子个体，第6道:WT (单倍型I)，第7道122/WT个体，第8道122/205个体，第9道122/197个体，第10道冰(阴性对照)，第11道分子量标准(25bp标记)，第12道分子量标准(IOObp标记)。图7是利用p-AHAS NIDF/AHAS 122TMT组合所获得的PCR扩增产物的照片示例。第I道分子量标准(25bp标记)，第2道分子量标准(IOObp标记)，第3道122纯合子个体，第4道205纯合子个体，第5道197纯合子个体，第6道WT (单倍型I)，第7道122/WT个体，第8道122/205个体，第9道122/197个体，第10道冰(阴性对照)，第11道分子量标准(25bp标记)，第12道分子量标准(IOObp标记)。图8是序列比对，其显示当利用弓丨物对p-AHAS NIDF/AHAS 122TWT或弓丨物对p-AHASNIDF/AHAS 122TMU扩增每种单倍型(Hap)的向日葵基因组DNA时，向日葵AHASLl单倍型的核苷酸序列中的区别。引物的位置用箭头显示。AHASLl核苷酸序列中编码(ACC)n重复(编码推定的转运肽中的多聚-Thr区)和INDELS的核苷酸序列分别以粗体和高亮表示。(ACC)n 重复和INDELS被认为相应于编码AHASLl转运肽的AHASLl核苷酸序列的部分。A122T单核苷酸多态性(SNP)的位置通过箭头(▼)来表示。序列末端的数字表示当用p-AHAS NIDF/AHAS122TWT (Hapl-5)或 p-AHAS NIDF/AHAS 122TMU(Hap6)引物对扩增时，每个单倍型的预期片段大小。图9是利用来自AHASL1A122T等位基因(HET)杂合型、AHASL1A122T等位基因纯合型(突变体)、或AHASLl基因座上野生型(WT)植物的向日葵组织DNA提取物所获得的PCR扩增产物的照片示例。如实施例7中所述进行PCR扩增，并通过2% (w/v)琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离该PCR产物。
图10是2007年在四处田间位置上对于四种不同类型的杂种，在处理后的9-12天(左图)和处理后的25-30天(右图)所测定的、在200g ai/ha咪草啶酸下的农作物损伤(平均％植物毒性)的图示。这四处位置为Velva, ND,美国；Angers,法国；Saintes法国和Formosa，阿根廷。图10中所显示的四种不同类型的杂种为A122T纯合的(CLHA-Plushomo)、A122T/A205 (CLHA-Plus/IMISUN hetero)、A122T 杂合的(CLHA-Plus hetero)、和A205V 纯合的(IMISUN homo)。左图。图11是在施用咪草唳酸(imazamox)后携带CLHA-Plus突变的不同类型向日葵杂种的农作物损伤的图示。图11中所表示的四种不同类型的杂种是A122T纯合型的(CLHA-Plus homo)、A122T/A205 (CLHA-Plus/ IMISUN hetero)、A122T 杂合型的(CLHA-Plushetero)、和 A205V 纯合型的(IMISUN homo)。图12是在施用灭烟草后携带CLHA-Plus突变的不同类型向日葵杂种的农作物损伤的图示(CLHA-Plus 纯合的b = 0. 20±0· 06，P < 0. 048CLHA-Plus/MISUN 杂合的b O. 26±0· 07，P < O. 0019 ；CLHA-Plus/WT b :0. 55±0· 18，P < 0. 0109)。图 11 中所表示的四种不同类型的杂种是Α122Τ纯合型的(CLHA-Plus homo) ,A122T/A205 (CLHA-Plus/IMISUNhetero)、A122T 杂合型的(CLHA-Plus hetero)、和 A205V 纯合型的(IMISUN homo)。图13是在100 μ M咪草啶酸(左图)或100 μ M灭草烟(右图)存在下四种向日葵品系的AHAS酶活性(以未处理对照的百分比来表达)的图示。图14是在升高水平的咪草啶酸的存在下五种向日葵品系的AHAS酶活性(以未处理对照的百分比来表达)的图示。序列表所附的序列表中列的核苷酸和氨基酸序列是利用标准的字母缩写表示核苷酸碱基、用三字母代码表示氨基酸来显示的。所述核酸序列遵循标准惯例，起始于序列的5’端并向3’端延伸(即每行中从左向右)。仅显示了每种核苷酸的一条链，但应当理解可通过参考所示的链而将其互补链包括在内。所述氨基酸序列遵循标准惯例，起始于序列的氨基端并向其羧基端延伸(即，在每行中从左向右)。SEQ ID NO 1表示P-AHAS18的核苷酸序列。
SEQ ID NO 2表示P-AHAS19的核苷酸序列。SEQ ID NO 3 表示 p-AHAS NIDF 的核苷酸序列。SEQ ID NO :4 表示 AHAS 122TWT 的核苷酸序列。SEQ ID NO :5 表示 AHAS 122TMU 的核苷酸序列。SEQ ID NO 6表示图8中所示的向日葵单倍型I (Hapl)的AHASLl —部分的核苷酸序列。SEQ ID NO 7表示图8中所示的向日葵单倍型2 (Hap2)的AHASLl —部分的核苷酸序列。SEQ ID NO 8表示图8中所示的向日葵单倍型3 (Hap3)的AHASLl —部分的核苷酸序列。SEQ ID NO 9表示图8中所示的向日葵单倍型4(Hap4)的AHASLl —部分的核苷酸序列。SEQ ID NO 10表示图8中所示的向日葵单倍型5 (Hap5)的AHASLl —部分的核苷酸序列。SEQ ID NO 11表示图8中所示的向日葵单倍型6 (Hap6)的AHASLl —部分的核苷酸序列。SEQ ID NO 12表示图8中所示AHASLl核苷酸序列内对应于引物p-AHAS NIDF的位置的核苷酸序列(参见图8中的上箭头)。引物p-AHASNIDF与SEQ ID NO 12所示核苷酸序列的互补核苷酸序列退火。SEQ ID NO 13 表示引物 AHAS 122TWT 在图 8 所示的 Hapl_Hap5 的 AHASLl 核苷酸序列(分别为SEQ ID NOS 6-10)内退火位点的核苷酸序列(参见图8中的下箭头)。SEQ ID NO 14表示引物AHAS 122TWU在图8所示的Hap6的AHASLl核苷酸序列(SEQ ID N011)内退火位点的核苷酸序列(参见图8中的下箭头)。SEQ ID NO 15表示HA122CF的核苷酸序列。SEQ ID NO 16表示HA122wt的核苷酸序列。SEQ ID NO 17 表示 HA122mut 的核苷酸序列。SEQ ID NO 18表示HA122CR的核苷酸序列。SEQ ID NO :19表示编码包含A122T氨基酸置换的除草剂抗性AHASLl蛋白质的部分长度核苷酸序列，所述AHASLl蛋白质来自W02007005581中所述的向日葵品系S4897和GM40。SEQ ID N0:19 对应于 WO 2007005581 的 SEQ ID N0:1。SEQ ID NO :20表示除草剂抗性AHASLl蛋白质的部分长度氨基酸序列，其由SEQID NO :19中所示的核苷酸序列编码。SEQ ID N0:20对应于WO 2007005581的SEQ ID NO:2。SEQ ID NO 21表示编码包含P197L氨基酸置换的成熟的除草剂抗性AHASLl蛋白质的核苷酸序列，所述AHASLl蛋白质来自W02006024351中所述的向日葵品系MUT28。SEQID NO 21 对应于 WO 2006024351 的 SEQ ID NO :5。SEQ ID NO 22表示成熟的除草剂抗性AHASLl蛋白质的氨基酸序列，其由SEQ IDNO 21中所示的核苷酸序列编码。SEQ ID NO 21对应于WO 2006024351的SEQ ID NO :6。SEQ ID NO 23表示编码包含A205V氨基酸置换的成熟的除草剂抗性AHASLl蛋白质的核苷酸序列，所述AHASLl蛋白质来自GenBank检索号AY541455和Kolkman等(2004)Theor. Appl. Genet. 109 :1147-1159 中所述的向日葵单倍型 5。SEQ ID N0:23 对应于GenBank检索号AY541455的核苷酸序列的核苷酸244-1959。SEQ ID NO :24表示成熟的除草剂抗性AHASLl蛋白质的氨基酸序列，其由SEQ IDNO 23中所述核苷酸序列编码。SEQ ID NO 24对应于GenBank检索号AY541455的核苷酸 序列所编码的氨基酸序列的氨基酸82-652。发明详述本发明涉及除草剂抗性向日葵植物，在其基因组中包含向日葵AHASLl基因的两种不同的等位基因。两种不同等位基因的每种均编码向日葵AHASLl蛋白质，其包含与野生型向日葵AHASLl氨基酸序列有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列。已知本发明的每种AHASLl等位基因为向日葵植物提供了对AHAS抑制性除草剂，特别是咪唑啉酮和磺脲类除草剂增强的抗性或耐受性。本发明另外涉及制备这些向日葵植物的方法和控制生长于本发明向日葵植物附近的杂草或不需要的植物的方法。本发明是基于下列发现，包含向日葵AHASLl的两种不同除草剂抗性等位基因中每种的单一拷贝的Fl代杂交向日葵植物包含的对AHAS抑制性除草剂的商业上可接受水平的抗性。因而，本发明发现了通过允许植物育种工作者维持例如第一除草剂抗性AHASLl等位基因纯合型的第一向日葵品系和第二除草剂抗性AHASLl等位基因纯合型的第二向日葵品系来生产杂种向日葵植物的用途。在本发明特定的实施方案中，方法包括除草剂耐受的或除草剂抗性植物的使用。“除草剂耐受”或“除草剂抗性”植物，指的是对至少一种除草剂在通常杀死或抑制正常或野生型植物生长的水平上是耐受的或抗性的植物。在本发明的一项实施方案中，本发明的除草剂耐受植物包含除草剂耐受或除草剂抗性的AHASL蛋白。“除草剂耐受的AHASL蛋白”或“除草剂抗性的AHASL蛋白”指的是这样的蛋白质，当至少一种已知干扰AHAS活性的除草剂存在以及处于已知抑制野生型AHASL蛋白的AHAS活性的除草剂浓度或水平时，其显示出相对于野生型AHASL蛋白的AHAS活性更高的AHAS活性。另外，此类除草剂耐受或除草剂抗性AHASL蛋白的AHAS活性在本文中可称为“除草剂耐受”或“除草剂抗性” AHAS活性。对于本发明，术语“除草剂耐受”和“除草剂抗性的”可互换使用，并认为其具有相同的含义和相同的范围。同样，对于本发明，术语“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”可互换使用，并认为其具有相同的含义和相同的范围。同样，术语“咪唑啉酮抗性的”和“咪唑啉酮抗性”可互换使用并认为其分别与术语“咪唑啉酮耐受的”和“咪唑啉酮耐受”为相同的含义和相同的范围。
本发明提供了对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂具有增强的抗性或耐受性的植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞。优选的除草剂的量或浓度是“有效量”或“有效浓度”。“有效量”或“有效浓度”分别指的是有效杀死或抑制类似的野生型植物、植物组织、植物细胞、或宿主细胞的量和浓度，但所述量并不如此严重地杀死或抑制本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞、和宿主细胞。通常，除草剂的有效量或有效浓度是农业生产系统中杀死目标杂草所常规使用的量或浓度。该量是本领域中普通技术人员已知的或可容易测定的。在特定实施方案中，本发明提供了包含对AHAS抑制性除草剂的商业上可接受水平的抗性或耐受性的向日葵植物。除非本文另有说明或另外从上下文可显而易见的，包含对AHAS抑制性除草剂的该水平的抗性或耐受性的向日葵植物对于有效量或有效浓度的至少一种AHAS抑制性除草剂的施用是抗性的或耐受的。如上所述，除草剂的有效量或浓度是农业生产系统中杀死杂草或目标杂草所常规使用的量或浓度，该量是本领域中普通技术人
员已知的或可容易测定的。“类似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别指的是缺少本文所述的本发明的除草剂抗性特征和/或特定多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，使用术语“野生型”并非有意暗示植物、植物组织、植物细胞或其它宿主细胞在其基因组中缺乏重组DNAjP /或缺乏不同于本文所述的除草剂抗性特征。除非另有清楚说明，本文中所用的术语“植物”指的是处于任何发育阶段的植物，以及可附着于或脱离整个完整植物的植物的任一部分或多个部分。此类植物部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞。特定植物部分的例子包括茎、叶、根、花序、花、小花、果实、花梗、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴细胞、保卫细胞、及任何其它已知的植物器官、组织、和细胞。此外，种子是植物这一点是公认的。一方面，本发明提供在其基因组中包含至少一拷贝的AHASLl A122T突变型等位基因和至少一拷贝的AHASLl A205T突变型等位基因的向日葵植物。此种向日葵植物包含针对至少一种AHAS抑制性除草剂特别是咪唑啉酮除草剂的商业上可接受水平的耐受性。此类植物被发现可用于农业中、特别是涉及使用如本文所述的咪唑啉酮除草剂控制杂草的方法中。另一方面，本发明提供在其基因组中包含至少一拷贝的AHASL1A122T突变型等位基因和至少一拷贝AHASLl P197L突变型等位基因的向日葵植物。此种向日葵植物包含针对至少一种AHAS抑制性除草剂特别是磺脲类和/或咪唑啉酮除草剂的商业上可接受水平的耐受性。此类植物被发现可用于农业中、特别是涉及使用如本文所述的咪唑啉酮和/或磺脲类除草剂控制杂草的方法中。本发明涉及包含AHASLl基因的向日葵植物的用途，所述AHASLl基因包含A122T突变。该AHASLl基因编码包含A122T氨基酸置换的AHASLl蛋白质。本发明并不依赖于包含具有A122T突变的AHASLl基因的特定向日葵品种、品系或植物的用途。可将任何包含至少一个具有A122T突变的AHASLl基因的等位基因的向日葵植物用于本文所述的方法中。在本发明的一项实施方案中，具有A122T突变的AHASLl基因包含含有SEQ ID NO: 19所述核苷酸序列或编码SEQ ID NO :20所述氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。
包含至少一拷贝AHASLl A122T突变型等位基因的向日葵品系的一个例子是GM40 (参见，W02007005581和2005年7月I日提交的美国临时专利申请系列号60/695，952，将二者均引入本文作为参考)。GM40向日葵种子于2005年5月17日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110)的专利保藏所并分配ATCC专利保藏号PTA-6716。向日葵品系GM40保藏期限为至少30年并且在ATCC收到提供保藏样品的最近要求之后保藏至少5年。另外，申请人已满足了 37C.F. R. § § 1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。包含至少一拷贝AHASLl A122T突变型等位基因的向日葵品系的另一例子为GM1606(参见，W02007005581)。GM1606向日葵种子于2006年5月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯20110)的专利保藏所并分配ATCC专利保藏号PTA-7606。向日葵GM1606保藏期限为至少30年、并在ATCC收到提供保藏样品的最近要求之后至少5年。另外，申请人已满足了 37C.F. R. § § 1.801-1.809的所有要求，包括提供样品的存活证明。
本发明涉及使用包含AHASLl基因的向日葵植物的用途，所述AHASLl基因包含A205V突变。该AHASLl基因编码包含A205V氨基酸置换的AHASLl蛋白质。本发明并不依赖于包含具有A205V突变的AHASLl基因的特定向日葵品种、品系或植物的用途。可将包含至少一个具有A205V突变的AHASLl基因的等位基因的任何向日葵植物用于本文所述的方法中。在本发明的一项实施方案中，具有A205V突变的AHASLl基因包含含有SEQ ID NO23所述核苷酸序列或编码SEQ ID NO :24所述氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。包含至少一种具有A205V突变的AHASLl基因等位基因的向日葵植物广泛用于商业化向日葵生产并很容易获得。任何此类商业可获得的向日葵植物品种均可用于本文所述的方法中。此类品种可从多个商品种子公司(例如Nidera S. A. ,Buenos Aires,Argentina ;Dekalb Genetics Corporation, Dekalb, IL, USA ；Mycogen Seeds, Indianapolis, IN, USA ；Seeds 2000, Breckenridge, MN, USA ；Triumph Seed Company, Ralls, TX, USA)来源获得，并且其包括但不限于 Paraiso 101CL, Paraiso 102CL, DKF38, -80CL,8H429CL,8H419CL,8H386CL,8H358CL,629CL,630, CL,4682NS/CL,4880NS/CL, Barracuda, Charger, Viper,620CL，650CL，和660CL。另外，包含至少一种具有A205V突变的AHASLl基因等位基因的向日葵植物种子由科罗拉多州、福特科林斯的国家遗传资源保藏中心保藏，可通过检索号PI633749 和 PI633750 来获得。本发明涉及使用包含AHASLl基因的向日葵植物的用途，所述AHASLl基因包含P197L突变。该AHASLl基因编码包含P197L氨基酸置换的AHASLl蛋白质。本发明并不依赖于包含具有P197L突变的AHASLl基因的特定向日葵品种、品系或植物的用途。可将包含至少一个具有P197L突变的AHASLl基因的等位基因的任何向日葵植物用于本文所述的方法中。包含至少一种具有P197L突变的AHASLl基因等位基因的向日葵植物已在W02006024351和美国国家阶段专利申请系列号11/659,007(国际申请日2005年7月29日)中公开；将二者均引入本文作为参考。在本发明的一项实施方案，具有P197L突变的AHASLl基因包含含有SEQ ID NO 21所述核苷酸序列或编码SEQ ID NO 22所述氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。包含至少一种具有P197L突变的AHASLl基因等位基因的向日葵品系已由美国农业研究服务部所公开分发。三种品系是HA469、RHA470、和RHA471。三种品系中每种的种子均可从美国北达科他州58105Fargo北达科他州立大学Loftsgard Hall植物科学系种畜项
目获得。本发明涉及在向日葵AHASLl基因中具有突变的向日葵植物。这些突变产生了向日葵AHASLl蛋白质，当将该蛋白与野生型向日葵AHASLl蛋白质的氨基酸序列相比时，其氨基酸序列中包含了特定的氨基酸置换。此类氨基酸置换包括例如，A122T、A205V、和P197L。“A122T”指的是在与拟南芥AHASLl蛋白质中122位氨基酸相对应的向日葵AHASLl蛋白质位置上用苏氨酸置换丙氨酸。“A205V”是指在与拟南芥AHASLl蛋白质中205位氨基酸相对应的向日葵AHASLl蛋白质位置上用缬氨酸置换丙氨酸。“P197L”是指在与拟南芥AHASLl蛋白质中197位氨基酸相对应的向日葵AHASLl蛋白质位置上用亮氨酸置换脯氨酸。除非另外指出或从上下文显而易见，本文所述的向日葵AHASLl蛋白质中的氨基酸位置是在已详细研究的拟南芥AHASLl蛋白质中的相应位置。相应于拟南芥AHASLl氨基 酸位置122、197和205的向日葵AHASLl蛋白质中的氨基酸位置分别是107、182和190。参见TO2007005581(其中表4)获得有关已知氨基酸置换位置的其它信息，以及它们在向日葵和拟南芥AHASLl蛋白质中的相应位置，所述置换赋予了 AHASL蛋白的除草剂抗性。本发明提供了在本文所公开的向日葵AHASLl蛋白质保守区内的特定氨基酸位置上具有氨基酸置换的AHASL蛋白。另外，普通技术人员将认识到，此类氨基酸位置可取决于是否在例如氨基酸序列的N末端添加或除去氨基酸而改变。因此，本发明包含在所述位置或等同位置上的氨基酸置换。“等同位置”是指与例举的氨基酸位置相同的保守区内的位置。此类保守区是本领域中已知的(参见W020070055581中的表4)、或可通过多序列比对或通过本领域已知的其它方法来测定。本发明另外提供了生产包含对至少一种AHAS抑制性除草剂具有抗性的杂种向日葵植物的方法。该方法包括将第一向日葵植物与第二向日葵植物异花受粉从而产生杂种向日葵种子，可种植该种子并促使其生长成杂交向日葵植物，特别是Fl代杂交向日葵植物。第一向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASLl基因的第一等位基因，第二向日葵植物在其基因组中包含至少一个拷贝的AHASLl基因的第二等位基因。优选地，第一向日葵植物是第一等位基因纯合型的，第二向日葵植物是第二等位基因的纯合型的。第一等位基因编码包含A122T氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白质。第二 AHASLl等位基因编码包含A205V氨基酸置换或P197L氨基酸置换的向日葵AHASLl蛋白质。生产杂种向日葵植物的方法可进一步包括收获从所述杂交获得的种子并从所述杂交筛选至少一个子代向日葵植物，该植物在其基因组中包含所述第一和所述第二等位基因。该子代可通过本领域中已知的任何方法来筛选，包括PCR扩增AHASLl基因的全部或部分来确定存在于植物中的等位基因。用于此PCR扩增中的DNA可从杂交所获得的向日葵种子部分或从该种子生长出的植物部分得到。在下面的实施例2中，提供了包括PCR扩增的用于筛选目标子代植物的本发明优选方法。备选地，可通过如下文所述的在温室或田间条件下的除草剂抗性测试中评估子代植物的性能来筛选子代植物。在本发明优选的实施方案中，通过将A205V AHASLl等位基因纯合型的第一向日葵植物与AHASL1A122T等位基因纯合型的第二向日葵植物杂交来生产本发明的杂种向日葵植物。预期所有获得的杂种种子和从该种子生长出的杂种植物均在其基因组中包含一个A205V AHASLl等位基因和一个AHASL1A122T等位基因。在此优选的实施方案中，第一或第二向日葵均可作为杂交的花粉供体。在本发明的另一优选实施方案中，通过将P197L AHASLl等位基因纯合型的第一向日葵植物与AHASL1A122T等位基因纯合型的第二向日葵植物杂交来生产本发明的杂种向日葵植物。预期所有获得的杂种种子和从该种子生长出的杂种植物均在其基因组中包含一个P197L AHASLl等位基因和一个AHASL1A122T等位基因。在此优选的实施方案中，第一或第二向日葵均可作为杂交的花粉供体。对于本发明，除非另外清楚指出或从上下文中显而易见，“子代植物”是从本发明的至少一株植物遗传得到的任何植物，包括但不限于本发明植物的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、和第十代后代。优选地，此类子代或后代包含与野生型植物相比时对至少一种咪唑啉酮除草剂增强的抗性，且此类子代或后代进一步包含至少一种选自A122T、A205V和P197L等位基因的突变AHASLl等位基因。甚至更优选地，此类子代或后代包含与野生型植物相比时对至少一种咪唑啉酮除草剂增强的抗性，且此类子代或后代进一步包含两种不同的选自A122T、A205V和P197L等位基因的突变AHASLl等位基因。 在本发明的一项实施方案中，本发明的向日葵植物包含A122T等位基因并产生包含可提取的种子油的种子，所述种子油包含至少85% (w/w)的油酸或每千克油850g油酸。优选地,通过分析植物油的标准方法(例如，Official Methods of Analysis ofAssociation of the Official Analytical Chemists(1990)W. Horwitz, ed.,第 14 版，Washington,D. C.和/或AOCS-American Oil ChGmistsjSociety,Official and TentativeMethods of the American Oil Chemists’ Society(1998)第 5 版，Chicago, Illinois 中所述的方法)来测定本发明向日葵种子油中％油酸含量。本发明提供了用于增强植物、植物组织、植物细胞、或其它宿主细胞对至少一种干扰AHAS酶活性的除草剂的耐受性或抗性的方法。优选地，该除草剂为咪唑啉酮除草剂、磺脲类除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草剂、或其混合物。更优选地，该除草剂是咪唑啉酮除草剂、磺脲类除草剂、或其混合物。对于本发明，咪唑啉酮除草剂包括但不限于PURSUIT (咪草烟)、CADRE (甲基咪草烟)，RAPTOR (咪草啶酸)，SCEPTER (灭草喹)，ASSERT (imazethabenz), ARSENAL (灭草烟)，任何前述除草剂的衍生物，以及两种或多种前述除草剂的混合物，例如，灭草烟/咪草啶酸(ODYSSEY )。更特别地，咪唑啉酮除草剂可选自，但不限于，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)_烟酸、[2-(4-异丙基)-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3-喹啉羧酸、5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)-烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸、以及6-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯和2-(4-异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和2_ (4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)_烟酸是优选的。使用2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)_烟酸是特别优选的。
对于本发明，磺脲类除草剂包括但不限于绿黄隆、甲黄隆、嘧黄隆、氯嘧黄隆、噻吩磺隆、苯黄隆、苄嘧黄隆、烟嘧黄隆、胺苯黄隆、玉嘧黄隆、氟胺磺隆、醚苯黄隆、氟嘧黄隆、醚黄隆、磺氨黄隆、啶咪黄隆、吡啶磺隆、吡氯黄隆、四唑黄隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧黄隆、啶嘧黄隆、氟啶嘧黄隆、甲酰胺黄隆、碘黄隆、环丙氧黄隆、磺胺磺隆、氟丙黄隆、乙黄黄隆、三氟啶磺隆、氟胺黄隆、任一上述除草剂的衍生物、以及两种或多种上述除草剂的混合物。本发明的三唑并嘧啶除草剂包括但不限于，唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺、和五氟磺草胺。本发明的嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂包括但不限于，双嘧苯甲酸、嘧硫苯甲酸、肟啶草、嘧苯草肟和环酯草醚。磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括但不限于，氟酮磺隆和丙苯黄隆。公认嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂与嘧啶基硫代苯甲酸除草剂是密切相关的，且由美国杂草科学协会将其统一概括在后者的标题下。因此，本发明的除草剂进一步包括嘧啶基硫代苯甲酸除草剂，包括但不限于上述嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。本发明的除草剂抗性向日葵植物被发现可用于控制杂草的方法中。因此，本发明另外提供了控制本发明除草剂抗性向日葵植物附近的杂草的方法。该方法包括对杂草和除草剂抗性向日葵植物施用有效量的除草剂，其中所述植物当与野生型向日葵植物相比时具·有对至少一种除草剂特别是咪唑啉酮或磺脲类除草剂增强的抗性。在一项实施方案中，本发明提供了控制感染的向日葵植物上称为列当的寄生杂草(列当属)的方法。该列当属包括例如Orobanche cumana和弯管列当。该方法包括对杂草和本发明的除草剂抗性向日葵植物施用有效量的咪唑啉酮除草剂，特别是包含两拷贝AHASL1A122T等位基因的向日葵植物、或包含一拷贝AHASL1A122T等位基因和一拷贝A205VAHASLl等位基因的向日葵植物。在优选的实施方案中，咪唑啉酮除草剂时灭草烟。优选地，在生长阶段晚期或生殖阶段早期施用AHAS抑制性除草剂。更优选地，在生殖阶段早期施用除草剂。最优选地，在Rl生长阶段施用除草剂。除非另有说明，本文中向日葵生长状态指的是Schneiter和Miller (1981)CropSci. 21 =901-903中所述的生长阶段。通过提供具有对除草剂特别是咪唑啉酮和磺脲类除草剂具有增强的抗性的向日葵植物，很多种制剂可用于保护植物免受杂草干扰，从而增强植物生长和减少营养竞争。除草剂本身可用于出苗前、出苗后、种植前和种植时对本文所述植物周围区域中杂草的控制，或者咪唑啉酮除草剂制剂可包含其它添加剂来使用。也可将除草剂用作种子处理。咪唑啉酮或磺脲类除草剂制剂中所发现的添加剂包括其它除草剂、去污剂、佐剂、铺展剂、粘着剂、稳定剂等等。除草剂制剂可为湿的或干的制剂，可包括但不限于可流动的粉末、可乳化的浓缩物、和液体浓缩物。除草剂和除草剂制剂可根据常规方法例如通过喷雾、灌溉、撒粉等等来施用。本发明提供了对至少一种除草剂特别是AHAS抑制性除草剂、更特别地是咪唑啉酮和磺脲类除草剂具有增强的耐受性的非转基因和转基因种子。此类种子包括例如非转基因向日葵种子，其包含向日葵植物S4897、向日葵植物GM40、向日葵植物GM1606、具有ATCC专利保藏号PTA-6716的向日葵植物、或具有ATCC专利保藏号PTA-7606的向日葵植物的除草剂耐受特性，以及包含编码除草剂抗性AHASL蛋白的本发明多核苷酸分子的转基因种子。
本发明提供了涉及使用至少一种选自下列的AHAS抑制性除草剂的方法咪唑啉酮除草剂、磺脲类除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰氨基-羰基三唑啉酮除草剂、及其混合物。在这些方法中，AHAS抑制性除草剂可通过本领域已知的任何方法来施用，包括但不限于种子处理、土壤处理和叶处理。在施用之前，可将AHAS抑制性除草剂转换为常规制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬齐U、粉尘剂、粉剂、糊剂和粒剂。使用形式取决于特定的预期目的，在每种情况下，均应确保本发明化合物的良好和均匀分布。以已知的方式制备制剂(参见，例如US 3，060，084，EP-A 707445(有关液体浓缩物)，Browning, " Agglomeration " , Chemical Engineering, Dec. 4,1967,147-48,Perry ' s Chemical Engineer ' s Handbook,第 4 版，McGraw-Hill, New York,1963,pages 8-57 以及下列等等，WO 91/13546，US 4，172,714，US 4，144,050，US 3,920,442，US 5，180，587，US 5，232，701，US5, 208，030，GB 2，095，558，US 3，299，566，Kling m an,Weed Control as a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，Hance等·，Weed Control Handbook，等 8 片反，Blackwell Scientific Publications，Oxford,1989and Mollet，H.，Grubemann，A.，Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH，Weinheim(Germany)，2001，2. D. A. Knowles, Chemistryand Technology of AgrochemicalFormulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,1998(ISBN 0-7514-0443-8)，例如通过利用适于农用化学品制剂的辅料(例如溶剂和/或载体，需要的话，乳化剂、表面活性剂和分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理制剂还任选着色剂和/或粘合剂和/或胶凝剂)来配制活性化合物。合适溶剂的例子有水、芳族溶剂(例如，Solvesso产品、二甲苯)、石腊(例如矿物油馏分)、醇(例如甲醇、丁醇、戊醇、苯甲醇)、酮(例如环己酮、Y-丁内酯)、吡咯烷酮(ΝΜΡ，Ν0Ρ)、乙酸酯(二乙酸乙二醇酯)、二元醇、脂肪酸二甲基酰胺、脂肪酸和脂肪酸酯。原则上，也可使用溶剂混合物。合适载体的例子有碾磨的天然矿物(例如高岭土、粘土、滑石、白垩)和碾磨的合成矿物(例如高度分散的硅土、硅酸盐)。合适的乳化剂有非离子和阴离子乳化剂(例如聚氧乙烯脂肪醇醚、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐)。分散剂的例子有木质素-亚硫酸盐废液和甲基纤维素。所使用的合适的表面活性剂有木质素磺酸、萘磺酸、酚磺酸、二丁基萘磺酸的碱金属盐、碱土金属盐和铵盐、烷基芳基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、脂肪醇硫酸盐、脂肪酸和硫酸化脂肪醇乙二醇醚，另外磺酸萘和萘衍生物与甲醛的缩合物、萘或萘磺酸与酚和甲醛的缩合物、辛基酚聚氧乙烯醚、乙氧基化异辛基酚、辛基酚、壬基酚、烷基酚聚乙二醇醚、三丁基苯基聚乙二醇醚、三硬脂酰苯基聚乙二醇醚、烷基芳基聚醚醇、醇和脂肪醇环氧乙烷羧化物、乙氧基化蓖麻油、聚氧乙烯烷基醚、乙氧基化聚氧丙烯、十二醇聚乙二醇醚乙缩醛、山梨醇酯、木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。适合制备可直接喷雾的溶液剂、乳剂、糊剂或油分散体的物质有中等至高沸点的矿物油馏分，例如煤油或柴油，另外有煤焦油和植物或动物来源的油、脂肪烃、环烃和芳香烃，例如甲苯、二甲苯、石蜡、四氢萘、烷基化萘、或其衍生物、甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、环己醇、环己酮、异佛尔酮、高极性溶剂，例如二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮或水。另外可将防冻剂例如甘油、乙二醇、丙二醇和杀菌剂加入制剂中。合适的消泡剂有例如基于硅或硬脂酸镁的消泡剂。合适的防腐剂有例如二氯酌■和enzylalkoholhemiformal。种子处理制剂可另外包含粘合剂和任选地着色剂。可加入粘合剂以促进处理后活性物质对种子的粘附。合适的粘合剂有嵌段共聚物Ε0/Ρ0表面活性剂，还有聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚乙烯胺、聚乙烯酰胺、聚乙烯亚胺(Xupasol , Polymin )、聚醚、聚氨基甲酸酯、聚乙烯乙酸酯、甲基纤维素以及衍生自这些聚合物的共聚物。
任选地，着色剂可包括在制剂中。用于种子处理制剂的合适的着色剂有罗丹明B、C. I.颜料红112、C. I.溶剂红I、颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝15: I、颜料蓝80、颜料黄I、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53: I、颜料橙43、颜料橙34、颜料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄23、碱性红10、碱性红108。合适的胶凝剂的例子有角叉菜胶(Satiagel )。粉剂、用于散布的材料、以及粉尘化产品可通过混合或伴随研磨活性物质与固体载体来制备。粒剂，例如包衣粒剂、浸溃粒剂和均一粒剂，可通过将活性化合物结合至固体载体来制备。固体载体的例子有矿物土例如娃胶、娃酸盐、滑石、高岭土、镁质粘土(attaclay)、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、碾磨的合成材料、肥料、例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素，以及蔬菜来源的产品，例如谷粉、树皮粉、木粉粉、坚果壳粉、纤维素粉和其它固体载体。通常，制剂包含按重量计0.01-95%、优选按重量计0. 1-90%的AHAS抑制性除草齐U。在此方面，AHAS抑制性除草剂以按重量计90%-100%、优选以重量计95%-100% (根据核磁共振光谱)的纯度被使用。为进行种子处理，可将各个制剂稀释2-10倍，达到直接应用制剂时的浓度为活性化合物以重量计0. 01-60%，优选以重量计0. 1-40%。AHAS抑制性除草剂可以其制剂的形式或从该形式中制备的使用形式来使用，例如以直接可喷雾溶液、粉剂、悬浮液或分散体、乳剂、油分散体、糊剂、粉尘化产品、用于分散的材料、或颗粒的形式，通过喷雾、雾化、撒粉、散布或倾析的方式来使用。使用形式完全取决于其预期目的，在每种情况下均预期确保本发明的AHAS抑制性除草剂最好的可能分布。通过向乳剂浓缩物、糊剂或可湿性粉剂(可喷雾粉剂，油分散体)添加水可制备水性使用形式。为制备乳剂、糊剂或油分散体，可将所述的物质或溶解于油或溶剂中的物质通过湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂在水中匀化。然而，还能够制备由活性物质、湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂以及如果合适的话溶剂或油组成的浓缩物，此类浓缩物适合用水进行稀释。直接应用制剂中活性化合物的浓度可在相对宽的范围内变动。通常，它们可为每份重量 0. 0001-10%,优选 0. 01-1 %。AHAS抑制性除草剂还可用超低容量方法(ULV)成功使用，能够施用包含以重量计超过95%的活性化合物的制剂，或甚至施用无添加剂的活性化合物。
下面是制剂的例子I.用于叶面施用的用水稀释的产品。为进行种子处理，可将稀释的或未稀释的此类产品施用于种子。A)水溶性浓缩物(SL，LS)将以重量计的10份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计90份的水中或水溶性溶剂中。备选地，加入湿润剂或其它辅助物。一旦用水稀释，AHAS抑制性除草剂便溶解，从而获得了具有10% (w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。B)可分散浓缩物(DC)将以重量计的20份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计的70份环己酮，加入以重量计的10份分散剂，例如聚乙烯吡咯烷酮。用水稀释使其分散，从而获得具有20% (w/w) AHAS抑制性除草剂的制剂。C)可乳化的浓缩物(EC)将以重量计的15份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计的7份二甲苯，加入十二烷基苯磺酸钙和蓖麻油乙氧基化物(以重量计每种5份)。用水稀释得到乳液，从而获得具有15% (w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。D)乳剂(EW、E0、ES)将以重量计的25份AHAS抑制性除草剂溶解于以重量计的35份二甲苯，加入十二烧基苯磺酸I丐和蓖麻油乙氧基化物(以重量计每种5份)。通过乳化器(例如Ultraturrax)在该混合物中引入以重量计30份的水，制成均匀乳剂。用水稀释使其乳化，从而获得具有25% (w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。E)悬浮液(SC、0D、FS)在搅拌式球磨机中，将以重量计20份的AHAS抑制性除草剂研磨成粉剂，加入以重量计的10份分散剂、湿润剂，以及以重量计70份水或有机溶剂从而产生优良的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生了 AHAS抑制性除草剂的稳定悬浮液，从而获得具有20%(w/w) AHAS抑制性除草剂的制剂。F)水可分散粒剂和水溶性粒剂(WG、SG)将以重量计的50份AHAS抑制性除草剂进行精细研磨，加入以重量计50份的分散剂和湿润剂，通过技术器具(例如，挤压、喷雾塔、流化床)将其制成水可分散的或水溶性的粒齐U。用水稀释产生了 AHAS抑制性除草剂的稳定的分散体或溶液，从而获得具有50% (w/w)AHAS抑制性除草剂的制剂。G)水可分散粉剂和水溶性粉剂(WP、SP、SS、WS)将以重量计75份的AHAS抑制性除草剂在转子-定子研磨机中研磨，加入以重量计的25份分散剂、湿润剂和硅胶。用水稀释产生了 AHAS抑制性除草剂的稳定分散体或溶液，从而获得具有75% (w/w) AHAS抑制性除草剂的制剂。H)凝胶制剂(GF)在搅拌式球磨机中，将以重量计20份的AHAS抑制性除草剂研磨成粉，加入以重量计10份分散剂、以重量计I份胶凝剂湿润剂和以重量计70份水或有机溶剂，从而产生细小的AHAS抑制性除草剂悬浮液。用水稀释产生了 AHAS抑制性除草剂的稳定悬浮液，从而获得具有20% (w/V)AHAS抑制性除草剂的制剂。该凝胶制剂适合用于种子处理。
2.用于叶面施用的非稀释用产品。为进行种子处理，可对种子施用稀释的此类产品OA)粉尘化的粉剂(DP、DS)将以重量计5份的AHAS抑制性除草剂精细研磨，并与以重量计95份细分的高岭土紧密混合。这产生了具有5% (w/w)AHAS抑制性除草剂的粉尘化产品。B)粒剂(GR、FG、GG、MG)将以重量计的半份AHAS抑制性除草剂精细研磨，并与以重量计95. 5份的载体结合，从而获得具有O. 5% (w/w)的AHAS抑制性除草剂的制剂。目前的方法有挤压、喷雾干燥或流化床。这产生了非稀释施用于叶面的粒剂。常规种子处理制剂包括例如可流动的浓缩物FS、溶液LS、用于干燥处理的粉剂 DS、用于浆液处理的可分散粉剂WS、水溶性粉剂SS和乳剂ES和EC以及凝胶制剂GF。这些制剂可稀释或非稀释地施用于种子。对种子的施用在播种前进行，或直接施用于种子。在优选的实施方案中，将FS制剂用于种子处理。通常，FS制剂可包含l_800g/l活性成分、l_200g/l表面活性剂、0-200g/l防冻剂、0-400g/l粘合剂、0_200g/l颜料和达到I升的溶剂，优选水。对于种子处理，用除草剂处理根据本发明的除草剂抗性植物的种子，除草剂优选选自下列AHAS抑制性除草剂，例如磺氨黄隆、四唑黄隆、苄嘧黄隆、氯嘧黄隆、绿黄隆、醚黄隆、环丙黄隆、胺苯黄隆、乙氧嘧黄隆、卩定嘧黄隆、氟卩定嘧黄隆、氟定黄隆、甲酰胺黄隆、吡氯黄隆、啶咪黄隆、碘黄隆、磺胺磺隆、甲黄隆、烟嘧黄隆、环丙氧黄隆、氟嘧黄隆、氟丙黄隆、批嘧黄隆、玉嘧黄隆、嘧黄隆、乙黄黄隆、噻黄隆、醚苯黄隆、苯黄隆、三氟啶磺隆、氟胺黄隆、tritosulfuixm、咪草酯、咪草啶酸、灭草烟、灭草喹、咪草烟、唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺、五氟磺草胺、双嘧苯甲酸、肟啶草、丙苯黄隆、氟酮磺隆、嘧苯草肟、环酯草醚、嘧硫苯甲酸、及其混合物、或用包含AHAS抑制性除草剂的制剂处理。术语种子处理包含本领域已知的所有合适的种子处理技术，例如拌种、种子包衣、干式种子消毒、浸种、和种子丸化。根据本发明的一种变型，本发明的另一主题是通过特别是在播种机中施用任一颗粒制剂来处理土壤的方法所述颗粒制剂含有以组合物/制剂形式(例如，颗粒制剂)存在的AHAS抑制性除草剂，任选一种或多种固体或液体，农业上可接受的载体和/或任选一种或多种农业上可接受的表面活性剂。该方法有利地用于例如谷类、玉米、棉花和向日葵的苗床。本发明还包含用种子处理制剂包被的或含有该处理制剂的种子，所述制剂包含至少一种选自下列的AHAS抑制性除草剂磺氨黄隆、四唑黄隆、苄嘧黄隆、氯嘧黄隆、绿黄隆、醚黄隆、环丙黄隆、胺苯黄隆、乙氧嘧黄隆、卩定嘧黄隆、氟卩定嘧黄隆、甲酰胺黄隆、吡氯黄隆、啶咪黄隆、碘黄隆、磺胺磺隆、甲黄隆、烟喃黄隆、环丙氧黄隆、氟喃黄隆、氟丙黄隆、吡嘧黄隆、玉嘧黄隆、嘧黄隆、乙黄黄隆、噻黄隆、醚苯黄隆、苯黄隆、三氟啶磺隆、氟胺黄隆、咪草酯、咪草啶酸、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、咪草烟、唑嘧磺胺盐、唑嘧磺胺、双氟磺草胺、氟唑啶草、唑草磺胺、五氟磺草胺、双嘧苯甲酸、肟啶草、丙苯黄隆、氟酮磺隆、嘧苯草肟、环酯草醚、和嘧硫苯甲酸。术语种子包括所有种类的种子和植物繁殖体，包括但不限于真正的种子、种子块、吸根、球莖、鳞莖、果实、块茎、谷粒、插条、切枝等等，在优选实施方案中指的是真正的种子。术语“包被有和/或含有”通常表示施用时活性成分很大程度上在繁殖产品表面，尽管取决于施用方法的不同，或多或少的该成分渗入该繁殖产品。当所述繁殖产品(再)种植时，其可吸收活性成分。利用AHAS抑制性除草剂或含有该除草剂的制剂的种子处理应用可通过在植物播种前和植物出苗前对种子进行喷雾或撒粉来完成。种子的处理中，通过用有效量的AHAS抑制性除草剂或含有该除草剂的制剂处理种子来施用相应制剂。这里，施用比率通常是每IOOkg种子O. Ig至IOkg的活性成分(或活性成分的混合物、或制剂)，优选每IOOkg种子Ig至5kg,特别是每IOOkg种子Ig至2. 5kg。对于特定的作物例如莴苣，该比率可更高。
本发明提供了用于抑制不需要的植物或控制杂草的方法，其包括在播种前和/或催芽后将根据本发明的抗性植物的种子与AHAS抑制性除草剂接触。该方法可进一步包括播种种子，例如在田间的土壤中、或在温室的盆栽介质中。该方法被发现在抑制种子附近的不希望的植物或控制杂草方面特别有用。可将控制不需要的植物理解为杀死杂草和/或另外延缓或抑制杂草的正常生长的意思。杂草，广义而言，应理解为所有生长在不期望的位置的那些植物。本发明的杂草包括例如，双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于下列属的杂草白芥属、独行菜属、猪殃殃属、繁缕属、母菊属、春黄菊属、牛膝菊属、藜属、荨麻属、千里光属、苋属、马齿苋属、苍耳属、旋花属、番薯属、寥属、田菁属、豚草属、蓟属、飞廉属、苦苣菜属、茄属、揮菜属、节节菜属、母草属、野芝麻属、婆婆纳属、苘麻属、Emex、曼陀罗属、堇菜属、骆驼刺属、罂粟属、矢车菊属、三叶草属、毛茛属、和蒲公英属。单子叶杂草包括但不限于下列属的杂草稗属、狗尾草属、黍属、马唐属、梯牧草属、早熟禾属、羊茅属、掺属、臀形草属、黑麦草属、雀麦草属、燕麦草属、莎草属、高粱属、冰草属、狗牙根属、雨久花属、Fimbristyslis、慈姑属、荸荠属、莞草属、雀稗属、鸭嘴草属、尖瓣花属、龙爪茅属、剪股草属、看麦娘属、和Apera。其它双子叶杂草包括但不限于，感染向日葵的寄生植物，特别是，列当属(列当)，例如，Orobanche cumana和弯管列当。另外，本发明的杂草可包括例如，生长在不期望位置的作物植物。例如，生长在主要包含大豆植物的田间中的自生型玉米可被视为杂草，如果该玉米植物并不被期望在该大豆植物的田间中的话。本发明的向日葵植物可用一种或多种目的基因转化。本发明的目的基因依目标结果而不同。例如，表型的多种变化可以是重要的，包括改变植物中的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的昆虫和/或病原体防御机制、等等。可通过提供异源产物的表达或植物中内源产物的增加表达来获得这些结果。备选地，可通过提供一种或多种内源产物特别是植物中的酶或辅因子的表达降低来获得。这些改变导致转化植物的表型改变。在本发明的一项实施方案中，目的基因包括昆虫抗性基因例如，苏云金芽孢杆菌毒素蛋白基因(美国专利号 5，366，892 ;5，747，450 ;5，736，514 ;5，723，756 ;5，593，881 ;和Geiser 等(1986)Gene 48:109)。本发明提供了鉴定个体向日葵中AHASLl基因的等位基因的诊断方法。下面所述的此类诊断方法被发现可用于培育对咪唑啉酮除草剂具有增强抗性的商业化向日葵栽培品种的方法中。下面对本文在这些方法的描述中所使用的下列术语进行定义。“引物”是单链寡核苷酸，具有5’端和3’端，其能够与靶DNA链上的退火位点退火，并且引物充当DNA聚合酶进行的DNA合成的起始点，特别是在聚合酶链式反应(PCR)扩增中。该引物可与靶DNA上其退火位点完全互补或不完全互补。靶DNA链上的“退火”位点是引物在本发明的方法中能够退火的位置。通常对于用PCR进行的基因片段的扩增，使用与双链DNA分子的相反链退火的一对引物。按照标准惯例和本文所用的，除非另有说明或从上下文中显而易见的，“正向引物”与基因的非编码链退火，而“反向引物”与编码链退火。贯穿于整个说明书中，术语“突变型等位基因”、“突变型AHASLl等位基因”或“AHASL1基因”，除非本文另有说明或从上下文中显而易见，这些术 语指的是编码咪唑啉酮耐受性AHASLl蛋白质的多核苷酸，所述蛋白在与野生型AHASLl蛋白质相比较时，包含单个氨基酸置换。此类单个氨基酸置换包括，例如，A122T、A205V、和P197L。通常，该氨基酸置换是由AHASLl编码序列中单个核苷酸置换导致。相反，除非另有说明，术语“野生型等位基因”、“野生型AHASLl等位基因”或“野生型AHASLl基因等位基因”指的是编码AHASLl蛋白质的多核苷酸。本发明涉及多种引物在PCR扩增中的用途。下面对这些引物进行详细描述。“正向AHASLl引物”是能够用于涉及PCR扩增向日葵AHASLl等位基因片段的本发明方法中的引物，其中该片段从产生A122T氨基酸置换的突变位点向5’方向延伸。优选地，“正向AHASLl引物”退火位点的互补序列在如图8所示的(ACC)n重复序列的5’侦U。“反向野生型AHASLl引物”是能够用于下述方法中的反向引物，该方法涉及对不包含产生A122T氨基酸置换的突变的AHASLl等位基因片段的PCR扩增。反向引物的退火位点显示于图8中。反向野生型AHASLl引物的3’末端(或3’端)核苷酸与图8的Hapl_Hap5中SNP位点的G退火。反向野生型AHASLl引物的3’末端核苷酸是C。“反向突变型AHASLl引物”是可用于下述方法中的反向引物，该方法涉及对包含产生A122T氨基酸置换的突变的突变型AHASLl等位基因片段的PCR扩增。反向引物的退火位点在图8中显示。反向突变型AHASLl引物的3’末端(3’端)核苷酸与位于图8中SNP位点的Hap6中的A退火。反向野生型AHASLl引物的3’末端核苷酸是T。本发明提供了用于向日葵AHASLl基因分型的方法。该方法包括从向日葵植物获得基因组DNA并利用其基因组DNA或样品或其部分作为模板进行第一次聚合酶链反应(PCR)扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、正向AHASLl引物和反向野生型AHASLl引物。反向野生型AHASLl引物包含与包含SEQ ID NO :13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火的核酸分子，其中位于所述反向野生型AHASLl引物3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO :13所示核苷酸序列的第I位核苷酸的互补序列。该方法进一步包括利用基因组DNA或其样品或部分作为模板进行第二次PCR扩增，其中包含所述DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述正向AHASLl引物和突变型反向AHASLl引物。反向突变型AHASLl引物包含与包含SEQ ID NO :14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火的核酸分子，其中位于所述反向突变型AHASLl引物3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO : 14所示核苷酸序列的第I位核苷酸的互补序列。该方法进一步包括检测所述第一和第二 PCR扩增的产物。在适合于图8所示的向日葵AHASLl基因的部分进行PCR扩增的条件下，本发明的反向野生型AHASLl和反向突变型AHASLl引物分别与包含SEQ ID N0:13和14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火。反向野生型AHASLl和反向突变型AHASLl引物另外具有由引起A122T氨基酸置换突变的位置上的核苷酸组成的3’端核苷酸。每种反向引物可以但并不需要与其退火位点完全互补，不需要延伸至退火位点的全长。另外，反向野生型和突变型AHASLl引物可在其退火位点之外的5’端包含另外的核苷酸。此类另外的核苷酸可以但不需要与向日葵AHASLl基因的部分完全或甚至部分互补。所述另外的5’核苷酸可包括例如限制酶识别序列。在本发明的一项实施方案中，反向野生型AHASLl和反向野生型AHASLl引物分别包含SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列。进行向日葵AHASLl基因分型的方法包括正向AHASLl引物的使用。与在引起A122T氨基酸置换突变的位点退火的反向野生型AHASLl和反向突变型AHASLl引物不同，正向AHASLl引物核苷酸的退火位点对应于图8所示的(ACC)n区域5’的向日葵AHASLl基因的区域，从而可通过所获得的PCR产物长度(即bp)的不同区别单倍型1-6。A122T突变位点附近的这些单倍型序列显示于图8中。在本发明的一项实施方案中，正向AHASLl引物与包含SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的互补核苷酸的核苷酸序列退火。在本发明优选的实施方案中，正向AHASLl引物包含包含SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的核苷酸分子，并且在甚·至更优选的实施方案中，正向AHASLl引物具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，任选在引物的5’端具有另外的核苷酸。此类另外的核苷酸可以但并不需要与向日葵AHASLl基因的部分完全或甚至部分互补。所述另外的5’核苷酸可包括例如限制酶识别序列。本发明进一步提供了鉴定向日葵植物中AHASLl等位基因的方法。该方法包括从向日葵植物中获得基因组DNA并利用基因组DNA或其样品或部分进行至少一次PCR扩增。PCR扩增包括利用基因组DNA作为模板进行聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO :15所示核苷酸序列的第一正向引物、包含SEQIDNO :16所示核苷酸序列的第一反向引物、包含SEQ ID NO :17所示核苷酸序列的第二正向引物、和包含SEQ ID NO :18所示核苷酸序列的第二反向引物。该方法进一步包括检测PCR扩增的产物。备选地，两次或甚至三次单独的PCR扩增可用于本发明的方法中。当使用两次单独的PCR扩增时，第一次PCR扩增涉及利用基因组DNA作为模板进行第一聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID N0:15所示核苷酸序列的第一正向引物、和包含SEQ ID NO :16所示核苷酸序列的第一反向引物。第二 PCR扩增反应涉及利用基因组DNA作为模板进行第二次聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO :17所示核苷酸序列的第二正向引物、和包含SEQ ID NO :18所示核苷酸序列的第二反向引物。第一 PCR扩增可任选包含包含SEQ IDNO :18所示核苷酸序列的第三引物，而第二 PCR扩增可任选包含包含SEQ ID N0:15所示核苷酸序列的第三引物。向第一和第二 PCR扩增之一或二者添加该任选引物允许对照条带的产生，该条带是通过包含SEQ ID NOS :15和18所示核苷酸序列的引物对所扩增出来的。该方法进一步包括检测第一和第二 PCR扩增的产物。当使用三次单独的PCR扩增时，第一和第二 PCR扩增如上所述。第三PCR扩增包括利用基因组DNA作为模板进行第三聚合酶链反应扩增，其中包含基因组DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、包含SEQ ID NO :15所示核苷酸序列的第一正向引物、和包含SEQ ID NO18所示核苷酸序列的第二反向引物。该方法进一步包括检测第一、第二和第三PCR扩增的产物。在本发明的一个实施方案中，第一正向引物具有基本上由SEQ ID NO :15组成的核苷酸序列，第一反向引物具有基本上由SEQ ID NO :16组成的核苷酸序列，第二正向引物具有基本上由SEQ ID NO :17组成的核苷酸序列，和/或第二反向引物具有基本上由SEQ IDNO 18组成的核苷酸序列。对于本发明，“基本上由”示例序列组成的引物是指由完整的示例序列组成但可在引物的5’端另外包括核苷酸的引物。此类另外的核苷酸可以但并不需要与扩增的靶基因完全或部分互补。因为DNA合成起始于引物的3’端，当与除另外的核苷酸之外的序列相一致的引物相比时，此类另外的核苷酸不会改变DNA合成的起始位点。在本发明优选的实施方案中，第一正向引物具有由SEQ ID N0:15组成的核苷酸序列，第一反向引物具有由SEQ ID NO: 16组成的核苷酸序列，第二正向引物具有由SEQ IDNO :17组成的核苷酸序列，和/或第二反向引物具有由SEQ ID NO : 18组成的核苷酸序列。
除非本文另有说明，“聚合酶”是指DNA聚合酶，特别是适合用于本发明的一种或多种PCR扩增中的DNA聚合酶。在本发明的方法中，PCR扩增的结果可通过例如PCR产物的琼脂糖凝胶电泳、随后通过对凝胶中的DNA进行溴化乙锭染色并在紫外线存在下进行观察来检测。本发明的方法包括使用PCR扩增DNA。可设计寡核苷酸引物用于PCR反应中从而从提取自任何目的生物体的基因组DNA或cDNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物的方法是本领域中公知的并在Sambrook等(1989)Molecular Cloning A LaboratoryManual (第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)中公开，将其引入本文作为参考。另外参见，Innis等，eds. (1990)PCR Protocols A Guideto Methods and Applications(Academic Press, New York) ；Innis 和 Gelfand, eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press, New York) ;Innis 和 Gelfand, eds. (1999)PCRMethods Manual(Academic Press, New York) ；Dietmaier 等.eds. (2002)Rapid CycleReal Time PCR-Methods and Applications, (Springer Verlag, New York) ；Theophilus和 Raphley, eds. (2002)PCR Mutation Detection Protocols(Humana Press, New York)；以及 Bartlett 和 Stirling, eds. (2003) PCR Protocols (Humana Press, New York),将所有这些均引入本文作为参考。其它已知的可用于本发明方法中的PCR方法包括但不限于，利用成对引物、嵌套引物、单个特异性引物、简并引物、基因特异性引物、混合的DNA/RNA引物、载体特异性引物、部分错配的引物等等。本文术语“引物”或“PCR引物”的使用并不是有意将本发明限制为包含DNA的引物。本领域普通技术人员将认可，此类引物可包含例如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、及其组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。尽管本发明并不依赖于特定数量核苷酸的PCR引物，还是应当认识到，与模板DNA上其互补的靶标退火的PCR引物部分通常在大约10至50个连续核苷酸之间，优选10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 个或更多个连续核苷酸。然而，本发明的PCR引物可进一步在其5’端包含并不打算将与靶退火的另外的核苷酸，例如包含一个或多个限制酶识别位点的DNA序列。本发明的方法包括使用DNA聚合酶进行DNA的PCR扩增。任何本领域已知的能够通过PCR扩增靶DNA的DNA聚合酶均可用于本发明的方法中。本发明的方法并不依赖于特定的DNA聚合酶进行DNA的PCR扩增，只要此类聚合酶能够扩增一种或多种植物AHASL基因或其片段。优选地，本发明的DNA聚合酶是热稳定的DNA聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶、Pfu聚合酶、也已被称为Tgo DNA聚合酶的来自Thermococcus gorgonarious的热稳定DNA聚合酶、来自Thermococcus Iitorali的热稳定DNA聚合酶,例如被称为Vent DNA 聚合酶(Perler,F.等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5577)的那些，来自焦球菌属(Pyrococcus) GB-D种的热稳定DNA聚合酶,例如被称为Deep Vent DNA聚合酶的那些(Xu，M.等(1993)Cell 75，1371-1377)，以及其修饰形式和混合物。本发明的方法包括通过PCR扩增靶DNA序列。在本发明的一些实施方案中，靶DNA序列将直接从包含基因组DNA的样品中扩增，所述基因组DNA分离自至少一种植物或其部分、器官、组织、或细胞。本领域普通技术人员将认识到，基因组DNA的量或浓度将取决于很多因素，包括但不限于PCR条件(例如，退火温度、变性温度、循环数目、引物浓度、dNTP浓度等等)、热稳定DNA聚合酶、引物的序列、和靶的序列。通常，在本文所述发明的实施方案中，基因组DNA的浓度是至少约5ng/ μ L至约IOOng/ μ L。
除了 PCR扩增，本发明的方法可包括多种分子生物学技术，包括例如，DNA分离，特别是基因组DNA分离、通过限制酶和核酸酶对DNA或PCR产物的消化、DNA连接、DNA测序、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、用于电泳分离DNA的任何其它合适基质中的凝胶电泳、通过溴化乙锭染色对DNA的检测等等。此类技术是本领域公知的并已公开在例如 Sambrook 等(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual (第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York)中。本发明的方法包括分离自植物的基因组DNA的使用。本发明的方法并不依赖于通过任何特定方法分离的基因组DNA。本领域已知的用于从植物中分离或纯化基因组DNA的任何方法均可用于本发明的方法中，所述基因组DNA可用作上述PCR扩增的模板DNA的来源。参见，例如，Stein 等((2001) Plant Breeding, 12 :354-356) ；Clark, ed. ((1997) PlantMolecular Biology-A Laboratory Manual,Springer-Verlag,New York,pp. 3-15) ；Miller等，((1988)Nucleic Acids Research，16 :1215)，将所有这些均引入本文作为参考。优选地，用于分离植物基因组DNA的此类方法适合、或可由本领域普通技术人员改良后用于从相对大量的植物组织样品分离基因组DNA。在本发明的实施方案中，利用DNeasy 试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA，USA)根据厂家说明书从向日葵植物中分离基因组DNA。在另一实施方案中，利用MagneSil 试剂盒(Promega Corp. , Madison, WI, USA)根据厂家说明书从向日葵植物中分离基因组DNA。对于本发明的方法，基因组DNA可从完整植物或其部分、器官、组织或细胞分离。例如，基因组DNA可分离自幼苗、P十、莖、根、花序、种子、胚、分蘖、胚芽鞘、花药、柱头、培养细胞、等等。另外，本发明并不依赖于从处于任何特定发育阶段的植物或其部分、器官、组织或细胞分离基因组DNA。该方法可使用分离自例如幼苗或成熟植物或其部分、器官、组织或细胞的基因组DNA。另外，本发明并不依赖于在任何特定条件下生长的植物。植物可例如在田间条件下、在温室或生长室中培养，栽培或甚至在温室或生长室中水栽。通常，将植物在有利于植物生长和发育的光、温度、营养和湿度的条件下培养。本发明的方法包括检测PCR扩增的产物。通常，通过首先基于分子量从基质中分离产物、然后检测基质中每种分离的PCR产物来对PCR产物进行检测。在本发明优选的实施方案中，通过PCR产物的琼脂糖凝胶电泳、随后通过凝胶中DNA的溴化乙锭染色并在紫外线存在下通过荧光显示凝胶检测PCR产物。然而，任何适合分离多核苷酸的检测方法均可用于检测本发明的PCR产物，包括但不限于凝胶电泳、高效液相层析、毛细管电泳等等。用于此类方法的基质包括例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、二乙基氨基乙基纤维素、羟基烷基纤维素、琼脂糖、聚氧乙烯等等。本发明的PCR扩增可包括使用一种或多种标记的引物，所述标记例如为放射性标记、或用荧光染料、发光标记、顺磁标记、或任何其它适合检测核酸的标记。当PCR扩增包括一种或多种此类标记的引物时，检测步骤可包括通过任何本领域已知的用于检测该标记的方法对放射性、荧光、发光、顺磁、或其它标记进行检测。本发明还提供了实施对本文所述向日葵AHASLl进行基因分型的方法的试剂盒。此类试剂盒包含如本文所述的本发明的引物，特别是正向AHASLl引物、反向野生型AHASLl引物、和反向突变型AHASLl引物。优选地，正向AHASLl引物包含与图8所示的(ACC)n区域5’的向日葵AHASLl基因区域相对应的核苷酸序列，反向野生型AHASLl引物与包含SEQ IDNO 13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，反义突变型AHASLl引物与包含SEQ ID NO 14 所示核苷酸序列的核苷酸序列退火。更优选地，正向AHASLl引物包含与图8所示的(ACC)n区域5’的向日葵AHASLl基因相对应的核苷酸序列，反向野生型AHASLl引物与包含SEQID NO :13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，反向突变型AHASLl引物与包含SEQ ID NO14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火。更优选地，正向AHASLl引物、反向野生型AHASLl引物、和反向突变型AHASLl引物分别包含具有SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、和SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的核苷酸分子。本发明的试剂盒可任选包含下列的一种或多种聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、和实施该方法的说明书。本发明进一步提供了实施鉴定向日葵植物中AHASLl等位基因的方法的试剂盒。该试剂盒包含如上所述的本发明的引物，特别是第一正向引物、第一反向引物、以及第二正向引物和第二反向引物。第一正向引物包含SEQ ID NO :15所不的核苷酸序列、第一反向引物包含SEQ ID NO :16所示的核苷酸序列、第二正向引物包含SEQ ID N0:17所示的核苷酸序列、第二反向引物包含SEQ ID NO: 18所示的核苷酸序列。试剂盒可任选包含下列一种或多种聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、和实施该方法的说明书。另外，本发明提供了用于包括本文所述PCR扩增的方法的引物。此类引物包含选自SEQ ID NOS :3、4、5、15、16、17和18所示核苷酸序列的核苷酸序列。本文所用的冠词“一个”和“一种”是指一种或多于一种(即至少一种)的该冠词的语法对象。例如，“一种元素”意味着一种或更多种元素。如本文所用，词语“包含”或变型例如“包括”将被理解为将所述成分、整数或步骤、或成分、整数或步骤的组包括在内的意思，但是不排除任何其他成分、整数或步骤，或者成分、整数或步骤的组。以举例说明的方式但不以限制的方式提供下列实施例。实施例I :向日葵AHASLl中的咪唑啉酮抗性突变的表型相互作用GM40和GM1606是向日葵的突变衍生品系，其因AHASLl的密码子122 (拟南芥命名法)上的点突变而显示出对咪唑啉酮的高水平耐受性(W02007005581和2005年7月I日提交的美国临时专利申请序号60/695952)。这证实A122T突变以及对于该突变纯合的衍生品系和杂种显示出比已知的商业上可获得的AHASLl上A205V突变纯合型的Clearfield向日葵对咪草啶酸更好的耐受性(W02007005581)。两种突变体相对野生型均呈现不完全显性，敏感性等位基因，如文献中的许多其它例子一样。本发明是基于下述发现，在O. 5X至6X商业剂量的除草剂应用范围内A122T突变对于针对咪唑啉酮的抗性相对A205V呈现出接近完全显性。本发明提供了杂合型A122T/A205T向日葵植物，其针对增加剂量的咪唑啉酮其显示出与纯合型A122T向日葵植物相同的耐受性水平和反应模式。因此，在Clearfield向日葵的仅一个亲本品系中通过用A122T对A205V的等位基因置换可获得对咪唑啉酮类较高水平的耐受性，这又允许该新的等位基因在向日葵作物中更快地部署。为确定已在MI-R向日葵(HA425)中描述的抗性基因A122T和Imrl基因(A205V)的表型相互作用，在两种除草剂施用比率下(80和320g.a. i.Ha—1的灭烟草)对来自杂交GM40 (A122T) /HA425 (A205V)的FI、F2和BClFl种群进行了评估。当在较低的除草剂比率下评估后代时，在从该杂交获得的F2和BClFl种群中未观察到敏感性植物，这表明GM40和HA425中的抗性基因是相同基因座的等位基因，且二者在IX比率的除草剂施用下对咪唑啉酮类具有相同水平的抗性。当在区分两亲本的更高除草剂比率下(320g.a. i.Ha-1)评估 F2和BClFl种群时，观察到了敏感性的分离。仅能检测到两种表型类别植物无任何损伤或有轻微症状的抗性类别、以及如同对照品系HA425 —样被杀死的敏感性表型。在所筛选的450株F2代植物中观察到的分离比率并未显著区别于3 I的分离比率。为证实这些结果，将Fl代植物与HA425回交并在320g. a. i. ha—1的灭草烟下筛选所获得的BClFl植物。所观察到的分离比率给出了 I : I R : S比率的良好拟合，这证明GM40中的抗性基因显示了对HA425中抗性基因的完全显性，并且这两者为同一基因座AHASLl的等位基因。为进一步确认这些结果，使用了分子标记方法。向日葵中AHASLl基因呈现出单一序列重复(SSR)多态性，这将携带Imrl等位基因的品系从任何其它向日葵表型中区分出来(Kolkman 等(2004) Theor. Appl. Genet. 109 :1147-1159)。利用引物 p_AHAS18 和 p_AHAS19对含有这种SSR的AHASLl基因片段的PCR扩增在GM40和BTK47 (原有的诱变品系)中获得了 321bp的产物，在HA425中获得了 312bp的片段。研究了 GM40和HA425中检测到的长度变体多态性，以便探索来源于两品系杂交的F2和BClFl群体中的分离。随机选择了来自F2种群的80株植物和来自BClFl种群的50株植物，对其取样进行DNA分离，用320g.a. i.ha-1的灭草烟施用比率进行处理，并利用该标记物进行基因分型。在F2种群中，22株植物被除草剂杀死(S)，58株植物无症状或轻微损伤(R)。所观察到的该抗性分离比率与所期望的F2中的完全显性因子分离的抗性分离比率(3R 1S)并无显著差异(P<0.61)。对于AHASLl SSR标记所观察到的分离(19A/A: 39A/B: 22B/B)与F2中共显性标记分离的所期望的分离比率相符合(I 2 1，P<0.87)。对AHASLl SSR基因分型的所有敏感性植物对于HA425单倍型(B/B)均是纯合的，尽管R植物对于GM40单倍型是杂合的(A/B)或纯合的(A/A)(表4，图I)。进一步对50株抗性分离的BClFl后代评估了除草剂抗性表型和AHASLl单倍型的共分离。观察到的抗性分离比率符合I : I的比率(P < O. 78)，如同对BCl中一个基因座的分离所期望的。AHASL1SSR单倍型与除草剂反应的表型完全共分离，23A/B: 27B/B。敏感性后代对于HA425单倍型是纯合的(B/B)，而抗性后代对于HA425和GM40单倍型则是杂合的(A/B)。结果证实GM40中的抗性基因不同于HA425中的抗性基因，两者都是基因座AHASLl的等位基因变体，并且最后，存在于GM40的基因对Imrl等位基因是完全显性的。实施例2 :纯合型A122T/A122T和A205V/A205V以及杂合型A122T/A205V事件在整个植物水平上对于灭草烟的反应进行该实验以在不同的遗传背景下和整个植物水平上定量和对比以纯合(A122T/A122T或A205V/A205V)和杂合(A122T/A205V)状态携带A122T和A205V突变的向日葵杂种的灭草烟敏感性。材料在田间条件下获得不同向日葵品系(表I)的种子。表I.所利用向日葵材料、其家系、和突变事件的类型。
代码家系品系(L)或杂种(H) 突变事件 —
LI___L__A205V_
—L2— LA205V
—Hl "Tlx L2 — HA205V
—L3 ~~cmsGM40 ' LA122T
—L4— LA122T
~H2 ~T3x L4 — HΑ122Τ
~L5BTK 47 —L敏感的
—~T3x L2 — HA205V+A122T
~Η4 I Llx L4 I HA205V+A122T品系LI和L2分别是雄性不育和恢复系育种品系，其以纯合状态携带A205V等位基因。用作开发GM40品系的初始材料的L5、BTK47是保持系。GM40是以纯合状态携带A122T突变的原始品系(ATCC专利保藏号PTA-6716，参见W02007005581)。L4是来源于杂交R701* 3/GM40的BC2F4恢复系，所述杂交是利用标记辅助回交以便选择与各回交世代的回交亲本最相似的植物。R701是具有良好的组合能力的敏感性恢复系。在回交两代后，将与R701最相似的植物自交并筛选对灭草烟有抗性的后代。利用下文所述的A122T突变的分子标记诊断在抗性后代中筛选纯合型A122T植物。CMS GM40是GM40的雄性不育形式，其由来自杂交cmsBTK47/ * 2GM40的BClFl代发育而来，所述杂交利用相同的诊断标记以区分A122T等位基因的纯合型和杂合型植物。方法A122T突变的诊断标记描述了用于在AHASLl中携带A122T突变的向日葵植物进行高通量基因分型的等位基因特异性PCR测定。该测定使人们能够(I)检测携带该突变的个体；(2)确定这些个体的接合性；以及(3)区分携带该突变的抗性植物和含有A205V突变的植物。PCR 引物来自 Kolkman 等((2004)Theor. Appl. Genet. 109 :1147-1159)所提供的那些，用于扩增包括A122T突变和插入-缺失多态性("INDEL")的向日葵AHASLl序列的片段，该片段可用于区分A122T突变的序列和已知突变A205V的序列。这些引物的名称和序列为p-AHAS185' -ttcctcccccgtttcgcattac-3' (SEQ ID NO 1)p-AHAS195' _cgccgccctgttcgtgac_3(SEQ ID NO 2)反应混合物如下IU Taq DNA聚合酶、70ng基因组向日葵DNA、25 μ g BSA、和终浓度 100 μ M 的每种 dNTP,O. 25 μ M 的每种引物、90mMTris_HCl pH8、20mM(NH4)2SO4 和 2. 5mMMgCl20 PCR程序组成如下94°C 2分钟的初始变性步骤、随后是40个循环的94°C 30秒、560C 30秒和72°C 30秒，然后是72°C 10分钟的最后延伸步骤。利用上述引物获得的BTK47 (或GM40)预期片段大小是32Ibp，携带A205V突变的向日葵单倍型的基于GenBank检索号AY541455的预期片段大小是312bp。图4显示，所述PCR反应使得A122T和A205V突变体均基于它们序列之间存在的INDEL多态性而得以区分。将扩增产物进行限制性酶切并在琼脂糖凝胶中分离所获片段。限制性反应由10μ I 扩增产物、BSAlX (ΙΟΟμ g/ml)、NE 缓冲液 31X(100mM NaCl、50mM Tris HClUOmMMgC12、lmM 二硫苏糖醇pH 7,9)和2. 5U BmgBI组成。37°C下孵育该混合物3小时。野生型和A122T植物在限制性反应后的预期片段大小如下野生型将显示183+138bp的片段。GM40(A122T)显示183+76+62bp的片段。杂合型个体将显示183+138+76+62bp的片段。图5显示，利用该方法获得了预期大小的片段并且能够从野生型植物中检测出A122T携带者，另外还可能区分A122T突变的纯合型和杂合 型个体。除草剂处理将种子种植在培养皿中，并在发芽后将小植株移植至直径IOcm的盆中由相等份额的蛭石、土壤和沙组成的盆栽培养基中。将植物种植在温室中自然光条件下，添加400W卤化钠灯以提供16小时日长。昼/夜温度分别为25和20°C。在V2-V4阶段(Schneiter&Miller (1981)Crop Sci. 21 :901-903)，将每种基因型的 10 株植物随机分配至由八种灭草烟剂量(0、40、80、160、240、320、400和480g ai/ha，分别对应于未处理的、
O.51、]^、21、31、41、51和6乂)组成的每项处理、以及零时间生物量测定中。按照随机区组设计来安排实验，进行处理和10个重复的完全因子(向日葵品系X处理)排列。除草剂施用之日，在子叶节处切割每种基因型的10株植物，并在60°C干燥48小时以进行零时间干重测定。在用灭草烟处理后将剩余的植物保持14天，并记录其高度、植物毒性指数(PD和地上部分干生物量。将每株植物的子叶节和顶端之间的距离确定为其高度。通过从每个样品中减去合适的平均零时间生物量将每个品系的地上部分生物量数据转化成了施用后的生物量积累。将干生物量转化成了每个品系内未处理对照的百分比，从而允许各组间直接进行比较。PI是O至9的表型等级，其用于通过目视检查来评价每株植物的植物毒性。将不具有任何症状的植物记录为“0”，将相对于未处理的对照植物增加水平的生长迟缓和萎黄病记录为“ I”至“4”，将增加水平的叶子异常和叶子坏死记录为“5”至“8”，并将具有顶端完全坏死的死亡植物纪录为“9”。高度在较低比率的灭草烟施用下(0.5X)敏感性品系的高度降低85%。在该品系内从IX至6X高度降低为未处理对照植物的大约85%。当以O. 5X或IX的比率施用灭草烟时，向日葵品系和携带纯合状态A205V突变的杂种的高度与未处理对照并无不同。从
2X至6X，这些品系显示出高度上的显著降低，其达到未处理对照的69. 6% +/-3. 9(表2和图I)。相比，携带纯合状态A122T突变的向日葵品系显示出减少的高度降低(对于0.5x和6X比率的灭草烟分别为未处理对照的0.1%至18.8%)。两组品系对于除草剂比率从2X增加至6X的反应显示出彼此之间的显著差异(表2和图I)。对于O. 5X至6X比率的除草剂施用，具有AHASLl (杂合型A122T/A205V)处两种突变型等位基因的材料显示出未处理对照的O. 6%至38. 2%+/-2. 7的高度降低。杂合材料的高度降低与纯合型A122T/A122T所观察到的降低并无不同，但低于纯合型A205V/A205V所记录的高度降低(图I)。事实上，杂合材料的平均高度降低在施用任何剂量的除草剂时均未与纯合型A122T/A122T植物中所观察到的有所不同，但在施用2X至6X比率的除草剂时与纯合型A205V/A205V植物所观察到的具有统计学差异(表2)。植物毒性指数纯合状态的两种突变体在对除草剂比率从O. 5X增加至6X的反应方面显示出显著差异(图2)。携带纯合状态的A122T突变的向日葵品系随除草剂比率增加显示出比对照植物叶子大小的稍微减小和更浅的绿色(表3)。相反，携带A205V突变的植物在O. 5X或IX的除草剂比率下并未显示出任何损伤，但从2X至6X其损伤水平(萎黄病、叶变形和叶坏死)快速增加(表3)。从2X至6X，纯合状态的两种突变 体在植物毒性指数上彼此之间显著不同(表3)。杂合型A122T/A205V材料显示出与纯合型A122T/A122T材料相同模式的反应。事实上，在任何除草剂施用比率下它们仅显示出比对照植物更浅的绿色，在5X和6X比率下显示出比对照植物更小的叶子大小，其在较高的剂量下测定PI仅为1(图2)。地上部分干重生物量突变体A122T和A205V的干重的剂量反应曲线显示于图3中。在4X、5X和6X比率下，纯合状态的事件A122T的生物量重量相对于对照植物有所降低，而这种降低在更高剂量时达到25%。同时，从O. 5X (40g ai/ha)至6X，事件A205V的干重相对于对照植物有所降低。从0.5X至6X，相对于此变量两种突变体显示出显著的不同(表4)。杂合型A122T/A205V材料显示出与纯合型A122T材料完全相同的趋势(图3，表4)。对于O. 5 X至6X的除草剂施用比率，它们显示出生物量降低O. 3%至33%，这与任何比率下纯合型A122T个体所记载的并无差异。然而，从3X至6X的除草剂施用比率下，杂合材料相对纯合型A205V个体在干物质积累方面显示出显著差异(表4)。结论对于增加的灭草烟施用比率，携带AHASLl基因座上的两种突变体等位基因的杂合型材料显示出与纯合型A122T材料相同水平的耐受性和植物高度的反应模式、植物毒性指数以及干物质积累，该耐受性水平比纯合型A205V材料所表达出的水平更好。表2.对于携带A205V突变事件的三种向日葵基因型、携带A122T突变事件的三种基因型、携带A205V/A122T突变事件的两种基因型和一种敏感性品系，处理后14天不同剂
量的灭草烟对植物高度的影响。
权利要求
1.用于向日葵AHASLl基因分型的方法，所述方法包括步骤 (a)从向日葵植物中获得基因组DNA； (b)利用所述DNA作为模板进行第一次聚合酶链反应(PCR)扩增，其包含所述DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、正向AHASLl引物和反向野生型AHASLl引物，其中所述反向野生型AHASLl引物与包含SEQ ID NO :13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，其中位于所述反向野生型AHASLl引物3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO 13所示核苷酸序列的第I位核苷酸的互补核苷酸； (c)利用所述DNA作为模板进行第二PCR扩增，其包含所述DNA、聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述正向AHASLl引物和突变型反向AHASLl引物，其中所述反向突变型AHASLl引物与包含SEQ ID NO :14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，其中位于所述反向突变型AHASLl引物3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO : 14所示核苷酸序列的第I位核苷酸的互补核苷酸；以及 (d)检测所述第一和所述第二PCR扩增的产物； 其中所述正向AHASLl引物包含对应于(ACC)n区域5’的向日葵AHASLl基因区域的核苷酸序列。
2.权利要求I的方法，其中所述反向野生型AHASLl引物包含SEQID NO :4所示的核苷酸序列。
3.权利要求I的方法，其中所述反向突变型AHASLl引物包含SEQID NO :5所示的核苷酸序列。
4.权利要求I的方法，其中所述正向AHASLl引物与包含SEQID N0:12所示核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列退火。
5.权利要求I的方法，其中所述正向AHASL引物包含SEQID NO :3所示的核苷酸序列。
6.用于向日葵AHASLl基因分型的试剂盒，所述试剂盒包含 (a)正向AHASLl引物，该引物包含对应于(ACC)n区域5’的向日葵AHASLl基因区域的核苷酸序列。
(b)反向野生型AHASLl引物，其中所述反向野生型AHASLl弓丨物与包含SEQID NO 13所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，其中位于所述反向野生型AHASLl引物的3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO 13所示核苷酸序列的第I位核苷酸的互补核苷酸，以及 (c)反向突变型AHASLl引物，其中所述反向突变型AHASLl引物与包含SEQID NO 14所示核苷酸序列的核苷酸序列退火，其中位于所述反向突变型AHASLl引物的3’端核苷酸的核苷酸是SEQ ID NO :14所示核苷酸序列的第I位核苷酸的互补核苷酸。
7.权利要求6的试剂盒，其进一步包含能够催化向日葵AHASL基因的第一片段和向日葵AHASL基因的第二片段的PCR扩增的聚合酶，其中第一片段位于向日葵AHASLl基因中所述正向AHASLl引物的所述退火位点和所述反向野生型AHASLl引物的所述退火位点之间，第二片段位于向日葵AHASLl基因中所述正向AHASLl引物的所述退火位点和所述反向突变型AHASLl引物的所述退火位点之间。
8.权利要求6的试剂盒，其中所述正向AHASLl引物与包含SEQID N0:12所示核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列退火。
9.权利要求6的试剂盒，其中所述正向AHASL引物包含SEQID NO :3所示的核苷酸序列。
10.权利要求6的试剂盒，其中所述反向野生型AHASLl引物包含SEQID N0:4所示的核苷酸序列。
11.权利要求6的试剂盒，其中所述反向突变型AHASLl引物包含SEQID NO :5所示的核苷酸序列。
12.分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17中所示的核苷酸序列。
全文摘要
描述了包含向日葵乙酰羟酸合酶大亚基1(AHASL1)基因的两种不同除草剂抗性等位基因的除草剂抗性向日葵植物。公开了用于制备这些向日葵植物的方法和用于控制这些向日葵植物附近生长的杂草或其它不需要的植物的方法。此类方法包括使用乙酰羟酸合酶抑制性除草剂。还描述了控制生长于向日葵植物上的寄生杂草的方法。另外还提供了测定向日葵植物AHASL1基因的基因型的方法。
文档编号C12Q1/68GK102808017SQ20121009961
公开日2012年12月5日 申请日期2008年4月2日 优先权日2007年4月4日
发明者C·萨拉, M·布洛斯, M·埃查尔特, B·K·辛格, B·J·韦斯顿, S·R·惠特 申请人:巴斯夫农业化学品有限公司, 奈德拉股份有限公司