专利名称：一种检测水貂源性成分的扩增引物的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及特种经济动物水貂源性成分的检测，尤其涉及水貂基因检测方法的特异性引物和试剂盒。
背景技术：
水貂在动物分类学中属于哺乳纲、食肉目、鼬科、鼬属(Mustela)，在野生状态下有美洲水紹(Mestela vision)和欧洲水紹(Mustela Iutreola) 2种，目前世界各国人工饲养用于获取皮毛的水貂均为美洲水貂的后裔(王继远，1990)。我国开展毛皮动物相关饲养技术研究始于上世纪50年代，特种经济动物以其独特的资源特性、重要的经济价值和日益增长的市场需求而成为我国农业的新兴特色产业。我国是特种经济动物饲养大国，仅毛皮动物存栏就达3. 28亿只。水貂皮、狐皮和波斯羔皮早已成为国际裘皮贸易的三大支柱产品。目前，食品安全问题引起了各国政府和消费者的高度关注，尤其是肉食品、动物饲料安全性等关系人民健康、百姓切身利益的问题得到了广泛重视。疯牛病、禽流感、狂犬病、犬瘟热等在世界各地的蔓延和传染给人类的事也有发生，目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的エ业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。检验检疫部门对检测高新技术进步的需求日益強烈，在饲料贸易、进出口防疫检查、肉制品消费市场监瞀等方面表现尤为突出。貂肉作为养殖业的附属品，常被不法商贩用作饲料及肉制品，甚至未经过检验检疫程序，一旦携帯致病因子，极大地危害了消费者的健康，扰乱了畜产品及肉制品市场秩序。同时，裘皮制品消费市场属于高端消费项目，在利益驱动，裘皮制品市场以次充好、以假乱真的现象时有发生，有的仿制裘皮产品，用肉眼或者普通方法很难鉴定真伪，由此谋取暴利。水貂作为特种经济动物的ー种，貂皮是生产各类高档裘皮制品的原材料，貂心可以入药，对于治疗风湿性心脏病有一定的功效，目前已经有产品如利心丸等市场销售，此外貂肉一般用作动物饲料，近年来也有加工成食品使用。针对市场上存在以下几种现象，有必要开发ー种水貂源性成分鉴定的快速、有效方法。随着裘皮加工手段及毛皮硝染技术的进步，依据感官目測已经很难辨别毛皮真伪，利益驱动下，以人造皮毛、其他廉价的动物皮毛冒充水貂皮毛的现象时有发生；此外，貂心入药时候，也有不法商家以鸡心、兔心等冒充貂心的现象；近年来，羊肉卷市场比较混乱，很多压制的羊肉卷中掺杂着貂肉、狐狸肉、貉子肉以及其他肉类，从感官上难以去分辨，因此，本研究着重从鉴定水貂源性成分的角度出发，开发研制出ー种分子水平上的检测试剂盒，具有灵敏度高、特异性好、易操作等优点。研究出一种准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分，包括鉴定特种经济动物水貂源性成分的方法，就非常有必要。目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨大的开发潜力和广阔的应用前景。日前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA，RNA、线粒体DNA(mtDNA)、和蛋白质分、子标记等。PCR分子标记鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求较低，比如无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，或者经过一定压力、温度加工后，只要能够提取基因组核酸，就都可以用于PCR反应。哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组(哺乳动物约1000-2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具 有灵敏度高、精确度好、快速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的前景。国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、驴、马、鹿属、狮、虎、豹等源性成分鉴定进行了研究报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上，对水貂源性成分鉴别检测的研究很少，张丽华等人利用酶切的方法研究了貂心线粒体mtDNA鉴定及特征分析，采用DNA限制性内切酶片段长度多态性(mtDNA-RFLP)分析技术和聚合酶链反应(PCR)扩增细胞色素b基因部分序列片段。结果表明新鲜的貂心组织可提取完整的mtDNA，并能扩增出310bp大小的Cytb基因，与鸡心脏mtDNA限制性内切酶酶切图谱有差异。RFLP方法有其优点但是要选取价格低廉有效适合的酶。涂剑锋等人从当动物种属分类的角度研究了水貂12SrRNA基因序列測定及鼬属动物的系统进化关系。张洪海等人对鼬科动物线粒体DNA控制区结构分析，并未进一歩做源性成分的检测。由干物种特异性PCR方法的简单性、物种特异性和高度灵敏性，该方法的使用极大地改善和方便了食物、饲料和中药材中动物源性成分的检测。与其他分子生物学技术如序列分析、PCR-RFLP或RAPD(RandomAmplified Polymorphic DNA)相比，物种特异性PCR更加便宜、更加快速、更加适合于大多数样品的常规检測。基于上述优点，近几年来研究人员越来越倾向于使用该技术。
发明内容
本发明提供一种检测水貂源性成分的扩增引物。本发明采取的方案是检测水貂源性成分的扩增引物核苷酸序列为正向引物5'-CTTCAACCTCAACATCATCACC-3'；反向引物5'-GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3'。本发明扩增引物与水貂基因组进行PCR扩增反应时，其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No. I 所述。本发明所述的检测水貂源性成分的扩增引物用于制备试剂盒。本发明采用扩增引物对水貂DNA样品进行PCR扩增，并检测扩增产物。本发明检测水貂源性成分的方法，具有扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所述的样品为水貂样品。本发明检测水貂源性成分的方法，其PCR反应程序为预变性94°C，3min ;进入循环94°C变性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min ;4°C保存
反应产物。
本发明的优点是具有物种特异性PCR方法的简单性、物种特异性和高度灵敏性，该方法的使用极大地改善和方便了食物、饲料和中药材中动物源性成分的检测。与其他分子生物学技术如序列分析、PCR-RFLP 或 RAPD (RandomAmplified Polymorphic DNA)相比，本发明更加便宜、更加快速、更加适合于大多数样品的常规检測。
图I是基因组DNA的电泳检测结果图；图中M marker, I :水貂2 :蓝狐3 :银狐4 :貉子5 :猪6 :鸡7 :狗8 :羊；图2是6对引物分别与水貂基因组PCR扩增结果图；图中M marker, 1-6 marker I -mar ker 6分别与水紹基因组进行PCR反应，电泳检测结果；图3是特异性引物针对水貂等基因组PCR扩增产物电泳图；图中M marker, I :水貂2 :蓝狐3 :银狐4 :貉子5 :猪6 :鸡7 :狗8 :羊图4是灵敏度检验试验电泳图；图中M marker, I :水貂基因组原浓度；2_6 :浓度依次稀释50 %，10 %，I %，0. 5%,0. 1%。
具体实施例方式实施例I水貂源性成分DNA的PCR检测试剂盒及检测方法的建立一、水貂源性DNA的PCR检测弓丨物的设计从GenBank检索到食肉目鼬科动物线粒体序列相关信息39条，包含鼬属、貂属、水獭属等，本研究參考GenBank中公布的紫貂、貂熊、日本貂、蓝狐、银狐、貉等动物线粒体基因组序列，将序列进行blast序列比对，根据紫貂的物种保守序列、分析特异性位点，利用引物设计软件primer5. 0设计出鉴别检测水貂源性成分的PCR特异性引物即只能扩增出水貂DNA特异性片段，扩增不出其它动物DNA限制性片段。I、实验前期，基于上述原则，设计了六对引物，分别命名minkOl至mink06,并且将设计引物与GenBank中羊、猪、鸡线粒体序列进行比对，初歩判断所设计引物是只针对貂具有特异性，引物委托上海英俊公司代理合成。F(Forward):代表正向引物，R(Reverse):代表反向引物。引物名称引物序列
MinkOlFCTCCGAGTGATACAAGCGC
MinkOlR_CGTACTGGGAGAAGTTGCTG _
mink02F_TTAACTCCTGAACCCGCC _
mink02R_TGATAGTTGTAATAA AGTTGATGGC _
mink03F_GTGCCTCAATACTATAAATTCATTG_2、引物合成后进行了一系列引物特异性验证扩增试验，摸索适宜扩增温度和反应体系条件，最終确定特异性最好的一条引物，作为试验用水貂源性检验的引物。水貂血液样本基因组提取，采用blood Genome DNA Pxtraction Kit试剂盒进行基因组DNA的提取,购自宝生物工程(大连)有限公司，货号D9081。将6对引物分别与水貂基因组进行PCR扩增反应，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，见图2。实验结果表明，第5对引物有较强的特异性，可以作为水貂源性成份检测的特异性引物。引物序列如下正向引物MinkF (22bp)5' -CTTCAACCTCAACATCATCACC-3';反向引物 MinkR(25bp) :5' -GACATACATTGTATTCAT
TCTAAGCG-3';将PCR扩增产物送至上海生エ生物工程有限公司进行序列测定，扩增序列长度为343bp，序列结果如SEQ ID No. I所述。将该序列与Genbank下载序列进行blast比对，对应序列相似度达99%，进ー步说明该扩增片段是水貂源性特异性序列。ニ、水貂源性DNA的PCR检测试剂盒的构建在获得的上述特异性引物对的基础上，设计用于水貂DNA的PCR检测的试剂盒，试剂盒包括检测溶液，该检测溶液中含IOXPCR缓冲液、IOu mol/L正向引物10umol/L反向引物IOu mol/L dNTP :5U/uLTaqDNA聚合酶；其中，所述的正向引物序列为MinkF(22bp) :5' -CTTCAACCTCAACATCATCACC-3';反向引物 MinkR(25bp) :5' -GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3'；三、水貂源性DNA的PCR检测方法的建立I、DNA样品的制备本实施例的DNA样品制备方法參考《DNA及RNA基本实验技术》(科学出版社，A.J.哈伍德主编，盛小禹等译)，具体为(I)样品制备肌肉样品称取约IOOg水貂的肌肉组织切碎，于120°C烘烤过夜，用组织研磨器研磨成粉末状。血液样品血液样品加入2%こニ胺四こ酸ニ钠(EDTA)抗凝，冷冻保存。饲料粉末样品可直接用于DNA的提取。
⑵DNA提取血液类试验样品，采用blood Genome DNA Pxtraction Kit试剂盒进行基因组DNA的提取，购自宝生物上程(大连)有限公司，货号D9081。其它组织类和骨粉类样品采用动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒进行提取，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP323-03。基因组DNA电泳检验见图I :1 :水貂2 :蓝狐3 :银狐4 :貉子5 :猪6 鸡7 :狗8:羊2、PCR 反应(I)反应体系取2ul待测样品DNA溶液，加入用于水貂DNA的普通PCR检测的试剂盒中的溶液6. 2ul，再加入灭菌超纯水至总体积25uL ;将以上各组分加入至0. 2mL PCR反应管中，5000r/min，离心IOs ;然后按下列条件參数进行PCR扩增。(2)反应条件预变性94°C，3min;进入循环94°C变性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min;4°C保存反应产物。3、结果判断扩增产物电泳结果见(图2),以D2000bp marker对比,在400多bp的位置大小处出现特异性扩增条带为阳性，没有特异性扩增条带为阴性。原理(I)模板DNA的变性模板DNA经加热至94°C 5min后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下ー轮反应做准备；(2)模板DNA与引物的复性模板DNA经加热变性成单链后，温度降至57°C，引物模板DNA单链的互补序列配对结合；(3)引物的延伸DNA模板ー引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性ー复性一延伸三个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下一次循环的模板。4、扩增水貂DNA产物测序序列将水貂PCR扩增产物进行纯化后送上海生エ生物工程有限公司进行测序。PCR特异性扩增产物的测序结果如下，测序结果经与GenBank比对分析表明，该序列片段与已发表的紫紹mt-DNA的D-Ioop环区段同源性达到99%。水貂PCR产物测序序列结果如SEQ ID No. I所述。实施例2水貂DNA的PCR检测方法对肉类和血液样品中貂源性成分DNA的特异性检测实验针对市场中会出现的以水貂肉类冒充羊肉卷的现象，本试验从特异性弓I物扩增片 段的角度检测水貂源性成分，以期能够为检测羊肉卷中是否掺杂了水貂肉提供一种检测手段，为质检部门提供ー种分子检测手段。市场中购买了羊肉、牛肉、鸡肉并提取了基因组备用。肌肉组织提取DNA采用前面提到的试剂盒完成。采用实施例I的含有特异性引物的检测试剂盒及检测方法检测水貂DNA样品。同时检测蓝狐、貉等其它毛皮动物DNA样品，以此方法的特异性进行评估。试验结果表明本发明所设计引物只对水貂DNA的特异性扩增引物，对于试验中涉及的羊、牛、蓝狐、貉子、鸡等源性成分基因组DNA没有特异性扩增条帯，能够达到检测水貂源性成分的效果。实施例3水貂源性成分的PCR检测方法对毛皮中DNA的特异性实验裘皮制品是高档消费品，在利益驱使下，不乏有人以次充好甚至使用假冒人造毛皮冒充水貂毛皮，或者以兔皮、狗皮等充当水貂皮，经过一系列加工普通肉眼很难辨认清 楚，唯有通过进一歩的实验手段能够有效鉴别区分。本实验设计如下，选取几种动物毛皮，采用毛皮中提取基因组DNA的方法提取DNA，分别获取了貂皮、狐狸皮、貉子皮、狗皮以及兔皮基因组DNA，采用实施例I中的试剂盒和方法进行特异性条带检验，实验结果表明上述结果可证明弓I物仅对水貂特异。实施例4水貂DNA的PCR检测方法灵敏度实验将制备的水貂基因组DNA进行梯度稀释，分别稀释至100%，50%，10%，1 %，
0.5%,0. I %，按照实施例I中的试剂盒和方法对该稀释的溶液DNA用于进行检测灵敏度分祈。按照实施例I提供的PCR扩增条件进行试验，结果如图4所示。实验结果表明，分析检出限为5ng。
权利要求
1.一种检测水貂源性成分的扩增引物，其特征在于，其核苷酸序列为 正向引物5' -CTTCAACCTCAACATCATCACC-3'； 反向引物5' -GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3'。
2.如权利要求I所述的检测水貂源性成分的扩增引物，其特征在于，与水貂基因组进行PCR扩增反应时，其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所述。
3.含有权利要求I所述的检测水貂源性成分的扩增引物的试剂盒。
4.一种检测水貂源性成分的方法，其采用权利要求I所述的扩增引物对水貂DNA样品进行PCR扩增，并检测扩增产物。
5.如权利要求4所述的检测水貂源性成分的方法，其特征在干，具有扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所述的样品为水貂样品。
6.如权利要求4或5所述的检测水貂源性成分的方法，其特征在于PCR反应程序为预变性94°C，3min ;进入循环94°C变性60s，66°C退火60s，72°C延伸60s，35次循环；终止延伸72°C，7min ;4°C保存反应产物。
全文摘要
本发明涉及一种检测水貂源性成分的扩增引物，属于特种经济动物水貂源性成分的检测。其核苷酸序列为正向引物5′-CTTCAACCTCAACATCATCACC-3′；反向引物5′-GACATACATTGTATTCATTCTAAGCG-3′。具有物种特异性PCR方法的简单性、物种特异性和高度灵敏性，该方法的使用极大地改善和方便了食物、饲料和中药材中动物源性成分的检测。与其他分子生物学技术相比，本发明更加便宜、更加快速、更加适合于大多数样品的常规检测。
文档编号C12Q1/68GK102643912SQ20121010545
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者刘晗璐, 孙伟丽, 张海华, 李光玉, 王夕国, 蒋清奎, 赵家平 申请人:中国农业科学院特产研究所